湯亞飛, 何自福*, 佘小漫, 藍國兵

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 廣州 510640; 2. 廣東省植物保護新技術(shù)重點實驗室, 廣州 510640)

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實驗方法與技術(shù)

辣椒黃脈病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立

湯亞飛1,2, 何自福1,2*, 佘小漫1, 藍國兵1

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 廣州 510640; 2. 廣東省植物保護新技術(shù)重點實驗室, 廣州 510640)

辣椒黃脈病毒(Pepperveinyellowsvirus,PeVYV)是影響世界辣椒生產(chǎn)的重要病毒,也是廣東省辣椒上主要病原病毒之一。本研究根據(jù)PeVYV基因組P3蛋白基因序列設(shè)計了2對引物,建立了該病毒的反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(reverse transcription loop mediated isothermal amplification,RT-LAMP)檢測方法。該方法70 min便可完成對PeVYV的檢測,無需特殊的設(shè)備,靈敏度比普通RT-PCR高10倍,對田間疑似病樣的檢出結(jié)果與RT-PCR的結(jié)果一致。本研究建立的PeVYV RT-LAMP檢測方法具有快速、靈敏和操作簡便等優(yōu)點,適合于對PeVYV病樣快速、準確檢測與鑒定。

辣椒黃脈病毒; RT-LAMP; 快速檢測

辣椒黃脈病毒(Pepperveinyellowsvirus,PeVYV)屬黃癥病毒科(Luteoviridae)馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)成員,由蚜蟲以持久方式傳播,也可以嫁接傳播[1]。該病毒在日本[1-2]、西班牙[3]、突尼斯、土耳其[4]、印度、印度尼西亞、菲律賓、泰國[5]、蘇丹[6]和美國[7]等國家均有分布。我國的臺灣[5]、湖南[8]和山東[9]等省也先后報道了該病毒。辣椒感染黃脈病毒后主要表現(xiàn)為葉脈黃化、葉片卷曲、節(jié)間縮短等,其產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴重影響。

建立快速、靈敏和特異的檢測鑒定方法是植物病毒病診斷、防治和預(yù)測預(yù)報的前提與基礎(chǔ)。目前,PeVYV的檢測主要采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)[6,9]。相對于血清學(xué)檢測方法,該方法較快速(6 h左右)、靈敏和特異,但需要高精度的PCR儀及較復(fù)雜的方法來檢測擴增產(chǎn)物,使其在日常診斷中受到限制。日本學(xué)者Notomi等開發(fā)了一種新型的核酸擴增方法——環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)[10]。該技術(shù)采用4條特異引物識別靶序列上6個特異區(qū)域,利用DNA 鏈置換聚合酶(BstDNA polymerase)在恒溫條件下對靶基因擴增。RT-LAMP 方法是在LAMP 方法的基礎(chǔ)上添加了反轉(zhuǎn)錄酶(AMV),使反轉(zhuǎn)錄和擴增在同一溫度下進行。相對RT-PCR來說,該技術(shù)更加簡便、快速(70 min左右)、特異。該技術(shù)已被應(yīng)用于番茄[11-12]、柑橘[13-14]、香蕉[15]、水稻[16-17]、小麥[18]、馬鈴薯[19-21]、草莓[22]、蘭花[23]等多種作物的病毒病檢測。本文以PeVYV的P3蛋白基因序列為靶標基因,設(shè)計了4 條特異性引物,建立了該病毒的RT-LAMP快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

感染PeVYV的辣椒病樣:采自廣東茂名市辣椒產(chǎn)區(qū),經(jīng)RT-PCR檢測驗證,置于-80℃保存;健康辣椒材料:本實驗室在防蟲溫室中培育的健康辣椒葉片;待檢材料:采自廣東省各辣椒產(chǎn)區(qū)疑似辣椒病葉。

Loopamp RNA 擴增反應(yīng)試劑盒、Loopamp FD 熒光檢測試劑購自日本Eiken Chemical 公司；RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；一步法RT-PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；LA-320C 實時濁度儀由日本Eiken Chemical 公司提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

依據(jù)GenBank中已登錄的PeVYV基因組(GenBank序列登錄號:AB594828.1、KP326573.1)的P3蛋白基因序列,應(yīng)用LAMP 引物設(shè)計軟件Primer Explorer V.4 (http:∥primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計外側(cè)引物對F3和B3以及內(nèi)側(cè)引物對FIP和BIP,將引物在NCBI數(shù)據(jù)庫中Primer-BLAST模塊下進行比對驗證,最終選出用于RT-LAMP的引物組合(表1)。應(yīng)用PCR引物設(shè)計網(wǎng)站(http:∥primer3.ut.ee/),設(shè)計目的片段為562 bp的特異引物對P-F/P-R(表1)用于PeVYV的RT-PCR檢測。所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 總RNA的提取

取辣椒病葉100 mg,應(yīng)用RNA提取試劑盒抽提其總 RNA,根據(jù)試劑盒說明書的步驟進行操作,最終RNA沉淀溶解于40 μL DEPC處理的ddH2O中。

1.2.3 RT-LAMP反應(yīng)體系及最佳反應(yīng)溫度

按照Loopamp RNA 擴增試劑盒的說明配制RT-LAMP反應(yīng)體系,即:2×反應(yīng)緩沖液12.5 μL,酶溶液1.0 μL,40 pmol/μL引物FIP 1.0 μL,40 pmol/μL引物BIP 1.0 μL,10 pmol/μL引物F3 0.5 μL,10 pmol/μL引物B3 0.5 μL,熒光目視檢測試劑1.0 μL,RNA模板1.0 μL,去離子水6.5 μL,反應(yīng)總體系為25 μL。反應(yīng)溫度分別設(shè)為59℃、61℃、63℃ 和65℃,反應(yīng)時間為60 min,之后加熱至80℃ 5 min使酶失活。擴增反應(yīng)在實時濁度儀上進行,根據(jù)60 min 內(nèi)出現(xiàn)擴增曲線的最短時間確定最佳反應(yīng)溫度。反應(yīng)結(jié)束后,根據(jù)反應(yīng)液顏色進行判斷,若顯綠色,則為陽性反應(yīng);若顯橙色,則判斷為陰性反應(yīng)。進一步通過電泳加以驗證,取2 μL擴增產(chǎn)物,在質(zhì)量分數(shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠上100～125 V恒壓電泳30 min,然后在紫外檢測儀下觀察。

表1 RT-LAMP 和RT-PCR檢測PeVYV 的引物

1.2.4 RT-PCR

RT-PCR反應(yīng)參照一步法RT-PCR試劑盒說明操作,即:PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2.0 μL,2×1 Step Buffer(Dye Plus)25.0 μL,10 μmol/L 引物P-F 2.0 μL,10 μmol/L 引物P-R 2.0 μL,RNA模板1.0 μL,去離子水18 μL,總體系為50 μL。反應(yīng)條件為:50℃反轉(zhuǎn)錄30 min;94℃預(yù)變性4 min,94℃變性30 min、52℃退火30 s、72℃延伸1 min,35個循環(huán),72℃最終延伸10 min,取 8 μL擴增產(chǎn)物在質(zhì)量分數(shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠上100～125 V恒壓電泳30 min,在紫外檢測儀下觀察并記錄結(jié)果。

1.2.5 靈敏度試驗

將所提取的辣椒病葉片組織的總RNA按10-1～10-8進行濃度梯度稀釋,以不同濃度的RNA作模板,分別進行RT-LAMP和普通RT-PCR檢測,比較兩者的檢測靈敏度。

1.2.6 PeVYV田間疑似病樣RT-LAMP檢測

從廣東省各辣椒產(chǎn)區(qū)采集疑似感染PeVYV的辣椒病樣6份,提取總RNA,分別用1.2.3的RT-LAMP方法檢測,并用RT-PCR 方法加以驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-LAMP最佳反應(yīng)溫度

以感染PeVYV辣椒病葉組織的總RNA為模板,進行RT-LAMP反應(yīng),實時濁度儀輸出的擴增時間曲線(圖1)表明:在59、61、63 和65℃的反應(yīng)溫度下,RT-LAMP反應(yīng)分別在約42、34、29 和27 min 時擴增曲線開始上升。反應(yīng)結(jié)束后,肉眼觀察到各溫度處理反應(yīng)液均呈綠色,而空白對照呈橙色(圖2)。根據(jù)現(xiàn)場檢測時間盡可能短的要求,確定65℃為最佳反應(yīng)溫度。

圖1 RT-LAMP各反應(yīng)溫度下的擴增曲線Fig.1 Amplification curve of RT-LAMP assay at different temperatures

圖2 RT-LAMP各溫度處理的反應(yīng)液顏色變化Fig.2 Color change of RT-LAMP products at different temperatures

2.2 靈敏度檢測結(jié)果

將感染PeVYV的辣椒病葉片組織總RNA進行10倍系列稀釋作為模板,分別進行RT-LAMP反應(yīng)和RT-PCR反應(yīng)。應(yīng)用RT-LAMP方法,在模板稀釋倍數(shù)為10-4時,反應(yīng)液呈明顯綠色(陽性反應(yīng)),電泳時擴增的目的條帶清晰;當模板稀釋倍數(shù)為10-5時,反應(yīng)液也呈現(xiàn)綠色,電泳時仍可見擴增的條帶;但模板稀釋倍數(shù)為10-6時,反應(yīng)液呈現(xiàn)橙色,電泳無目的條帶(陰性反應(yīng))(圖3～4)。應(yīng)用RT-PCR方法,在模板稀釋倍數(shù)為10-4時,電泳時擴增的目的條帶已經(jīng)非常弱;當模板稀釋倍數(shù)為10-5時,RT-PCR已不能擴增出目的條帶(圖5)。因此,檢測PeVYV,RT-LAMP方法比RT-PCR方法靈敏度高10倍。

2.3 疑似病樣的RT-LAMP檢測結(jié)果

對來自廣東省不同辣椒產(chǎn)區(qū)的6份疑似感染PeVYV病樣,采用RT-LAMP方法進行檢測,結(jié)果顯示(圖6),疑似病樣1號、2號、3號、5號為陽性,4號和6號為陰性。進一步應(yīng)用RT-PCR加以驗證,其檢測結(jié)果(圖7)與RT-LAMP結(jié)果一致,兩者的符合率為100%。這表明所建立的PeVYV RT-LAMP 檢測方法能夠?qū)崿F(xiàn)田間病樣的快速、準確檢測與診斷。

3 討論

本研究建立的PeVYV RT-LAMP 檢測方法快速、簡便、靈敏和特異。應(yīng)用該方法可在70 min內(nèi)完成對PeVYV的檢測,而常規(guī)的RT-PCR檢測則需要6 h左右,大幅度縮短了檢測時間。整個擴增過程可在恒溫水浴鍋或烘箱中進行,反應(yīng)結(jié)果可以通過肉眼直接觀察擴增反應(yīng)產(chǎn)物的顏色變化進行判定,檢測方法簡便,克服了RT-PCR檢測方法在實際應(yīng)用中的局限與不足。在靈敏度方面,RT-LAMP的檢測靈敏度比RT-PCR高10倍。另外,由于RT-LAMP所利用的引物需要識別靶序列上6個特異性區(qū)域,而常規(guī)的RT-PCR方法引物只識別靶序列上2個特異性區(qū)域,因此RT-LAMP具有更高的特異性。

圖4 RT-LAMP靈敏度試驗電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis result of sensitivity assay of RT-LAMP detection

圖5 RT-PCR靈敏度試驗電泳結(jié)果Fig.5 Electrophoresis result of sensitivity assay of RT-PCR detection

圖6 田間辣椒病樣的RT-LAMP檢測結(jié)果Fig.6 Detection results of pepper samples from fields by RT-LAMP

由于RT-LAMP技術(shù)靈敏度高、產(chǎn)物擴增量大,微量的污染(如空氣中的陽性氣溶膠微粒)都有可能導(dǎo)致假陽性,因此操作過程中一定要保證試驗環(huán)境、器具以及試劑等免受RNA或擴增產(chǎn)物的污染,檢測的各個環(huán)節(jié)要嚴格分區(qū)進行;同時操作過程盡量減少開蓋操作次數(shù)等。本研究所建立的PeVYV RT-LAMP 檢測方法將所有的反應(yīng)成分及熒光目視檢測試劑一次性加入到反應(yīng)管中進行反應(yīng),中間不再開蓋,待反應(yīng)結(jié)束后直接觀察反應(yīng)液的顏色來判斷結(jié)果,大幅度降低了假陽性產(chǎn)生的可能性。

圖7 田間辣椒病樣的RT-PCR檢測Fig.7 Detection results of pepper samples from fields by RT-PCR

PeVYV是辣椒上重要病毒之一。自1995年Yonaha等在日本首次報道發(fā)現(xiàn)PeVYV以來[1],近幾年，亞洲、非洲、歐洲、美洲的多個國家陸續(xù)報道發(fā)生該病毒。2013年我國臺灣首次報道發(fā)現(xiàn)該病毒[5],隨后在山東和湖南等省份也檢測到該病毒[8-9]。本團隊對廣東省辣椒病毒病發(fā)生情況進行了調(diào)查,發(fā)現(xiàn)疑似辣椒黃脈病毒病,應(yīng)用小RNA測序技術(shù)及RT-LAMP方法對其病毒種類進行鑒定與檢測,發(fā)現(xiàn)PeVYV在廣東省主要辣椒產(chǎn)區(qū)均有分布,疑似病樣的檢測陽性率為38.3%,且常與甜椒脈斑駁病毒(Pepperveinalmottlevirus,PVMV)、辣椒葉脈斑駁病毒(Chilliveinalmottlevirus,ChiVMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)等病毒復(fù)合侵染或混合發(fā)生,說明PeVYV是引起廣東辣椒病毒病的主要病原病毒之一。需要進一步弄清其分布、發(fā)生規(guī)律及辣椒品種的抗性水平,為預(yù)防與控制該病毒病的發(fā)生提供科學(xué)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯:楊明麗)

Development of RT-LAMP for rapid detection of Pepper vein yellows virus

Tang Yafei1,2, He Zifu1,2, She Xiaoman1, Lan Guobing1

(1. Plant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China;2. Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Guangzhou 510640, China)

Pepperveinyellowsvirus(PeVYV) is an important virus of pepper worldwide. It is also one of the main pathogenic viruses infecting pepper in Guangdong Province. By using primer explorer software, two pairs of primers were designed according to the P3 gene sequence of PeVYV.The reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) detection method of PeVYV was developed. The PeVYV detection could be finished within 70 min by using this method and needs no special equipment. Its sensitivity was 10 times higher than that of ordinary RT-PCR.The detection result of suspected samples collected from fields by the method was consistent with that by RT-PCR.The advantages of RT-LAMP detection method for PeVYV were rapid, sensitive and simple. Hence,the method is suitable for rapid and accurate detection and identification of PeVYV.

Pepperveinyellowsvirus; RT-LAMP; rapid detection

Experimental Method & Technology

2015-12-16

2016-02-04

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303028); 廣東省科技計劃項目(2013B020309003; 2014B070706017)

S 436.418

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.017

* 通信作者 E-mail: hezf@gdppri.com