李思怡, 徐恩潔, 張 麗

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗中心, 烏魯木齊 830054)

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金黃色葡萄球菌的臨床分布及耐藥性分析

李思怡, 徐恩潔, 張 麗

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗中心, 烏魯木齊 830054)

目的 分析金黃色葡萄球菌在臨床感染的分布特點及耐藥性，為臨床合理選擇抗菌藥物提供理論參考。 方法 采用 VITEK-2Compact全自動細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行菌種鑒定，對新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年5月-2015年5月210株臨床標(biāo)本分離的金黃色葡萄球菌的分布進(jìn)行回顧性分析，細(xì)菌藥敏試驗采用K-B紙片擴(kuò)散法，PCR法檢測耐藥基因分布情況，耐甲氧西林金葡菌(MRSA)耐藥性測定選擇頭孢西丁法。結(jié)果 2013年5月-2015年5月臨床分離210株金黃色葡萄球菌中115株mecA 基因陽性，即為MRSA，陽性率為54.76%，其余95株為甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)。MRSA的分離率較高且對常用抗菌藥物多有較高的耐藥率。MRSA對氨芐西林、克林霉素和美羅培南3種藥物的耐藥率均為100.00%，MSSA對美羅培南耐藥率為100.00%，藥敏試驗未檢出萬古霉素和替考拉寧對MRSA及MSSA耐藥株。MRSA耐藥率高于MSSA，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 病人感染金黃色葡萄球菌的耐藥嚴(yán)重，臨床治療應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)與藥敏試驗結(jié)果合理選擇臨床用物，并進(jìn)一步加強(qiáng)對MRSA耐藥性的檢測。

金黃色葡萄球菌； 臨床分布； 耐藥分析

金黃色葡萄球菌是一種革蘭染色陽性球菌，在自然界廣泛分布，是臨床常見的致病菌之一，其可產(chǎn)生多種侵襲性酶和毒素等毒力因子，引起皮膚表面軟組織感染、菌血癥、敗血癥和侵入導(dǎo)管性感染等多種病變，不及時治療嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡的發(fā)生[1]。按細(xì)菌菌株耐藥性基因的改變，金黃色葡萄球菌通常情況下多被分為耐甲氧西林金葡菌(methicillin-resistant S.aureus，MRSA)和甲氧西林敏感金葡菌(methicillin-susceptible S.au-reus，MSSA)兩種，根本不同點在于前者基因染色體中含有一葡萄球菌盒式染色體基因(staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec)[2]。近年來隨著臨床廣譜抗生素的廣泛大量使用，耐MRSA感染率和分離率呈逐年增高趨勢，致其對多種抗菌素的耐藥性不斷增強(qiáng)，對用藥的選擇帶來較大困難，引起臨床治療時間延長，治療效果降低[3]。本研究選取2013年5月-2015年5月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的2 260例患者，對其臨床送檢標(biāo)本的病原菌進(jìn)行分析，旨在進(jìn)一步明確特定基因區(qū)域的金黃色葡萄球菌的主要流行克隆,阻斷其感染途徑,減少耐藥菌株在患者中傳播，以控制金黃色葡萄球菌傳播流行。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 選取2013年5月-2015年5月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的住院時間>48 h 的患者2 260例，其中男性1 238例，女性1 020例，年齡8～72歲，平均年齡50歲?；颊叩乃蜋z標(biāo)本包括血液、尿液、膿液、分泌物、深部痰液、胸腹水及各種引流液等，對以上送檢標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)后檢出的病原菌(同一患者的重復(fù)菌株均剔除)[4]進(jìn)行分析。

1.2 試劑和儀器 金黃色葡萄球菌DNA提取試劑盒購自美國Promega公司,Taq酶和dNTP等限制性核酸內(nèi)切酶購自英國OXOID公司,載體和連接酶購自德國QIAGEN公司；MH瓊脂購自寶生物公司,革蘭陽性菌鑒定卡和細(xì)菌自動鑒定儀購自美國Merek公司。Bio-Radicycler 熒光定量PCR系統(tǒng)購于美國Bio公司,蛋白酶K為法國梅里埃公司產(chǎn)品,電泳儀DYY-8C型雙穩(wěn)定時電泳儀電源購自上海博金有限公司。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃委員會制定的《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)》[5]確定是否為醫(yī)院感染。

1.4 抗生素 氨芐西林、苯唑西林、青霉素、頭孢唑肟、頭孢吡肟、頭孢唑林、復(fù)方新諾明、萬古霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、克林霉素、美羅培南、利福平、諾氟沙星、替考拉寧均為華北制藥廠產(chǎn)品。

1.5 方法

1.5.1 菌株分離鑒定 依照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行臨床標(biāo)本采集、分離細(xì)菌鑒定和細(xì)菌培養(yǎng)純化，革蘭染色，篩選MRSA和MSSA，利用頭孢西丁紙片法。質(zhì)控陽性菌株為ATCC 43300，陰性質(zhì)控菌株為ATCC 25923。

1.5.2 藥敏試驗 金黃色葡萄球菌藥敏試驗采用K-B紙片法。配成菌液麥?zhǔn)媳葷釢舛葹?.55；菌液涂布 MH 培養(yǎng)基3次，旋轉(zhuǎn)50℃/次。瓊脂吸收平板上的水分，貼紙片離皿邊緣不低于16 mm，紙片間距 25 mm。反轉(zhuǎn)平板，于37℃孵育過夜，測量并記錄抑菌圈直徑大小，觀察結(jié)果為頭孢西丁抑菌圈直徑>22 mm ；MRSA觀察結(jié)果為頭孢西丁抑菌圈直徑<20.5 mm。

1.5.3 金黃色葡萄球菌耐藥基因檢測1.5.3.1 金黃色葡萄球菌DNA模板制備 DNA模板制備利用裂解煮沸法。無菌接種環(huán)挑取過夜菌單菌落，置含55 U/mL Lysostaphin 的TE緩沖液中，混勻，置36.5℃中水浴，后100℃煮沸，以12 000 r/min(離心半徑8.7 cm)離心8 min，上清即為 金黃色葡萄球菌DNA，置-20℃保存。

1.5.3.2 耐藥基因檢測 參照文獻(xiàn)[7]設(shè)計引物。上游引物：5′-AGAGTAGCACTCGAATTAGGCAGT-3′，下游引物：5′-AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC-3′。由上海生物工程有限公司公司合成。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，10×PCR緩沖液2 μL，Taq酶1 μL，10 mmol/L dNTP混合液2 μL，鎂離子2 μL，無菌ddH2O(重蒸水)補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性5 min；96℃變性30 s，55℃退火32 s，75℃延伸40 s，共30個循環(huán)；75℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與溴酚藍(lán)指示劑混合后采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳28 min(電壓1 200 V)，采用凝膠成像儀進(jìn)行觀察結(jié)果并拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 金黃色葡萄球菌的臨床標(biāo)本分布情況 2013年5月-2015年5月從本院收治的住院2 260例患者的各種臨床標(biāo)本中共分離出病原菌1 358株，其中210株金黃色葡萄球菌，占15.46%；檢出MRSA 115株，檢出率54.76%；檢出MSSA 95株，檢出率45.24%。210 株金黃色葡萄球菌的臨床標(biāo)本來源主要分離自分泌物的分離率較高，為44.29%，其次為痰液、血液、中段尿、拭子、穿刺液、骨髓及大便，分別占分離株構(gòu)成比的16.67%、10.95%、8.10%、6.19%、5.71%、4.29%和1.90%(表1)。

2.2 金黃色葡萄球菌的耐藥性情況 MRSA對15種常用抗生素耐藥率:氨芐西林、克林霉素和美羅培南均為100%，苯唑西林89.57%，青霉素87.83%，頭孢唑肟和左氧氟沙星均為85.22%，頭孢唑林80.00%，諾氟沙星68.57%，頭孢吡肟56.22，復(fù)方新諾明54.78%，利福平53.91%，莫西沙星15.65%，未檢出萬古霉素和替考拉寧耐藥株。MSSA對抗生素耐藥率：美羅培南為100%，克林霉素89.47%，復(fù)方新諾明73.68%，青霉素68.42%，頭孢唑肟64.21%，頭孢唑林63.16%，氨芐西林61.05%，左氧氟沙星58.95%，苯唑西林54.74%，利福平40.00%，頭孢吡肟33.68%，諾氟沙星26.32%，莫西沙星17.89%，未檢出萬古霉素和替考拉寧耐藥株(表2)。

表1 210株金黃色葡萄球菌株分布情況

表2 金黃色葡萄球菌分離株耐藥情況

2.3 耐藥基因攜帶情況 PCR檢測210株金黃色葡萄球菌115株mecA基因陽性(圖1)，即為MRSA，陽性率為54.76%，其余95株為MSSA。

3 討論

金黃色葡萄球菌是臨床最常見的革蘭陽性球菌，自20 世紀(jì) 80 年代開始隨著各類抗菌藥物的臨床廣泛應(yīng)用，MRSA因其具有較強(qiáng)的外界環(huán)境適應(yīng)能力和定植能力，以及對抗生素的耐受能力，MRSA的分離率呈逐年增加趨勢，成為臨床感染的重要病原菌之一，給醫(yī)師治療帶來困難和挑戰(zhàn)[8]。

M: DNA分子標(biāo)志物; 1～10: 金黃色葡萄球菌分離株; P: 陽性對照; N: 陰性對照

圖1 金黃色葡萄球菌分離株mecA基因 PCR產(chǎn)物電泳圖

2013年5月-2015年5月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科共分離出210 株金黃色葡萄球菌的臨床標(biāo)本來源主要分離自分泌物的分離率較高， 為44.29%，其次為痰液、血液、中段尿、拭子、穿刺液、骨髓及大便，分別占分離株構(gòu)成比的16.67%、10.95%、8.10%、6.19%、5.71%、4.29%和1.90%。藥敏試驗顯示， MRSA對15種常用抗生素耐藥率:氨芐西林、克林霉素和美羅培南均為100%，苯唑西林89.57%，青霉素87.83%，頭孢唑肟和左氧氟沙星均為85.22%，頭孢唑林80.00%，諾氟沙星68.57%，頭孢吡肟56.22，復(fù)方新諾明54.78%，利福平53.91%，莫西沙星15.65%，未檢出萬古霉素和替考拉寧耐藥株。MSSA對抗生素耐藥率：美羅培南為100%，克林霉素89.47%，復(fù)方新諾明73.68%，青霉素68.42%，頭孢唑肟64.21%，頭孢唑林63.16%，氨芐西林61.05%，左氧氟沙星58.95%，苯唑西林54.74%，利福平40.00%，頭孢吡肟33.68%，諾氟沙星26.32%，莫西沙星17.89%，未檢出萬古霉素和替考拉寧耐藥株。

藥敏試驗結(jié)果表明MRSA對青霉素類和頭孢菌素類等β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥嚴(yán)重，且對喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、可林霉素類抗菌藥物的耐藥率也呈逐漸增高趨勢。210株金黃色葡萄球菌，占15.46%(210/1 358)；檢出115株mecA 基因陽性，即為MRSA，檢出率為54.76%，檢出MSSA 95株，檢出率為45.24%。mecA基因耐藥多伴有其他耐藥基因的發(fā)生，因此，建議臨床金黃色葡萄球菌感染用藥應(yīng)結(jié)合藥敏試驗結(jié)果，合理用藥，以防耐藥及耐多藥的出現(xiàn)。MRSA對氨芐西林、克林霉素和美羅培南均產(chǎn)生完全耐藥菌株，與近年來抗菌藥物的大量廣泛不合理應(yīng)用有關(guān)。金黃色葡萄球菌表面有能自身合成的青霉素蛋白(PBPs)，參與細(xì)胞壁的內(nèi)肽酶和轉(zhuǎn)肽酶的合成等，催化糖肽的交叉反應(yīng)，在細(xì)菌感染中起著至關(guān)重要的作用[9]。金黃色葡萄球菌可以合成5種PBPs，β-內(nèi)酰胺類抗生素可與上述青霉素蛋白共價進(jìn)行結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[10]。PBP2a與頭孢菌素類抗生素親和力低，生理作用與PBPs相同，可合成細(xì)胞壁，其PBPs與β-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合以后，PBP2a可代替失活的PBPs，使細(xì)菌有正常的生理功能[11]。金黃色葡萄球菌基因MecA位于MRSA染色體內(nèi)，編碼的PBP2a基因?qū)е骂^孢菌素β-內(nèi)酰胺類發(fā)生耐藥。靶位改變是金黃色葡萄球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的主要耐藥機(jī)制之一[12]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可與50S核糖體上的23SrRNA發(fā)生結(jié)合，引起細(xì)菌失去活性[13]。

金黃色葡萄球菌感染已成為廣泛關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一。臨床應(yīng)結(jié)合細(xì)菌的分離培養(yǎng)鑒定，進(jìn)行藥敏試驗以及MRSA 的檢測，進(jìn)一步區(qū)分MRSA與MSSA，對于目前出現(xiàn)的MRSA出現(xiàn)的耐藥率較高問題，臨床應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)MRSA的菌株基因鑒定及耐藥性監(jiān)測分析，為合理選擇使用抗菌藥物提供理論參考，以減少或延緩金黃色葡萄球菌耐藥性的產(chǎn)生。

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(本文編輯 張巧蓮)

The analysis of clinical distribution and drug resistance of Staphylococcus aureus

LI Siyi， XU Enjie, ZHANG Li

(DepartmentofClinicalLaboratory，theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830054,China)

Objective To analyze the distribution and drug resistance of Staphylococcus aureus in clinical infection, so as to provide theoretical reference for rational selection of antibiotics in clinical. Methods Strain identification was conducted by the Vitek-2 compact automatic bacteria identification instrument and distribution of 210 strains of clinical isolated staphylococcus aureus in the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University from May 2013 to May 2015 were retrospectively analyzed. And K-B paper disk diffusion method was used for bacterial susceptibility test, PCR method was used to test the resistance gene distribution, and cephalosporin Xi Ding method was used for determination of resistance to methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Results 115 strains of 210 strains of Staphylococcus aureus were MECA gene positive for MRSA, which the positive rate was 54.76% and the left of 95 strains were methicillin sensitive Staphylococcus strains (MSSA). Higher MRSA separating rate would lead to higher resistance rate for common antimicrobial drugs. The drug resistance rate of MRSA to ampicillin, clindamycin and meropenem all were 100.00%, and the drug resistance rate of MSSA to meropenem was 100.00%. The drug sensitivity test did not detected out of MRSA and MSSA strains resistant to vancomycin and teicoplanin. The MRSA resistance rate was higher than that of MSSA, which the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion The patients of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University from May 2013 to May 2015 had serious drug resistance of Staphylococcus aureus infection and clinical treatment should be conducted with bacterial culture and drug sensitivity test results are reasonable choice for clinical use, and need to further strengthen the detection of MRSA.

staphylococcus aureus; clinical distribution; drug resistance

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)管理課題(2015GL18)

李思怡(1969-)，女，主管技師，研究方向:為微生物學(xué),E-mail:1907926997@qq.com。

R446.5

A

1009-5551(2016)12-1534-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.12.013

2016-09-20]