夏 歡, 羅 琴, 楊新玲

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1核醫(yī)學(xué)科， 2綜合內(nèi)科一病區(qū)， 烏魯木齊 830011； 3新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 烏魯木齊 830000)

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攜帶Rep1風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)的帕金森病患者血液mRNA表達(dá)差異研究

夏 歡1, 羅 琴2, 楊新玲3

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1核醫(yī)學(xué)科，2綜合內(nèi)科一病區(qū)， 烏魯木齊 830011；3新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 烏魯木齊 830000)

目的 探索攜帶SNCA基因(synuclein alpha)Rep1風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)的帕金森病(Parkinson’s disease，PD)患者外周血基因表達(dá)差異。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)結(jié)合直接測(cè)序法檢測(cè)128例維吾爾族帕金森病人(PD組)及160例維吾爾族健康體檢者(對(duì)照組)SNCA啟動(dòng)子區(qū)Repl多態(tài)性，并按照PD患者年齡差異進(jìn)行分組比較,年齡≤50歲為EOPD組，年齡>50歲為L(zhǎng)OPD組。進(jìn)一步篩選攜帶Rep1風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)的3例PD患者及3例非攜帶健康體檢者，用Trizol提取外周血總RNA，分別與Illumina表達(dá)譜芯片進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 EOPD組與年齡相匹配的對(duì)照組比較，Rep1位點(diǎn)CA堿基重復(fù)12次(2型等位基因)的頻率分別為21.4%、6.9%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.67，P=0.00)。與對(duì)照組比較，EOPD患者外周血中差異表達(dá)2倍以上的基因有359條，包括SNCA基因在內(nèi)的122條表達(dá)上調(diào)2倍以上。其中與SNCA基因表達(dá)異常有關(guān)的多巴胺代謝和膽堿能突觸信號(hào)通路改變最顯著(FE=3.64，P=0.046；FE=5.57，P=0.005)。結(jié)論 Repl位點(diǎn)2型等位基因與EOPD的發(fā)生有關(guān)，攜帶該位點(diǎn)2型等位基因患者外周血SNCA表達(dá)異常升高。

帕金森?。?α突觸核蛋白基因； Rep1多態(tài)性

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)屬于一種常見(jiàn)的神經(jīng)變性疾病[1]，以黑質(zhì)紋狀體通路的多巴胺神經(jīng)元選擇性變性、缺失、嗜酸性包涵體(Lewy小體)形成為病理特征[2-3]。α突觸核蛋白基因(SNCA，synuclein alpha)表達(dá)增高引起α-synuclein蛋白的異常聚集是該嗜酸性包涵體形成的主要機(jī)制。既往研究提示該基因Rep1位點(diǎn)的長(zhǎng)度多態(tài)性與歐洲人群SNCA基因表達(dá)差異有關(guān)[4-5]。Rep1位點(diǎn)位于基因的啟動(dòng)子區(qū)，其長(zhǎng)度的變異可通過(guò)調(diào)節(jié)SNCA啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性而影響PD的患病風(fēng)險(xiǎn)[6]。相關(guān)研究探討了Repl多態(tài)性與散發(fā)性PD患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，但結(jié)果也不完全一致[7-9]。因此本研究探討研究SNCA基因Rep1位點(diǎn)多態(tài)性與PD發(fā)病的相關(guān)性，并為進(jìn)一步利用基因芯片技術(shù)探索Repl風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)攜帶者外周血基因表達(dá)的差異提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 一般資料及分組 以新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2013年6月-2015年4月經(jīng)神經(jīng)內(nèi)科專家確診的維吾爾族PD患者128例(PD組)為研究對(duì)象，以英國(guó)腦庫(kù)制定的方案作為PD診斷的標(biāo)準(zhǔn)[10]，PD組患者發(fā)病年齡為45～85歲，平均(63.5±12.2)歲，其中年齡≤50歲為早發(fā)型帕金森病組(Early-onset Parkinson’s Disease，EOPD組)，年齡>50歲即晚發(fā)型帕金森病組(Late-onset Parkinson’s Disease，LOPD組)。對(duì)照組為該地區(qū)年齡、性別、民族相匹配的160例無(wú)PD臨床表現(xiàn)及PD家族史的健康體檢者，年齡49～ 82歲，平均(64.0±10.5)歲。

1.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增 抽取外周靜脈血2 mL，利用DNA提取試劑盒(非離心柱型，上海天根生物有限公司)，按照說(shuō)明書(shū)提取靜脈血中有核細(xì)胞的全基因組DNA。SNCA基因上下游引物的序列分別為F:5′-CCTGGCATATTTGATTGCAA-3′，R：5′-GACTGGCCCAAGATTAACCA-3′。20 μL體積的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括100 ng/μL的上下游引物(各為0.5 μL，上海天根生物有限公司合成)、10 μL 的2×Power Taqman masterMix(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)、2.0 μL的50 ng/μL DNA，剩余7.0 μL體積由ddH2O補(bǔ)充，PCR擴(kuò)增反應(yīng)的退火溫度為58.7℃。所有PCR產(chǎn)物被送至上海生工股份有限公司直接測(cè)序檢測(cè)。

1.3 總RNA的提取和純化 為進(jìn)一步研究EOPD組2型等位基因?qū)NCA基因表達(dá)的影響，隨機(jī)抽取3例含2型等位基因的EOPD患者，基因型分別為2/2、1/2、1/2，3例≤50歲不含2型等位基因的對(duì)照組患者，基因型分別為0/0、0/0、0/1。6例受試者取清晨空腹外周靜脈血8.0 mL，使用美國(guó)Sigma-Aldrich公司的淋巴細(xì)胞分離液Histopaque?-1077，于4.0 h 內(nèi)分離標(biāo)本中的單核淋巴細(xì)胞。用Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA)裂解外周血單核細(xì)胞，然后氯仿洗滌，使用異丙醇沉淀混合液中的RNA，70%乙醇洗滌2次，最后以無(wú)RNase水溶解沉淀。用美國(guó)2100-Bioanalyzer芯片分析軟件(Agilent Technologies, California, USA)對(duì)總RNA進(jìn)行定量檢測(cè)，要求A260/280(吸光度) nm≥1.8，28 S/18 S≥1.0，保存于-80℃的恒溫冰箱中。

1.4 芯片的雜交和洗滌 取RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA(1.5 μg)混合于無(wú)RNARase的20 μL雜交液GEX-HBY中(美國(guó)，Illumina公司，California)，取上述混合液分別上樣于基因芯片Human Expression Bead Chip中(美國(guó)，Illumina公司，California)，58.0℃的雜交槽中反應(yīng)16～20 h。取Illumina芯片配套試劑液E1BC溶液250 mL(美國(guó)，Illumina公司，California)，依次在55.0℃條件下充分洗滌10 min，室溫20℃環(huán)境下洗滌5 min，然后利用Illumina Bead Chip Reader軟件(美國(guó)，Illumina公司，California)讀取芯片數(shù)據(jù)并捕捉圖像，該實(shí)驗(yàn)過(guò)程由上海晶能生物技術(shù)有限公司完成。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，各組間基因型及等位基因頻率差異比較運(yùn)用卡方檢驗(yàn)，連續(xù)性變量比較運(yùn)用t檢驗(yàn)或方差分析。利用R軟件(http://www.r-project.org)進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)算基因芯片結(jié)果的P值和各基因的表達(dá)倍數(shù)值(Fold change，F(xiàn)C)及所有差異基因的富集指數(shù)(Fold enrichment，F(xiàn)E)，并統(tǒng)計(jì)具有差異的KEGG pathway(P<0.05)?；蛐酒瑪?shù)據(jù)分析由上海晶能生物技術(shù)有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1 遺傳平衡檢驗(yàn) 經(jīng)Hardy-Weinberg定律檢驗(yàn)，對(duì)照組和PD組Rep1位點(diǎn)基因型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.67，P=0.48；χ2=1.16，P=0.36)，兩組數(shù)據(jù)的吻合度良好，具有可比性。

2.2 PCR瓊脂糖凝膠結(jié)果 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的理論值為267 bp，電泳顯示結(jié)果如圖1所示，隨機(jī)6個(gè)DNA樣品PCR 擴(kuò)增片段均在200～300 bp的范圍內(nèi)。

2.3 基因型和等位基因頻率的差異 根據(jù)既往研究的命名方法將SNCA基因Rep1位點(diǎn)CA重復(fù)次數(shù)10、11、12次的等位基因分別命名為等位基因0、1、2[11-12]。PD組與對(duì)照組各基因型及等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.43，P=0.30；χ2=4.28，P=0.51)；EOPD組和年齡≤50歲對(duì)照組2型等位基因頻率分別為21.4%、6.9%，EOPD組2型等位基因頻率高于年齡≤50歲對(duì)照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.67，P=0.00)； LOPD組與年齡相匹配對(duì)照組比較，等位基因分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.23，P=0.41)，結(jié)果見(jiàn)表1、2。

M: Marker； 1～6: PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

組別例數(shù)等位基因0等位基因1等位基因2χ2值P值對(duì)照組16099(30.9)200(62.5)21(6.6)2.430.30PD組12868(26.6)164(64.1)24(9.4)≤50歲對(duì)照組3622(30.6)45(60.5)5(6.9)12.670.00EOPD組2812(21.4)32(57.1)12(21.4)>50歲對(duì)照組12477(31.0)155(62.5)16(6.5)2.230.41LOPD組10056(28.2)132(66.7)12(5.1)

表2 Rep1位點(diǎn)各基因型頻率差異的比較/例(%)

2.4 表達(dá)差異的基因 基因芯片結(jié)果顯示17 684條基因(47.3%)有表達(dá)差異，其中359條基因表達(dá)差異的倍數(shù)FC達(dá)到2.0倍以上，該差異基因結(jié)果顯示122條表達(dá)上調(diào)(36.6%)，237條表達(dá)下調(diào)(63.4%)，EOPD與對(duì)照組SNCA比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02，F(xiàn)C=2.59)(圖2),EOPD組中SNCA基因顯示為紅色，對(duì)照組為綠色，紅色代表基因表達(dá)上調(diào)2倍以上，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

注：紅色代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因區(qū)域

2.6 KEGG pathway富集度分析 與對(duì)照組比較，EOPD組多巴胺突觸通路、膽堿能突觸通路、GABA能突觸通路及谷氨酸能突觸通路的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FE=3.64，P=0.046；FE=5.57，P=0.005；FE=4.06，P=0.035；FE=5.19，P=0.019)，上述4個(gè)生物學(xué)通路均涉及神經(jīng)系統(tǒng)多個(gè)代謝類別，與增加PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)(圖4)。

3 討論

PD是第二大中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要病理改變是SNCA基因編碼的a-synuclein異常聚集在黑質(zhì)DA能神經(jīng)元導(dǎo)致后者變性缺失。Repl為SNCA基因啟動(dòng)子區(qū)的雙核苷酸重復(fù)變異，在該研究中，維吾爾族PD組及對(duì)照組的2型等位基因的攜帶率分別為9.4%、6.6%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.43，P=0.30)。按年齡分層比較顯示，EOPD組等位基因2頻率(21.4%)顯著高于年齡≤50歲對(duì)照組的6.9%(χ2=12.67，P=0.00)，與Mellick等[12]的結(jié)果基本一致。同時(shí)Gatto等[13]和Wang等[14]以亞洲人群為研究對(duì)象也得出相似的研究結(jié)果，即該基因的2型等位基因攜帶者患PD的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。

注：1～3為EOPD組；4～6為對(duì)照組?；虮磉_(dá)上調(diào)顯示為紅色，反之為綠色，其中SNCA基因在EOPD組中表達(dá)上調(diào)差異達(dá)到2倍以上。

圖3 表達(dá)差異基因的聚類分析圖

注：紅色柱對(duì)應(yīng)顯著的 Pathway 通路，藍(lán)色柱為不顯著的 pathway 通路

圖4 KEGG pathway 富集分析圖

Rep1位點(diǎn)2型等位基因較其它等位基因長(zhǎng)度增加，該變異可產(chǎn)生一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)，提高轉(zhuǎn)錄因子與SNCA基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力[7]，導(dǎo)致內(nèi)源性a-synuclein蛋白的含量增加，為該蛋白進(jìn)一步聚集提供基礎(chǔ)，因此2/2型攜帶者患PD的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[15]，這也與本研究結(jié)果相一致。

為進(jìn)一步探索年齡≤50歲人群2型等位基因與PD患病的相關(guān)性，本課題組利用基因芯片技術(shù)，篩選3例維吾爾族PD患者和3例維吾爾族對(duì)照比較，結(jié)果顯示359條表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因，122條基因表達(dá)上調(diào)(36.6%)，有237條表達(dá)下調(diào)(63.4%)。同時(shí)這些表達(dá)上調(diào)的基因中包含與PD發(fā)生密切相關(guān)的SNCA基因(FC=2.59，P=0.02)。既往研究結(jié)果表明，a-synuclein蛋白廣泛存在于外周血及腦脊液中，且可能與PD的病情進(jìn)展相關(guān)，但結(jié)論尚不完全一致[16]。本研究證實(shí)了SNCA基因在PD患者外周血中存在異常表達(dá)，這與Kim等[16]研究的結(jié)果相一致。進(jìn)一步說(shuō)明SNCA基因的異常表達(dá)可能與本地區(qū)維族EOPD 的發(fā)生有關(guān)。

EOPD患者不僅發(fā)病早，且臨床癥狀發(fā)展較快，隨著病情的進(jìn)展，部分患者出現(xiàn)非運(yùn)動(dòng)癥狀，如抑郁、焦慮、幻覺(jué)、認(rèn)知功能下降等。故本研究對(duì)基因芯片結(jié)果中的差異基因進(jìn)行KEGG生物學(xué)通路富集分析后提示多巴胺突觸通路、膽堿能突觸通路、谷氨酸能突觸通路及GABA能突觸通路均與疾病的發(fā)生有關(guān)，其中SNCA基因表達(dá)差異涉及多巴胺突觸和膽堿能突觸通路，而多巴胺突觸通路異常導(dǎo)致多巴胺代謝紊亂是PD發(fā)生的病理基礎(chǔ)，因?yàn)槎喟桶吠挥|功能下降不僅降低中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺的分泌及攝取，同時(shí)海馬旁回、額葉的記憶力、注意力和執(zhí)行功能均會(huì)受損[8-9]。本研究中膽堿能突觸相關(guān)信號(hào)通路也顯示異常。既往研究顯示膽堿能突觸a-synuclein蛋白的高聚集可誘導(dǎo)海馬旁回膽堿能細(xì)胞的凋亡從而影響患者認(rèn)知功能[17-18]。其他信號(hào)通路研究方面，GABA及谷氨酸能通路的異?？赡芘c黑質(zhì)紋狀體區(qū)多巴胺含量減少的代償效應(yīng)相關(guān)[19]。而癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)及小細(xì)胞肺癌通路的異?？赡芘cPD患者多巴胺神經(jīng)元存在共同的凋亡機(jī)制有關(guān)[20]。

本研究結(jié)果表明膽堿能突觸、谷氨酸突觸、GABA能突觸、多巴胺突觸功能異常均與EOPD的發(fā)生有關(guān)，但SNCA基因異常表達(dá)與上述信號(hào)通路失調(diào)機(jī)制的關(guān)聯(lián)性尚有待于進(jìn)一步深入研究。

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(本文編輯 楊晨晨)

Study on the differential expression of mRNA in blood of patients with Parkinson′s disease carrying the Rep1 risk locus

XIA Huan1, LUO Qin2, YANG Xinling3

(1DepartmentofNuclearMedicine，2DepartmentofCadreWards，theAffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China；3DepartmentofInternalMedicine-Neurology，theSecondAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830000，China)

Objective To explore the differences of gene expression in peripheral blood of patients with Parkinson′s disease (PD) carrying the synuclein alpha gene Rep1 risk locus. Methods Rep1 polymorphism of SNCA in promoter region was detected in 128 patients (PD group) and 160 healthy volunteers (control group) at the Repl promoter region of the Uyghur healthy volunteers (control group) in cases, with the methods of Polymerase Chain Reaction (PCR) and Direct Sequencing. Group comparison was based on age differences that the patients less than 50 years as the EOPD group and the patients older than 50 years as LOPD group. Screening of 3 PD patients with Rep1 risk loci and 3 healthy controls, the total RNA was extracted from peripheral blood by Trizol, and the Illumina expression profile microarray was used for hybridization experiment. Results 2 allele frequency of 21.4% in EOPD group was significantly higher than that in the control group under 50 years old of 6.9%, which the difference was statistically significant (χ2=12.67, P=0.00). By using this DNA microarray technology, 359 candidate genes in patients with PD were found. 122 genes expressions correlating to PD were found with twice fold over-expression differences, compared with the control group. In which the changes that were involving in the dopaminergic and cholinergic synaptic signaling pathways were most significant (FC=3.64, P=0.046; FC=5.57, P=0.005). Conclusion The allele of Repl locus 2 was related to the occurrence of EOPD, and SNCA gene expression was abnormally increased in peripheral blood of patients with type 2 alleles.

Parkinson′s disease; Synuclein alpha; Rep1

新疆醫(yī)科大學(xué)科研創(chuàng)新基金(XYDCX201470)

夏 歡(1987-)，男，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：帕金森病的診斷與治療。

楊新玲，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向，帕金森病發(fā)病機(jī)制的研究，E-mail: poplar862@sohu.com。

R742.5

A

1009-5551(2016)12-1554-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.12.017

2016-07-06]