李真真，白春生，余奕東，玉柱*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110866；3.鄂爾多斯市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯017000)

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刈割期及添加劑對(duì)苜蓿青貯品質(zhì)及CNCPS蛋白組分的影響

李真真1，白春生2，余奕東3，玉柱1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110866；3.鄂爾多斯市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯017000)

本試驗(yàn)旨在研究生物及化學(xué)添加劑對(duì)不同時(shí)期刈割的苜蓿青貯品質(zhì)的影響。試驗(yàn)采用現(xiàn)蕾期和初花期刈割的中苜一號(hào)苜蓿(70%水分含量)為原料，分別設(shè)置添加：1)空白組；2)乳酸菌+纖維素酶(105cfu/g+50 mg/kg)；3)乳酸菌+纖維素酶(105cfu/g+100 mg/kg)；4)甲酸+丙酸(6 mL/kg)4個(gè)處理組，使用0.5 L塑料桶調(diào)制罐裝青貯，并于發(fā)酵30 d后開罐取樣分析。結(jié)果表明，與現(xiàn)蕾期相比，初花期苜蓿青貯飼料的乳酸(LA)產(chǎn)量較高，丁酸(BA)和氨態(tài)氮(NH3-N)生成量較低(P<0.01)，pH值也較低(P<0.05)，同時(shí)非蛋白氮(PA)和結(jié)合蛋白質(zhì)(PC)含量也顯著低于現(xiàn)蕾期(P<0.01)。3個(gè)添加劑處理組均顯著地提高了青貯發(fā)酵的品質(zhì)，降低pH值(P<0.01)和氨態(tài)氮生成量(P<0.01)。其中，乳酸菌+纖維素酶顯著地提高了乳酸含量及乳酸/乙酸(LA/AA)(P<0.01)，甲酸+丙酸則顯著抑制了丁酸的產(chǎn)生(P<0.01)。同時(shí)，3組添加劑均顯著地提高了青貯飼料中可溶性碳水化合物(WSC)和粗蛋白(CP)的含量，并降低了中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的含量(P<0.01)。就蛋白組分而言，乳酸菌+纖維素酶(105cfu/g+100 mg/kg)和甲酸+丙酸處理組顯著地降低了青貯飼料中非蛋白氮和結(jié)合蛋白質(zhì)的含量(P<0.01)，提高了真蛋白(PB)的含量(P<0.01)。綜合而言，甲酸+丙酸處理組苜蓿青貯料的品質(zhì)最佳，乳酸菌+纖維素酶(105cfu/g+100 mg/kg)次之。

刈割期；添加劑；苜蓿；青貯品質(zhì)；CNCPS

紫花苜蓿(Medicagosativa)是國(guó)內(nèi)外主要栽培的優(yōu)質(zhì)牧草之一，因其富含蛋白質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高而廣受關(guān)注[1]。刈割收獲是紫花苜蓿生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，由于受光照、氣溫及水分等的影響，在一個(gè)生育期處于不同生育階段的苜蓿其水分、粗蛋白、可溶性碳水化合物等指標(biāo)均存在差異，因此，合理的刈割時(shí)期對(duì)于青貯加工的品質(zhì)及產(chǎn)量均有重要的影響[2]。同時(shí)，苜蓿由于本身附著乳酸菌、可溶性碳水化合物含量低且緩沖能高等原因難以獲得優(yōu)質(zhì)的青貯飼料[3]，生產(chǎn)中通常使用乳酸發(fā)酵促進(jìn)劑(乳酸菌制劑、酶制劑等)、不良微生物抑菌劑(甲酸、丙酸等)等添加劑提高其發(fā)酵品質(zhì)[4]。

在青貯過程中，原料中的真蛋白在植物酶的作用下轉(zhuǎn)化為非蛋白氮，造成蛋白質(zhì)水解，降低青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5]。尤其對(duì)于苜蓿等蛋白質(zhì)含量豐富的豆科植物，研究其青貯后的蛋白質(zhì)組成更加重要?？的螤杻籼妓衔?蛋白質(zhì)體系(cornell net carbohydrate and protein system, CNCPS)是由美國(guó)康奈爾大學(xué)科學(xué)家提出的基于瘤胃降解特征的飼料評(píng)價(jià)體系，該體系將飼料蛋白質(zhì)劃分為3個(gè)部分：PA(非蛋白氮)、PB(真蛋白)和PC(結(jié)合蛋白)，其中，真蛋白又根據(jù)其在瘤胃中的降解速度分為PB1、PB2、PB3三部分[6]。根據(jù)蛋白質(zhì)降解的快慢，較為準(zhǔn)確地反映其在瘤胃中的發(fā)酵情況，評(píng)價(jià)飼料的可利用程度，從而更好地用于調(diào)配日糧。CNCPS作為一個(gè)新的體系，經(jīng)過不斷地完善和補(bǔ)充，在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)揮很大的指導(dǎo)作用。

目前，實(shí)際生產(chǎn)中常使用生物添加劑和化學(xué)添加劑以保證苜蓿青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，但關(guān)于不同添加劑和刈割時(shí)期對(duì)于苜蓿青貯飼料中蛋白質(zhì)組分的研究較為缺乏。因此，本試驗(yàn)選用生產(chǎn)上常用的生物及化學(xué)添加劑，研究其對(duì)于現(xiàn)蕾期和初花期刈割的紫花苜蓿青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)及CNCPS蛋白質(zhì)組分的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

青貯原料：本試驗(yàn)開展時(shí)間為2014年6月至9月，試驗(yàn)以中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)涿州農(nóng)業(yè)科技園種植的第一茬苜蓿(中苜一號(hào))為原料，分別在現(xiàn)蕾期和初花期刈割后進(jìn)行晾曬至含水量降至70%左右，使用切碎機(jī)切碎為2 cm左右。

青貯添加劑：植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，LP)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草青貯研究室提供，添加量為105cfu/g鮮草。

纖維素酶(C)：固態(tài)酶，多組分的復(fù)合生物催化劑，由山東信得利生物工程有限公司提供，標(biāo)準(zhǔn)酶活力單位(CMC酶)1060 U/g，添加量分別為50和100 mg/kg鮮草。

有機(jī)酸(FA+PRA)：將甲酸(formic acid,FA)和丙酸(propionic acid,PRA)分別稀釋為45%后按照1∶1勾兌，添加量為6 mL/kg鮮草。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及青貯方法

每個(gè)刈割時(shí)期均設(shè)置4個(gè)處理組，分別為：1)空白組(Control)；2)乳酸菌+纖維素酶(105cfu/g+50 mg/kg，LP+C50)；3)乳酸菌+纖維素酶(105cfu/g+100 mg/kg，LP+C100)；4)甲酸+丙酸(6 mL/kg，F(xiàn)A+PRA)。

將切碎的苜蓿原料與添加劑分別混合均勻后,裝入0.5 L聚乙烯桶中，壓實(shí)后蓋上內(nèi)外蓋并封口，每個(gè)處理組設(shè)有3個(gè)重復(fù)，在室溫下貯藏30 d后開封，取樣分析。

1.3 分析方法

青貯飼料開封后，準(zhǔn)確稱取樣品20 g，加入180 mL蒸餾水混合均勻，再用榨汁機(jī)攪拌1 min，用4層紗布和定性濾紙過濾，制備青貯浸出液，測(cè)定pH值。浸出液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，測(cè)定乳酸(lactic acid, LA)、乙酸(acetic acid, AA)、丙酸和丁酸(butyric acid, BA)含量。剩余樣品稱取200 g左右以及原料分別于65 ℃條件下烘干48 h，測(cè)定干物質(zhì)含量(DM)。烘干的樣品用微型植物粉碎機(jī)粉碎，過1 mm篩，用于測(cè)定粗蛋白(crude protein, CP)、可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate, WSC)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)等營(yíng)養(yǎng)成分。

采用雷磁pHS-3C型pH計(jì)測(cè)定pH值[7]。采用島津LC-20A型高效液相色譜儀測(cè)定有機(jī)酸(色譜柱：KC-811 column，Shimadzu，日本；檢測(cè)器：SPD-M10AVP；流動(dòng)相：3 mmol/L高氯酸，流速1 mL/min，柱溫50 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量5 μL[8])。采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定氨態(tài)氮含量[9]。用凱氏定氮法測(cè)定青貯飼料及原料的粗蛋白含量[10]。采用Van Soest[10]的方法測(cè)青貯飼料及原料的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量。采用硫酸-蒽酮比色法測(cè)定可溶性碳水化合物[11]。依據(jù)Licitra等[12]的方法測(cè)定可溶性蛋白(soluble protein, SOLP)和非蛋白氮(non-protein nitrogen, NPN)。中性洗滌不溶氮(NDF insoluble protein, NDFIP)和酸性洗滌不溶氮(ADF insoluble protein, ADFIP)按照Van Soest等[13]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4 CNCPS蛋白組分的計(jì)算方法

根據(jù)Sniffen等[6]的方法進(jìn)行。

PA(% CP)=NPN(% CP)

PB1(% CP)=SOLP(% CP)-PA(% CP)

PB3(% CP)=NDFIP(% CP)-ADFIP(% CP)

PC(% CP)=ADFIP(% CP)

PB2(% CP)=100-PA(% CP)-PB1(% CP)-PB3(% CP)-PC(% CP)

式中：PA (% CP) 為非蛋白氮占粗蛋白的百分比；PB1(% CP) 為快速降解蛋白占粗蛋白的百分比；PB2(% CP) 為中速降解蛋白質(zhì)占粗蛋白的百分比；PB3(% CP) 為慢速降解蛋白質(zhì)占粗蛋白的百分比；PC (% CP) 為結(jié)合蛋白質(zhì)占粗蛋白質(zhì)的百分比。式中百分號(hào)僅為單位，不參與乘法計(jì)算，故數(shù)值相乘后需乘以100%，使得出的單位為百分?jǐn)?shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SAS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和雙因素分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同刈割期苜蓿原料的化學(xué)成分

由表1可知，與現(xiàn)蕾期相比，初花期苜蓿含有較高的WSC、NDF及ADF含量，同時(shí)其CP含量低于現(xiàn)蕾期原料。

表1 兩個(gè)刈割期苜蓿原料的化學(xué)成分

DM: Dry matter; WSC: Water soluble carbohydrate; CP: Crude protein; NDF: Neutral detergent fiber; ADF: Acid detergent fiber；下同 The same below.

表2 刈割期、添加劑對(duì)苜蓿青貯品質(zhì)的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

LP+C50：添加乳酸菌+纖維素酶(105cfu/g+50 mg/kg)；LP+C100：添加乳酸菌+纖維素酶(105cfu/g+100 mg/kg)；FA+PRA：添加甲酸+丙酸(6 mL/kg)。同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同。

LP+C50: 105cfu/gL.plantarumand 50 mg/kg cellulase; LP+C100: 105cfu/gL.plantarumand 100 mg/kg cellulase; FA+PRA: 6 mL/kg formic acid+propionic acid; LA: Lactic acid; AA: Acetic acid; PRA: Propanoic acid; BA: Butyric acid; TN: Total nitrogen; ND: Not detected; Different small letters in the same column mean significant differences (P<0.05), the same letters mean no significant difference (P>0.05), the same below.

2.2 添加劑對(duì)于兩個(gè)刈割期苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響

初花期苜蓿青貯的pH值低于現(xiàn)蕾期苜蓿(P<0.05)(表2)，但LA和AA生成量較高，而NH3-N生成量也顯著小于現(xiàn)蕾期苜蓿(P<0.05)。就養(yǎng)分含量而言，初花期的WSC顯著高于現(xiàn)蕾期(P<0.05)，而CP較之略低。

使用LP+C和FA+PRA均可以顯著降低青貯的pH值、BA及NH3-N含量(P<0.05)，提高LA生成量及LA/AA(P<0.05)，增加WSC和CP的含量(P<0.05)，并顯著降低NDF和ADF含量(P<0.05)。生物添加劑處理組中，NDF和ADF含量隨纖維素酶使用量的增加而降低。而FA+PRA處理組的pH值和NH3-N低于生物添加劑處理組，且未檢測(cè)到BA產(chǎn)生(表2)。

2.3 添加劑對(duì)于兩個(gè)刈割期苜蓿青貯飼料CNCPS蛋白組分的影響

水力壓裂模型中，壓裂孔位于中心位置，周圍均勻布置4個(gè)控制孔，依次編號(hào)為A1、A2、A3、A4。筆者通過在控制孔A2和A3內(nèi)施加恒定的控制水壓，A1、A4孔內(nèi)無水壓，以此促使煤體孔隙壓力場(chǎng)表現(xiàn)出非對(duì)稱分布的特征，如圖2所示，以此研究孔隙壓力場(chǎng)分布特征對(duì)煤體起裂以及裂隙擴(kuò)展規(guī)律的影響。

初花期苜蓿青貯料的PA顯著低于現(xiàn)蕾期，但PB1、PB2、PB3組分均較高(表3)。LP+C100和FA+PRA處理組可顯著降低青貯飼料中的PA、PC組分，增加PB組分含量(P<0.05)，且此效果在FA+PRA組最顯著。

3 討論

在本試驗(yàn)中，初花期刈割的苜蓿原料在30 d的發(fā)酵之后pH值低于現(xiàn)蕾期苜蓿，添加劑處理組的pH值均低于4.2，乳酸的生成量較高，且丁酸和氨態(tài)氮產(chǎn)量也顯著低于現(xiàn)蕾期。這是由于初花期苜蓿原料中的WSC含量高于現(xiàn)蕾期，可發(fā)酵底物含量較多。這與李光耀等[2]的研究結(jié)果一致，隨著苜蓿生育期的延長(zhǎng)，苜蓿中的可溶性碳水化合物含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，且在初花期達(dá)到最大值。苜蓿青貯過早，不僅可發(fā)酵底物較少，而且含水量太高，會(huì)因大量的丁酸發(fā)酵而失敗。

表3 刈割期、添加劑對(duì)苜蓿青貯CNCPS蛋白組分的影響(粗蛋白基礎(chǔ))

PA: Non-protein nitrogen; PB1: Fast degradable protein; PB2: Moderate degradable protein; PB3: Slow degradable protein; PC: Unusable protein.

使用乳酸菌+纖維素酶和甲酸+丙酸都可以顯著地提高苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)，其中乳酸菌+纖維素酶的作用原理為促進(jìn)乳酸發(fā)酵，而甲酸+丙酸是抑制有害發(fā)酵，從而降低pH值以抑制梭菌等有害菌的活動(dòng)及蛋白質(zhì)水解酶作用[14-15]。梭菌等有害菌以可溶性碳水化合物、有機(jī)酸和蛋白質(zhì)為底物，發(fā)酵產(chǎn)生丁酸和氨態(tài)氮，不僅造成營(yíng)養(yǎng)成分的損失，還會(huì)影響青貯飼料的口感，造成動(dòng)物中毒[4]。因此丁酸的含量和氨態(tài)氮是衡量青貯飼料優(yōu)劣的重要指標(biāo)[16]。一般認(rèn)為優(yōu)質(zhì)的青貯飼料的丁酸含量應(yīng)低于1%，氨態(tài)氮/總氮應(yīng)低于10%[17]。在本試驗(yàn)中，3個(gè)添加劑處理組對(duì)于苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)都有極顯著的改善作用，均增加了乳酸、乳酸/乙酸，降低丁酸和氨態(tài)氮產(chǎn)量，并顯著地抑制了可溶性碳水化合物和粗蛋白的降解。其中FA+PRA對(duì)于兩個(gè)刈割時(shí)期苜蓿原料均有很好的作用效果，表現(xiàn)為低pH值(4.29和4.01)、無丁酸、少量氨態(tài)氮(6.22%和2.51%總氮)。LP+C在初花期苜蓿原料中獲得理想的青貯發(fā)酵結(jié)果，而在現(xiàn)蕾期苜蓿原料青貯的pH值略高，且有丁酸和氨態(tài)氮產(chǎn)生。另外，兩類添加劑的使用顯著地增加貯料中WSC含量并降低了NDF及ADF的含量，可能利于提高飼料的適口性。

研究表明，苜蓿鮮草中的非蛋白氮占總蛋白的8%～18%，而青貯之后的苜蓿中非蛋白氮占總蛋白的比例可達(dá)到44%～87%[5]，這是因?yàn)樵谇噘A發(fā)酵過程中，大量的蛋白質(zhì)被降解成為非蛋白氮。青貯飼料中的蛋白質(zhì)變化，除了與梭菌等有害菌的活動(dòng)有關(guān)，更主要的是植物中所含的蛋白質(zhì)水解酶的作用[18]。McKersie[19]的研究結(jié)果表明苜蓿中的蛋白酶最適宜pH值為6.0，酶的活性會(huì)隨著pH值的下降而降低，由于pH值影響蛋白酶的活性，保證較低的pH值環(huán)境能夠抑制蛋白酶的活性。本試驗(yàn)結(jié)果與此一致，當(dāng)現(xiàn)蕾期苜蓿未使用添加劑時(shí)，其貯料的pH達(dá)到5.55，同時(shí)非蛋白氮的含量也高達(dá)67.80%，而在LP+C100和FA+PRA處理組中，非蛋白氮的含量顯著下降。PC組分屬于不可利用的蛋白，其含量越低，蛋白質(zhì)的生物學(xué)效價(jià)越高。PB2和PB3組分在瘤胃中的降解速率分別屬于中速和慢速，其部分可以進(jìn)入小腸，形成瘤胃蛋白，對(duì)提高家畜的生產(chǎn)性能具有較大的作用[20]。本試驗(yàn)中，LP+C100和FA+PRA處理均顯著地降低了青貯料中PC的含量，增加了可利用的PB組分含量，而LP+C50在抑制蛋白質(zhì)降解方面不顯著，這說明增加纖維素酶的使用量可以更顯著地抑制蛋白質(zhì)的降解，這與Pys等[21]的結(jié)果一致。FA+PRA抑制蛋白質(zhì)分解的效果明顯優(yōu)于LP+C，這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)降解速度在貯藏后第1天最快，且前7 d降解均較為激烈[22]，而生物添加劑不能如有機(jī)酸添加劑一樣快速降低pH從而抑制蛋白質(zhì)降解。

4 結(jié)論

與現(xiàn)蕾期刈割的苜蓿相比，初花期刈割苜蓿的青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高。添加乳酸菌+纖維素酶和甲酸+丙酸均能夠降低苜蓿青貯飼料的pH值、丁酸和氨態(tài)氮的產(chǎn)量，顯著地降低非蛋白氮和結(jié)合蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，增加真蛋白的含量。綜合而言，甲酸+丙酸處理組苜蓿青貯料的品質(zhì)最佳，乳酸菌+纖維素酶(105cfu/g+100 mg/kg)次之。

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Effects of cutting stage and additives on the fermentation quality and CNCPS protein fractions of alfalfa silage

LI Zhen-Zhen1, BAI Chun-Sheng2, YU Yi-Dong3, YU Zhu1*

1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China; 2.CollegeofHorticulture,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China; 3.AgricultureandAnimalHusbandryBureauofEerduosiCity,Eerduosi017000,China

The effect of microbial and chemical additives on the quality of alfalfa silage were tested in this study. Alfalfa was harvested at budding and early-flowering stage and wilted to approximately 70% moisture content and treated with four additive treatments; distilled water (control), 105cfu/gLactobacillusplantarumand 50 mg/kg cellulase (LP+C50), 105cfu/gL.plantarumand 100 mg/kg cellulose (LP+C100) and 6 mL/kg formic acid+propionic acid (FA+PRA), with 3 replications. Silages were analyzed after 30 d of ensiling. This study indicated that alfalfa harvested at the early flowering stage had lower pH (P<0.05), butyric acid (BA) and NH3-N (P<0.01) than those harvested at budding with significantly less non-protein nitrogen (PA) and unusable protein (P<0.01). All three additives significantly increased the fermentation quality of alfalfa by decreasing the pH and content of NH3-N (P<0.01). Alfalfa silage treated with LP+C had significantly higher lactic acid and lactic acid/acetic acid (P<0.01) while BA was not detected in the FA+PRA treatment. All additives had higher water soluble carbohydrate (WSC) and crude protein (CP) and less neutral detergent fiber (NDF) and acid detergent fiber (ADF) (P<0.01) than the control. Applying LP+C100and FA+PRA markedly decreased the concentration of non-protein nitrogen and unusable protein, and increased the content of true protein in silages (P<0.01). The results suggest that alfalfa silage treated with FA+PRA had the highest quality, followed by LP+C100treated silage.

cutting stage; additives; alfalfa; silage quality; CNCPS (cornell net carbohydrate and protein system)

10.11686/cyxb2016029

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-01-20；改回日期：2016-03-25

國(guó)家牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-35)，公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303061)(201403048)，天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目(201404040)和內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(苜蓿混合青貯調(diào)制技術(shù)研究與示范)資助。

李真真(1990-)，女，河南鞏義人，在讀碩士。E-mail: zhenzhenli5048@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail: yuzhu3@sohu.com

李真真，白春生，余奕東，玉柱. 刈割期及添加劑對(duì)苜蓿青貯品質(zhì)及CNCPS蛋白組分的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(11): 167-172.

LI Zhen-Zhen, BAI Chun-Sheng, YU Yi-Dong, YU Zhu. Effects of cutting stage and additives on the fermentation quality and CNCPS protein fractions of alfalfa silage. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(11): 167-172.