張梁宇，郭滿盈，王　翔，陸亞琪，朱曉楊，郝陽陽，陳　楊

喜樹堿對低氧誘導HaCaT細胞趨化因子配體20表達的影響

張梁宇，郭滿盈，王翔，陸亞琪，朱曉楊，郝陽陽，陳楊

張梁宇

目的觀察喜樹堿（CPT）對低氧（2%O2）培養(yǎng)下人永生化角質形成細胞（HaCaT細胞）趨化因子配體（CCL20）表達的影響，探討CPT治療斑塊狀銀屑病可能的作用機制。方法將HaCaT細胞分為常氧組（21%O2點）和低氧（2%O2點）組，培養(yǎng)12 h，實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測CCL20 mRNA的相對表達，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）Kit測定細胞培養(yǎng)上清中CCL20表達；將12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 nmol/L的CPT作用低氧誘導12 h的HaCaT細胞，ELISA Kit測定細胞培養(yǎng)上清中CCL20表達。結果常氧組和低氧組培養(yǎng)12 h，HaCaT細胞CCL20 mRNA表達(ΔCT值)分別為-15.19±0.13和-13.70±0.10，兩組間表達差異有統(tǒng)計學意義（t=-14.430，P=0.001）；低氧培養(yǎng)12 h后HaCaT細胞（1×105個細胞）較常氧組CCL20蛋白表達增多，分別為（112.18±28.66）pg/ml、（64.36±47.85）pg/ ml，但兩組間表達差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.485，P=0.212）；100.0、200.0 nmol/L CPT處理低氧誘導12 h的HaCaT細胞（1×105個細胞）CCL20的表達分別為（64.35±19.70）pg/ml、（74.35 ±23.85）pg/ml，溶媒對照組為（112.18±28.66）pg/ml，組間多重比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論低氧可誘導HaCaT細胞CCL20mRNA表達增加；100.0、200.0 nmol/LCPT可抑制HaCaT細胞CCL20蛋白的表達。

銀屑病；喜樹堿；趨化因子配體20 ；細胞低氧；HaCaT細胞

尋常性斑塊狀銀屑病角質形成細胞（KC）過度增生、炎癥因子聚集、耗氧量增加，造成皮損局部微環(huán)境缺氧，可誘發(fā)多種前炎癥因子的釋放，如白細胞介素（IL）-8、低氧誘導因子（HIF）-1α等，進一步加重皮損炎癥反應[1]。文獻報道低氧誘導下人外周血單核細胞趨化因子配體（CCL20）mRAN表達升高[2]，推測銀屑病皮損局部低氧狀態(tài)可能對角質形成細胞CCL20的表達產生影響；在幼年特發(fā)性關節(jié)炎中，其滑膜液單核細胞HIF-1α蛋白的表達與CCL20 mRAN表達呈明顯正相關[3]；筆者前期研究發(fā)現，喜樹堿（CPT）可在一定濃度抑制低氧誘導人永生化角質形成細胞（HaCaT細胞） HIF-1α蛋白的表達[4]。本實驗進一步觀察低氧及CPT對HaCaT細胞CCL20表達的影響。

1　材料與方法

1.1材料及主要試劑

CPT相對分子質量348.36，含量＞95%（日本東京化成工業(yè)公司），4 ℃保存。HaCaT細胞系來源于第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院中心實驗室。二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma-Aldrich公司），胰酶（以色列bioind公司）、DMEM培養(yǎng)基（美國Coring公司），胎牛血清（德國PAN-Biotech GmbH公司）。 CCL20 ELISA kit（武漢BOSTER生物有限公司）。聚合酶鏈反應（PCR）引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及低氧處理HaCaT細胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)，取對數生長期的細胞用于各項實驗。以2%O2、5%CO2和93%N2對HaCaT細胞進行低氧誘導。

1.2.2藥物處理及分組CPT以DMSO溶解后-20℃避光保存，CPT儲備濃度5 mg/ml。使用時用DMEM培養(yǎng)液稀釋成工作濃度，DMSO的終濃度＜0.1%。將HaCaT細胞分為實驗組和溶媒組，實驗組加CPT+含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，即CPT的終濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 nmol/L；溶媒組（對照組）為含DMSO的DMEM培養(yǎng)液。

1.2.3實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測CCL20 mRNA的表達實驗分為常氧組和低氧組，處理時間均為12 h，收集各組細胞，采用Trizol一步法。常規(guī)方法提取RNA，按RT-PCR反轉錄試劑盒說明書要求進行反轉錄，并建立PCR反應體系。各組均取1 μl cDNA作為PCR反應模板，加入SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10 μl及上、下游引物（濃度5 μmol/L）各1 μl，最后加無DNsae-RNsae水至總體積20 μl。PCR反應條件：95 ℃預變性 30 s，95 ℃變性 15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸 15 s，共40個循環(huán)，于每個循環(huán)延伸段采集熒光信號。以β-肌動蛋白為內參照基因，計算目的基因的相對定量△Ct值，及依此進行統(tǒng)計學分析。引物序列：CCL20上游引物5'-TGCTCTTCCTTGCTTTGGCATGGGTA-3'，下游引物5'-TCTGTGCAGTGATGTGCAGGTGAAGC-3'。β-肌動蛋白上游引物5'-AGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3'，下游引物5'-ACCATCACGCCCTGGTGCCT-3'。

1.2.4ELISA kit 檢測CCL20蛋白的表達實驗組HaCaT細胞加入含有不同濃度的CPT（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 nmol/L），以溶媒組為對照，低氧誘導12 h，收集各組細胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA kit說明書配制不同濃度標準品，根據預實驗將上清以1∶2稀釋，嚴格按照操作程序，以零孔為對照，以標準品的吸光值得出計算公式，將上清測定的吸光值代入公式的計算結果×2，即上清中每毫升CCL20含量。

1.3統(tǒng)計學方法

用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以xˉ ±s表示，用Levene檢驗方差齊性，采用兩獨立樣本t 檢驗，兩因素方差分析，組間多重比較SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1常氧和低氧下HaCaT細胞CCL20mRNA和CCL20蛋白的表達（表1）

常氧組和低氧組培養(yǎng)12 h后，HaCaT細胞CCL20 mRNA表達（ΔCt值）分別為：-15.19±0.13、-13.70 ±0.10，兩組間表達差異有統(tǒng)計學意義（Levene檢驗：F=1.022，P=0.387；t =-14.430，P=0.001）。

低氧組培養(yǎng)12 h后HaCaT細胞較常氧組CCL20蛋白的表達量有增多趨勢，分別為：（112.18±28.66）[pg/ (ml·1×105個細胞)]、（64.36±47.85）[pg/(ml·1×105個細胞)]，但兩組間表達差異無明顯統(tǒng)計學意義（Levene檢驗：F=1.457，P=0.294；t =1.485，P=0.212）。

表1　不同氧壓處理 HaCaT細胞12 h的CCL20mRNA和CCL20蛋白表達（xˉ ±s）

2.2CPT對低氧誘導HaCaT細胞CCL20蛋白表達的影響

不同濃度CPT（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 nmol/L）作用于低氧誘導的 HaCaT細胞12 h，細胞培養(yǎng)液上清CCL20表達（1×105個細胞）分別為：（140.35±26.33）pg/ml、（161.27±34.41）pg/ml、（161.27±34.41)pg/ml、（64.35±19.70）pg/ml、（74.35 ±23.85）pg/ml；其中100.0、200.0 nmol/L藥物濃度組與其余各藥物組及溶媒組(112.18±28.65) pg/ml比較CCL20表達下降，組間多重比較其差異有統(tǒng)計學意義（Levene檢驗：F=2.319，P=0.108； F=4.718，P=0.013；P＜0.05）（表2、圖1）。

表2　不同濃度CPT對低氧誘導12 h HaCaT細胞CCL20表達的影響?。▁ˉ ±s）

圖1　不同濃度CPT處理低氧誘導12 h HaCaT細胞培養(yǎng)液上清中CCL20的表達

3　討論

趨化因子是一類可誘導的、相對分子質量為7 000～10 000的促炎細胞因子，可通過與相應受體結合對淋巴細胞、中性粒細胞等產生趨化作用，在免疫炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。CCL20又稱CC亞族趨化因子配體20，正常皮膚中CCL20表達水平非常低，銀屑病皮損表皮基底層卻高表達；與特應性皮炎比較，CCL20 mRNA在皮損中的表達明顯增多；多種炎癥因子如干擾素（INF）-γ、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-17可誘導角質形成細胞（KC）高表達CCL20，趨化CCR6陽性表達的Th17、γδT、樹突狀細胞向皮損聚集，提示KC分泌趨化因子CCL20在銀屑病發(fā)病中有著重要的作用[5,6]。KC受到多種危險信號的刺激可以產生抗菌肽、防御素等免疫分子，啟動免疫應答；受到損傷的KC會產生高水平的趨化因子CCL20[7]。慢性斑塊狀銀屑病皮損中的低氧微環(huán)境亦可能對KC細胞產生作用。因此筆者觀察低氧刺激對HaCaT細胞CCL20表達的影響，對探討斑塊狀銀屑病皮損的免疫病理學機制有一定的意義。

本實驗低氧誘導12 h，HaCaT細胞CCL20 mRNA表達較常氧條件下明顯升高；CCL20蛋白的表達量有增多趨勢； 提示低氧刺激可在轉錄水平明顯增加HaCaT細胞CCL20的表達，并對細胞分泌CCL20蛋白產生影響。推測在慢性斑塊狀銀屑病中，KC過度增生造成局部低氧環(huán)境可促使CCL20的表達，加重銀屑病的免疫反應。

0.03%CPT軟膏作為外用中成藥治療慢性斑塊狀銀屑病，療效和0.02%丙酸氯倍他索霜類似[8]，其機制尚未完全明確。筆者前期研究表明，100.0、200.0 nmol/L CPT可顯著抑制低氧誘導12 h HaCaT細胞HIF-1α蛋白的表達[4]。Bosco 等[3]在幼年特發(fā)性關節(jié)炎的滑膜液單核細胞中發(fā)現HIF-1α蛋白高表達；并將滑膜液單核細胞以1%O2和20%O2進行低氧和常氧交替處理，時間均為16 h，CCL20 mRAN和HIF-1α蛋白表達變化趨勢同步。本實驗中發(fā)現，不同濃度CPT（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 nmol/L）作用于低氧誘導的 HaCaT細胞12 h，在HIF-1α蛋白未明顯抑制的濃度組（12.5、25.0、50.0 nmol/L），CCL20蛋白分泌漸增加，在HIF-1α蛋白表達受到抑制的藥物濃度組（100.0、200.0 nmol/L），CCL20表達明顯下降，100.0、200.0 nmol/L濃度組間CCL20蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義；提示HIF-1α蛋白與CCL20 mRNA/蛋白的表達調控可能存在相關性，一定濃度CPT可抑制HaCaT細胞CCL20的分泌。喜樹堿可能對KC產生類似作用。然而，喜樹堿對人KC是否產生類似作用需進一步研究。

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（本文編輯耿建麗）

Effects of camptothecin on the expression of CCL20 in HaCaT cells under hypoxia

ZHANG Liang-yu，GUO Man-ying，WANG Xiang，et al
Department of Dermatology, 98th Hospital of PLA, Huzhou 313000, China

ObjectiveTo investigate the influence of camptothecin (CPT) on the expressions of CCL20 in HaCaT cells under hypoxia, so as to investigate the possible mechanism of CPT in the treatment of plaque psoriasis. MethodsHaCaT cells were cultured respectively in normoxia and hypoxia condition for 12 hours, the CCL20 mRNA expressions were detected by real-time PCR, the secretions of CCL20 protein were detected by ELISA kit. HaCaT cells were divided into five groups and treated with different nanomolar (12.5, 25, 50, 100, 200 nmol/L) of CPT, the five groups were cultured in hypoxia condition for 12 hours, the secretions of CCL20 protein were detected by ELISA kit. ResultsThere were significantly difference in the expression levels of CCL20 mRNA (given in ΔCT value) between the normoxia group and the hypoxia group (-15.19±0.13 vs -13.70±0.10 t=?14.430, P=0.001). The CCL20 protein secretion of HaCaT cells (1×105cells) were increased which cultured in hypoxia for 12 hours, however, there were no significantly difference in the CCL20 protein secretion of HaCaT cells (1×105cells) between the normoxia group and the hypoxia group [(112.18±28.66) pg/ml, (64.36±47.85)pg/ml, t=?1.485, P=0.212]. Hypoxia inducible for 12 hours, CPT of 100, 200 nmol/L significantly decreased the secretion of CCL20 protein (1×105cells) compared with the vehicle control group [(64.35±19.70) pg/ml, (74.35±23.85) pg/ml vs(112.18±28.66)pg/ml, P＜0.05]. ConclusionThe CCL20 mRNA expression of HaCaT cell is up-regulated in hypoxia, CPT of 100, 200 nmol/L can reduce the secretion of CCL20 protein.

Psoriasis；Camptothecin；CCL20；Cell hypoxia；HaCaT cells [J Pract Dermatol, 2016, 9(2):95-97]

R758.63

A

1674-1293(2016)02-0095-03

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160204

南京軍區(qū)醫(yī)學科技創(chuàng)新重點項目（12Z03）；全軍醫(yī)學科技青年培育項目（13QNP045）

313000 湖州，解放軍第九八醫(yī)院皮膚科（張梁宇，王翔，陸亞琪，朱曉楊，郝陽陽，陳楊）；解放軍第九八醫(yī)院檢驗科（郭滿盈）

張梁宇，主治醫(yī)師，E-mail: zlyu98@163.com

陳楊，E-mail: 98cy@163.com

（2015-10-25

2015-12-30）