林嘉麟，施靜雯，2，劉學強，余杰，徐彬，2

（1廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣州510006；2廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室）

耐藥腫瘤細胞中ClC-3、P-gp的表達變化及相關(guān)性

林嘉麟1，施靜雯1，2，劉學強1，余杰1，徐彬1，2

（1廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣州510006；2廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室）

目的 觀察電壓門控氯通道3（ClC-3）、P-糖蛋白（P-gp）在耐藥腫瘤細胞中的表達變化，并探討其相關(guān)性。方法 提取人肝癌細胞株BEL-7402及其氟尿嘧啶耐藥株BEL-7402／FU、人結(jié)腸癌細胞株HCT-8及其紫杉醇耐藥株HCT-8／T的總RNA和蛋白，用熒光定量PCR法檢測細胞ClC-3和多藥耐藥基因1（MDR1）mRNA的表達，Western blotting法檢測細胞ClC-3和P-gp蛋白的表達，采用線性相關(guān)分析ClC-3和P-gp蛋白表達的相關(guān)性。結(jié)果

耐藥細胞BEL-7402／FU和HCT-8／T中ClC-3和P-gp的mRNA和蛋白水平都明顯高于相對應的非耐藥細胞BEL-7402和HCT-8（P均＜0.05），在耐藥腫瘤細胞中，ClC-3與P-gp蛋白表達呈正相關(guān)（r＝0.98，P＜0.05）。結(jié)論ClC-3、P-gp在耐藥腫瘤細胞中呈高表達，二者表達水平呈正相關(guān)關(guān)系。

肝腫瘤；結(jié)腸腫瘤；電壓門控氯通道3；P-糖蛋白；腫瘤細胞；耐藥性

電壓門控氯通道3（ClC-3）普遍存在于哺乳動物細胞中，可能是容積激活性氯通道的通道蛋白或調(diào)節(jié)者［1］，對維持細胞增殖和分化等多種生理功能發(fā)揮重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌、乳腺癌和膀胱癌組織中ClC-3的表達都遠高于正常組織［2，3］。在腫瘤化療應用過程中，多藥耐藥是制約化療成功的主要原因之一。P-糖蛋白（P-gp）是多藥

耐藥基因1（MDR1）的蛋白產(chǎn)物，同時，P-gp也與容積激活性氯通道密切相關(guān)，參與了該通道的調(diào)控［4，5］。ClC-3與P-gp之間也可能有密切關(guān)系。2014年10月～2015年4月，本研究觀察耐藥和非耐藥腫瘤細胞中ClC-3和P-gp的表達變化，并探討二者的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞非耐藥株BEL-7402、人結(jié)腸癌細胞非耐藥株HCT-8（本實驗室保存），人肝癌氟尿嘧啶耐藥株BEL-7402／FU、人結(jié)腸癌紫杉醇耐藥株HCT-8／T（南京凱基生物公司），胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司），總RNA提取試劑TRIzol（美國Invitrogen公司），ClC-3、MDR1、β-actin引物（上海英濰捷基公司），細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、小鼠抗人GAPDH單抗、HRP標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗（碧云天生物技術(shù)研究所），兔抗人ClC-3多抗（英國Abcam公司），兔抗人P-gp多抗（美國GeneTex公司），化學發(fā)光試劑和PVDF膜（美國Bio-Rad公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒（廣州美津生物技術(shù)有限公司）。

1.2細胞培養(yǎng) BEL-7402、HCT-8、BEL-7402／FU和HCT-8／T均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，BEL-7402／FU加氟尿嘧啶20 μg／mL，HCT-8／T加入紫杉醇1 μg／mL，于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3腫瘤細胞中ClC-3、MDR1 mRNA表達檢測采用熒光定量PCR法。收集對數(shù)生長期的4種細胞，按TRIzol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提取細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，應用熒光定量PCR試劑盒進行擴增。ClC-3上游引物5′-TTGCCTACTATCACCACGAC-3′，下游引物5′-GCATCTCCAACCCATTTACT-3′；MDR1上游引物5′-CAGAGGGGATGGTCAGTGTT-3′，下游引物5′-CGTGGTGGCAAACAATACAG-3′；β-Actin作為內(nèi)參照，上游引物5′-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3′，下游引物5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。PCR反應體系：THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 10 μL，上下游引物各2 μL，cDNA模板3 μL。反應條件：95℃60 s、95℃15 s、60℃15 s、72℃45 s，共40個循環(huán)。應用Bio-Rad MiniOpticonTM System進行數(shù)據(jù)分析，以2-ΔΔCt公式計算目的基因的相對表達量。

1.4腫瘤細胞中ClC-3、P-gp蛋白表達檢測 采用Western blotting法。細胞培養(yǎng)至80%融合時，棄培養(yǎng)上清液，用冰冷的PBS漂洗細胞兩次，加入細胞裂解液冰上裂解10 min，離心取上清液，蛋白濃度用BCA法測定，蛋白用10%SDS-PAGE電泳分離，并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入ClC-3和P-gp兔抗人多抗及GADPH小鼠抗人單抗，4℃孵育過夜；TBS洗膜后，加入相應二抗室溫孵育2 h；TBS洗膜，加入化學發(fā)光試劑，X線膠片曝光、顯影和定影；掃描膠片，采用Image J軟件分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值之比表示ClC-3和P-gp的蛋白相對表達量。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；采用線性相關(guān)分析耐藥腫瘤細胞中ClC-3與P-gp表達水平的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1各類細胞中ClC-3、MDR1 mRNA表達比較

耐藥細胞BEL-7402／FU、耐藥細胞HCT-8／T中ClC-3、MDR1 mRNA相對表達量均高于相對應的非耐藥細胞BEL-7402、非耐藥細胞HCT-8（P均＜0.05）。見表1。

表1　各類細胞中ClC-3、MDR1 mRNA相對表達量比較（±s）

表1　各類細胞中ClC-3、MDR1 mRNA相對表達量比較（±s）

注：與BEL-7402比較，*P＜0.05；與HCT-8比較，＃P＜0.05。

細胞類型ClC-3 mRNAMDR1 mRNA BEL-7402／FU4.68±0.42*3.25±0.31*HCT-8／T7.26±0.37＃4.36±0.29＃BEL-74021.00±0.001.00±0.00 HCT-81.00±0.001.00±0.00

圖1　各類細胞中ClC-3、P-gp蛋白表達水平

2.2各類細胞中ClC-3、P-gp蛋白表達比較 耐藥細胞BEL-7402／FU、耐藥細胞HCT-8／T中ClC-3、P-gp蛋白相對表達量均高于相對應的非耐藥細胞BEL-7402、非耐藥細胞HCT-8（P均＜0.05）。見圖1、表2。

表2　各類細胞中ClC-3、P-gp蛋白相對表達量比較（±s）

表2　各類細胞中ClC-3、P-gp蛋白相對表達量比較（±s）

注：與BEL-7402比較，*P＜0.05；與HCT-8比較，＃P＜0.05。

細胞類型ClC-3P-gp BEL-7402／FU1.05±0.06*0.45±0.05*HCT-8／T1.20±0.07＃0.61±0.04＃BEL-74020.40±0.050.21±0.04 HCT-80.18±0.030.10±0.02

2.3耐藥腫瘤細胞中ClC-3與P-gp蛋白表達的相關(guān)性 在耐藥腫瘤細胞中，ClC-3與P-gp蛋白表達呈正相關(guān)（r＝0.98，P＜0.05）。

3　討論

ClC-3是電壓門控性氯離子通道家族的成員，近年來研究發(fā)現(xiàn)，其不僅參與細胞增殖、分化和遷移等生理過程，在腫瘤細胞的生命活動中也起著重要作用［6］。研究發(fā)現(xiàn)，ClC-3參與了紫杉醇誘導的鼻咽癌細胞CNE-2Z早期凋亡的過程［7］。過表達ClC-3能顯著抑制毒胡蘿卜內(nèi)酯誘導的鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞凋亡，下調(diào)ClC-3的表達則促進細胞凋亡［8］。ClC-3可不依賴于其離子通道屬性促進與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的細胞膜皺褶形成，在腫瘤轉(zhuǎn)移中扮演關(guān)鍵性的角色［9］。本研究結(jié)果顯示，肝癌和結(jié)腸癌細胞中都表達ClC-3，而且耐藥細胞株的表達水平明顯高于非耐藥細胞株。應用siRNA抑制ClC-3的表達，可抑制人膠質(zhì)瘤U251細胞自噬而增強順鉑對細胞的毒性［10］；相反，當順鉑作用于穩(wěn)定增加ClC-3表達的宮頸癌細胞HeLa時，對該細胞增殖的抑制作用顯著降低［11］?？梢?，多種組織來源腫瘤的研究結(jié)果都顯示ClC-3高表達在誘導腫瘤細胞耐藥中起重要作用。

目前癌癥治療失敗的原因主要在于腫瘤的轉(zhuǎn)移，其次就是腫瘤耐藥［12］，而多藥耐藥則是大部分腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性的主要機制。P-gp是MDR1編碼的胞膜糖蛋白，當藥物進入細胞后，同藥物分子結(jié)合，同時其ATP位點結(jié)合ATP后釋放能量使藥物轉(zhuǎn)移到細胞外，從而使細胞內(nèi)藥物濃度始終維持在低水平，由此獲得耐藥性［13］。本研究證實，肝癌和結(jié)腸癌的耐藥細胞株MDR1基因及其表達產(chǎn)物P-gp的表達水平均明顯高于非耐藥細胞株，故認為高表達P-gp是其產(chǎn)生耐藥的原因。耐藥細胞同時高表達ClC-3和P-gp，且ClC-3和P-gp的表達呈正相關(guān)，說明兩者之間可能是一種正向調(diào)控，但究竟是ClC-3還是P-gp處于調(diào)控的上游，需進行進一步研究。

綜上所述，ClC-3在腫瘤細胞耐藥中起重要作用，可能與調(diào)控P-gp的表達有關(guān)，但其確切的調(diào)控方式有待于進一步研究探討。

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ClC-3 and P-gp expression and their correlation in drug-resistant tumor cells

LIN Jialin1，SHI Jingwen，LIU Xueqiang，YU Jie，XU Bin

（1 Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To observe the expression changes of voltage-gated chloride channel 3（ClC-3）and P-glycoprotein（P-gp）in drug-resistant tumor cells，and to explore their correlation.Methods Total RNAs and proteins were isolated from human hepatic cancer cell line BEL-7402 and fluorouracil-resistant cell line BEL-7402／FU，human colonic cancer cell line HCT-8 and paclitaxel-resistant cell line HCT-8／T.The expression levels of ClC-3 and multidrug resistance 1（MDR1）mRNAs were assessed by real-time fluorescence quantitative PCR，the expression levels of ClC-3 protein and P-gp were determined by Western blotting.Linear correlational analysis method was used to analyze the correlation of ClC-3 protein and P-gp.Results With regarded to comparison between BEL-7402 and BEL-7402／FU as well as between HCT-8 and HCT-8／T，the expression levels of MDR1 and ClC-3 mRNA and P-gp and ClC-3 protein were significantly higher in drug-resistant cells than non-resistant cells（all P＜0.05）.ClC-3 protein and P-gp expression levels were positively correlated with each other（r＝0.98，P＜0.05）.Conclusion The ClC-3 and P-gp is highly expressed in drug-resistant tumor cells，and their expression levels are positively correlated.

liver neoplasms；colonic neoplasms；voltage-gated chloride channel 3；P-glycoprotein；tumor cells；drug resistance

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.005

R73-3

A

1002-266X（2016）21-0013-03

國家自然科學基金資助項目（81101666）。

林嘉麟（1991-），男，碩士，主要研究方向為氯離子通道與腫瘤耐藥。E-mail：galuen＠sina.com

簡介：徐彬（1975-），女，副教授，博士，主要研究方向為離子通道轉(zhuǎn)化醫(yī)學。E-mail：xubin2003＠163.com

（2016-01-14）