高晨陽++吳雨龍++江海濤++汪振炯++王仁雷++華春

摘要：以急性毒性試驗(yàn)和亞慢性毒性試驗(yàn)研究蛹蟲草基質(zhì)多糖（Cordyceps militaris stroma polysaccharides，CMSP）的安全性，急性毒性試驗(yàn)采用ICR小鼠120只，隨機(jī)分成6組，設(shè)空白對(duì)照組和不同劑量CMSP試驗(yàn)組（750、1 500、3 000、6 000、12 000 mg/kg）。亞慢性毒性試驗(yàn)采用SD大鼠80只，隨機(jī)分成4組，設(shè)空白對(duì)照組和低、中、高3個(gè)劑量CMSP試驗(yàn)組（150、300、600 mg/kg）。結(jié)果表明，在14 d的觀察中，急性毒性試驗(yàn)中各組小鼠未出現(xiàn)中毒癥狀和死亡情況，且灌胃劑量超過10 000 mg/kg。亞慢性毒性試驗(yàn)中，試驗(yàn)各組與空白對(duì)照組在體重增加、攝食量、血液指標(biāo)、血液生化指標(biāo)、尿常規(guī)、臟器指數(shù)及組織病理相比無明顯差異，由此可知，CMSP實(shí)際為無毒物，且對(duì)大鼠未觀察到有害作用水平為600 mg/（kg·d）。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草基質(zhì)多糖；急性毒性；亞慢性毒性

中圖分類號(hào)：S567.3+9；R114 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）18-4776-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.036

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又稱北蟲草，屬于子囊菌門的真菌。在東南亞地區(qū)，蛹蟲草常被作為中藥或滋補(bǔ)品使用，這主要因其與傳統(tǒng)名貴中藥冬蟲夏草有相似的活性成分和藥理作用[1，2]。據(jù)報(bào)道，蛹蟲草富含多種功能活性物質(zhì)，如蟲草多糖、蟲草素、抗菌和抗腫瘤的腺苷衍生物、抗真菌素、L-色氨酸等[3，4]。蛹蟲草多糖是蛹蟲草的主要活性物質(zhì)之一，純化的蛹蟲草多糖具有多種生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血脂、調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老等作用[5-9]。目前，蛹蟲草主要通過人工栽培進(jìn)行大量生產(chǎn)[10]，有研究表明收獲蛹蟲草后的廢基質(zhì)中的多糖含量約為子實(shí)體的2～4倍，同樣具有較好的抗氧化及保肝作用[11，12]。盡管蛹蟲草作為一種重要的藥食兩用的真菌被人們長(zhǎng)期廣泛地使用，但有關(guān)蛹蟲草基質(zhì)多糖安全性的研究尚未見報(bào)道。因此，為研制開發(fā)保健食品或天然藥物，有必要對(duì)蛹蟲草基質(zhì)多糖進(jìn)行系統(tǒng)的安全性評(píng)價(jià)。本研究通過急性毒性試驗(yàn)及亞慢性毒性試驗(yàn)對(duì)蛹蟲草基質(zhì)多糖進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，為蛹蟲草基質(zhì)多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草基質(zhì)多糖（Cordyceps militaris stroma polysaccharides，CMSP）由南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院食品工程研究室提供。

ICR小鼠，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）2012-0004，質(zhì)量18～25 g，揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。SD大鼠，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）2014-0001，質(zhì)量50～70 g，南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；臺(tái)式冷凍干燥機(jī)（美國(guó)LABCONCO公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)熱電公司）；NIKON 50i型生物顯微鏡（日本尼康公司）；全自動(dòng)血液分析儀（法國(guó)COMPACT公司）；AU5800型全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.3 方法

1.3.1 蛹蟲草基質(zhì)多糖的制備 準(zhǔn)確稱取5.0 g蛹蟲草基質(zhì)粉末于燒杯中，加入200 mL水，混勻，再加入2 000 U/mg的纖維素酶2.5 mL，調(diào)節(jié)pH到4.8，然后50 ℃水浴1.5 h，再轉(zhuǎn)移至80 ℃水浴2 h，然后再進(jìn)行超聲波（超聲40 Hz，100%輸出功率，溫度30 ℃）處理40 min，4 200 r/min離心10 min，收集上清液。將沉淀按上述步驟提取2次，將收集到的上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)到一定體積，采用Sevag法除蛋白質(zhì)，除去蛋白質(zhì)后的溶液用95%的乙醇在4 ℃冰箱中醇沉過夜，經(jīng)抽濾，濃縮，經(jīng)DE-52柱層析及Sephadex G-100凝膠柱層析，收集多糖液，經(jīng)濃縮，冷凍干燥得蛹蟲草基質(zhì)多糖。

1.3.2 經(jīng)口的小鼠急性毒性試驗(yàn) 取ICR小鼠120只，雌雄各半，體重18～25 g，在室溫22 ℃±3 ℃、濕度30%～70%、自由攝食、飲水的飼養(yǎng)條件下，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d 后，隨機(jī)分成6組，每組20只，其中第Ⅰ～Ⅴ組為試驗(yàn)組，第Ⅵ組為空白對(duì)照組，正式給藥前禁食8 h，不禁水。采用改良寇氏法[13]，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的劑量，Ⅰ～Ⅴ組分別以750、1 500、3 000、6 000、12 000 mg/kg，5個(gè)不同劑量組進(jìn)行灌胃染毒，分3次灌胃染毒溶解于蒸餾水中的蛹蟲草基質(zhì)多糖，每次間隔8 h?？瞻讓?duì)照組同樣分3次灌服相同體積的蒸餾水。染毒1 h后對(duì)小鼠的活動(dòng)情況進(jìn)行觀察，當(dāng)天需進(jìn)行多次密切觀察（特別染毒后4 h內(nèi)），以后每天注意觀察，連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠的進(jìn)食、活動(dòng)、大小便、精神等全身反應(yīng)狀況及死亡情況。分別在第1、7、14天時(shí)稱量各組小鼠體重。試驗(yàn)結(jié)束后，剖檢存活小鼠，觀察主要臟器是否有病變[13，14]。

1.3.3 經(jīng)口的大鼠亞慢性毒性試驗(yàn) 取SD大鼠80只，雌雄各半，體重50～70 g，在室溫26 ℃±4 ℃、濕度40%～60%、自由攝食、飲水的飼養(yǎng)條件下，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分成4組，每組20只，其中第Ⅰ～Ⅲ組為試驗(yàn)組，分為低、中、高三個(gè)劑量組，第Ⅳ組為空白對(duì)照組，正式給藥前禁食8 h，不禁水。Ⅰ～Ⅲ組分別以150（低劑量）、300（中劑量）、600 mg/（kg·d）（高劑量）的劑量每天經(jīng)口灌胃染毒1次，連續(xù)灌胃90 d。空白對(duì)照組灌服相同體積的蒸餾水。染毒期間，每天觀察大鼠的一般情況[包括被毛光澤、精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)、行為、體重變化（定期稱重）等]，并記錄。試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天（第90天），將大鼠放入代謝籠中，收集尿液，備檢。試驗(yàn)結(jié)束后（第91天），大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，測(cè)定血液常規(guī)指標(biāo)和血液生化指標(biāo)；快速處死大鼠后進(jìn)行剖檢，詳細(xì)檢查和記錄各臟器的眼觀變化，取心、肝、脾、肺、腎等臟器稱重，并計(jì)算臟器指數(shù)[14]。

臟器指數(shù)=■×100%

1.3.4 組織病理學(xué)研究 將取得的大鼠心、肝、脾、肺、腎等臟器用生理鹽水洗凈，擦干，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，鏡檢各組織切片的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±SD）表示，采用Spss 17.0軟件進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析法及t檢驗(yàn)法分析各組之間的差異，P<0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

在灌服不同劑量CMSP后，各組小鼠活動(dòng)正常，未出現(xiàn)豎毛、驚厥等癥狀。在觀察期內(nèi)，CMSP各劑量組小鼠被毛光滑有光澤，精神狀態(tài)較好，呼吸順暢，走動(dòng)正常，未出現(xiàn)搔鼻、尖叫、出汗、流涎等癥狀，眼、耳、鼻、口、生殖道未見有血性分泌物，與空白對(duì)照組小鼠比較狀態(tài)無明顯差異，未出現(xiàn)明細(xì)中毒癥狀。在1～14 d內(nèi)，每組小鼠體重明顯增加（包括空白對(duì)照組），但灌服CMSP的各組小鼠體重增加更明顯（圖1）。對(duì)試驗(yàn)組與空白對(duì)照組存活小鼠進(jìn)行病理剖檢，主要臟器未觀察到肉眼可見的病理變化。表明CMSP未對(duì)小鼠造成急性毒性作用。

2.2 亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 大鼠一般情況的觀察 在灌服不同劑量CMSP的90 d中，各組大鼠行為正常，正常采食和飲水，被毛光潔有色澤，眼、耳、鼻、口未見膿狀分泌物，精神狀態(tài)良好，大小便正常，生長(zhǎng)發(fā)育良好，均未出現(xiàn)明顯中毒癥狀。與空白對(duì)照組比較，試驗(yàn)組大鼠體重增長(zhǎng)無明顯差異（圖2）。表明CMSP未對(duì)大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育及體重增長(zhǎng)產(chǎn)生不良影響。

2.2.2 CMSP對(duì)大鼠尿液指標(biāo)的影響 在試驗(yàn)?zāi)┢?，分別收集雌雄大鼠尿液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示CMSP低、中、高各劑量組與空白對(duì)照組比較，未觀察到有明顯變化的指標(biāo)，且雌性大鼠與雄性大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)也無明顯差異（表1）。表明在90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)中，CMSP未引起大鼠的尿液指標(biāo)產(chǎn)生明顯變化。

2.2.3 CMSP對(duì)大鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響 在連續(xù)給藥90 d后，分別收集雌雄大鼠血液進(jìn)行分析。結(jié)果表明，CMSP低、中、高各劑量組對(duì)雌雄大鼠血液常規(guī)指標(biāo)無不良影響；CMSP各劑量組在白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)等血液指標(biāo)上與空白對(duì)照組相比無明顯差異（表2）。表明在90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)中，CMSP未對(duì)大鼠的各項(xiàng)血液常規(guī)指標(biāo)產(chǎn)生不良影響。

2.2.4 CMSP對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響 在連續(xù)給藥90 d后，分別收集雌雄大鼠血液經(jīng)離心得血漿進(jìn)行生化指標(biāo)分析，結(jié)果顯示CMSP低、中、高各劑量組對(duì)雌雄大鼠血液生化指標(biāo)無不良影響；CMSP各劑量組在谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、白蛋白、球蛋白等血液生化指標(biāo)上與空白對(duì)照組相比無明顯差異（表3）。表明在90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)中，CMSP未對(duì)大鼠的各項(xiàng)血液生化指標(biāo)產(chǎn)生不良影響。

2.2.5 CMSP對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響 在連續(xù)給藥90 d后，分別剖解雌雄大鼠臟器進(jìn)行稱重，計(jì)算臟器指數(shù)，結(jié)果見表4。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，除CMSP中劑量組雄性大鼠的脾臟指數(shù)外，CMSP低、中、高3個(gè)劑量組與空白對(duì)照組比較，臟器指數(shù)無顯著性差異。CMSP中劑量組雄性大鼠脾臟指數(shù)明顯高于空白對(duì)照組（P<0.05，表4），但CMSP高劑量組雄性大鼠脾臟指數(shù)與空白對(duì)照組相比無明顯差異，且CMSP中劑量組雌性大鼠脾臟指數(shù)與空白對(duì)照組相比無明顯差異。此外，CMSP低、中、高3個(gè)劑量組的其他臟器指數(shù)與空白對(duì)照組比較無明顯差異。表明在90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)中，CMSP未對(duì)大鼠的臟器指數(shù)產(chǎn)生不良影響。

2.2.6 組織病理學(xué)檢查 在連續(xù)給藥90 d后，分別剖解雌雄大鼠臟器進(jìn)行檢查，除了CMSP中劑量組部分雄性大鼠的脾臟有腫脹現(xiàn)象外，CMSP低、中、高3個(gè)劑量組與空白對(duì)照組的臟器均未發(fā)現(xiàn)明顯的病變。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，除CMSP中劑量組少數(shù)雄性大鼠脾臟出現(xiàn)與受試物（CMSP）不相關(guān)的改變外，其余各組動(dòng)物臟器均未出現(xiàn)明顯的病變（圖3）。

3 討論

蛹蟲草廢基質(zhì)中含有豐富的功能性物質(zhì)——多糖。多糖具有廣泛的藥理作用和保健作用，如具有抗氧化、抗腫瘤和保肝等作用[15-17]，但缺乏系統(tǒng)的毒理學(xué)研究。因此，有必要對(duì)蛹蟲草基質(zhì)多糖進(jìn)行毒理學(xué)評(píng)價(jià)。在毒理學(xué)評(píng)價(jià)系統(tǒng)中，急性毒性和亞慢性毒性是兩個(gè)重要的組成部分。一般情況下，受試物在經(jīng)過這兩種毒理學(xué)評(píng)價(jià)后就能使人們對(duì)該受試物的毒性有所了解。

急性毒性試驗(yàn)是研究和評(píng)價(jià)受試物安全性的第一步工作，通過急性毒性試驗(yàn)可了解動(dòng)物肌體一次較大劑量接觸受試物所產(chǎn)生的毒性特征和毒性強(qiáng)度，獲得受試物最基本的毒理學(xué)參數(shù)，為進(jìn)一步的毒性試驗(yàn)和毒理學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。本研究采用改良寇氏法，通過小鼠經(jīng)口給藥設(shè)計(jì)了急性毒性試驗(yàn)，檢測(cè)了蛹蟲草基質(zhì)多糖的急性毒性。在灌服CMSP劑量超過10 000 mg/kg的情況下，未引起小鼠死亡，未出現(xiàn)不良癥狀，未引起小鼠的體重和飲食的異常變化；剖檢存活小鼠后，未見心、肝、脾、肺、腎等主要臟器出現(xiàn)肉眼可見的明顯病變，根據(jù)中國(guó)食品毒理學(xué)經(jīng)口急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，CMSP屬于實(shí)際無毒物，不必測(cè)定其半數(shù)致死量（LD50）[13]。

亞慢性毒性試驗(yàn)是對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物較長(zhǎng)期接觸受試物所致生物學(xué)效應(yīng)的深入研究，是受試物安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)的必做試驗(yàn)，可獲得更多的毒理學(xué)信息和重要的毒理學(xué)參數(shù)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在90 d經(jīng)口的大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)中未出現(xiàn)大鼠死亡情況，未出現(xiàn)臨床不良癥狀。CMSP各劑量組大鼠在體重增長(zhǎng)方面雖然略高于空白對(duì)照組，但屬于正常變化范圍內(nèi)，不具有臨床意義。有研究表明許多中草藥提取物因具有藥理學(xué)作用如抗氧化性能夠增加身體重量[18，19]。

尿蛋白和尿葡萄糖是反應(yīng)腎臟功能的重要指標(biāo)。正常尿液中含少量小分子蛋白質(zhì)和微量的葡萄糖，普通尿常規(guī)檢查測(cè)不出，當(dāng)腎臟受損后，腎小球的濾過作用和腎小管的重吸收功能被破壞，蛋白質(zhì)和葡萄糖進(jìn)入尿液，導(dǎo)致尿中蛋白質(zhì)和葡萄糖含量增加，尿常規(guī)檢查可以測(cè)出，蛋白尿和糖尿是腎臟病的常見表現(xiàn)[20]。本研究結(jié)果顯示，CMSP各劑量組和空白對(duì)照組的尿蛋白和尿葡萄糖均為陰性，因此長(zhǎng)時(shí)間口服CMSP對(duì)大鼠腎臟無毒性作用。

血常規(guī)分析是最基本的血液檢驗(yàn)，主要是檢查血液方面的問題，如是否有感染，是否貧血，是否有血液疾病。由動(dòng)物試驗(yàn)獲得血液系統(tǒng)變化的數(shù)據(jù)對(duì)人類是否中毒具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值[21]。本研究結(jié)果顯示，CMSP各劑量組大鼠血常規(guī)指標(biāo)與空白對(duì)照組比較無顯著性差異，因此CMSP不影響大鼠的造血功能和白細(xì)胞的形成。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）是存在于動(dòng)物肝臟中的重要血清酶，是評(píng)價(jià)肝功能的重要指標(biāo)，臨床上常通過監(jiān)測(cè)其濃度來發(fā)現(xiàn)肝臟疾病。ALT是一種胞質(zhì)酶，在肝臟中濃度很高，AST是存在于肝組織的線粒體和胞漿中的酶，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，ALT和AST就會(huì)進(jìn)入血液，因此，血清中這兩種酶濃度升高是肝臟受到損害的一種應(yīng)答反應(yīng)[22，23]?？偰懠t素也影響著肝臟的各種功能，血清中總膽紅素的升高是肝臟受損的重要標(biāo)志，也可能是膽道梗阻的標(biāo)志[24]。據(jù)報(bào)道，血清蛋白水平的升高表明肝臟組織受損，而血清蛋白水平降低則反映肝臟慢性損傷[24，25]。本研究結(jié)果顯示，CMSP各劑量組在ALT、AST、總膽紅素及血清蛋白水平與空白對(duì)照組比較無明顯差異，因此CMSP不會(huì)引起肝毒性。此結(jié)果可以通過試驗(yàn)組與空白對(duì)照組肝臟的組織病理學(xué)檢查得到進(jìn)一步證明。腎功能可以通過血清中肌酐、尿酸、尿素氮、鈉、鉀、鈣及氯的水平來評(píng)估。肌酐是機(jī)體骨骼肌中磷酸肌酸分解代謝的有害物質(zhì)，當(dāng)腎功能受損時(shí)，血清中肌酐水平上升[26]。尿酸水平的升高主要是由于結(jié)晶體或結(jié)石堵塞尿路引起腎小管和腎實(shí)質(zhì)毒性作用的結(jié)果，過高的尿酸濃度會(huì)使腎臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生惡化[27]。本研究結(jié)果顯示，CMSP各劑量組在肌酐、尿酸、尿素氮、鈉等水平與空白對(duì)照組比較無明顯差異，因此CMSP不會(huì)引起中毒性腎損害。此結(jié)果同樣可以通過試驗(yàn)組與空白對(duì)照組腎臟的組織病理學(xué)檢查得到進(jìn)一步證實(shí)。

臟器指數(shù)在一定程度上可以反映受試物對(duì)臟器的影響，尤其是毒性的重要指標(biāo)[28]。本研究結(jié)果顯示，CMSP中劑量組雄性大鼠脾臟指數(shù)明顯高于空白對(duì)照組，因?yàn)樵摻M中有4只大鼠脾臟腫大，考慮原因可能是由于在飼養(yǎng)期間相互爭(zhēng)斗導(dǎo)致咬傷而引起的。另外，CMSP高劑量組雄性大鼠脾臟指數(shù)與空白對(duì)照組相比無明顯差異，且CMSP中劑量組雌性大鼠脾臟指數(shù)與空白對(duì)照組相比無明顯差異。此外，CMSP低、中、高3個(gè)劑量組的其他臟器指數(shù)與空白對(duì)照組比較無明顯差異。因此，CMSP未對(duì)大鼠的臟器指數(shù)產(chǎn)生不良影響。組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，除CMSP中劑量組有4只雄性大鼠脾臟腫大外，其余各組動(dòng)物臟器均未發(fā)現(xiàn)異常變化，說明CMSP安全無毒。

綜上所述，CMSP實(shí)際為無毒物，且對(duì)大鼠未觀察到有害作用水平為600 mg/（kg·d），具有較好的開發(fā)應(yīng)用前景。

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