宮春光+殷蕊+孫桂清+于清海+張玉茹+崔健斌

摘要：在水溫（18±0.5）℃、鹽度27‰的環(huán)境下，研究了重金屬Hg2+、Cu2+、Cd2+對(duì)渤海灣鹵蟲無節(jié)幼體的急性毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，Hg2+對(duì)渤海鹵蟲無節(jié)幼體24 h、48 h的LC50分別為201.01 mg/L和0.05 mg/L，安全濃度分別為2.01 mg/L和0.000 5 mg/L；Cu2+對(duì)渤海灣鹵蟲無節(jié)幼體24 h、48 h的LC50分別為197.17 mg/L和7.50 mg/L，安全濃度分別為1.97 mg/L和0.08 mg/L；Cd2+對(duì)渤海灣鹵蟲無節(jié)幼體24 h、48 h的LC50分別為331.30 mg/L和8.13 mg/L，安全濃度分別為3.31 mg/L和0.08 mg/L。毒性由強(qiáng)至弱依次為Hg2+>Cu2+>Cd2+，但Cu2+與Cd2+的毒性差異不明顯。

關(guān)鍵詞：渤海灣鹵蟲無節(jié)幼體；重金屬；急性毒性

鹵蟲（Brine Shrimp）俗稱豐年蟲，是一種廣鹽性低等甲殼生物，由于其營養(yǎng)豐富，因而也是一種海產(chǎn)魚蝦理想的餌料生物，由其冬卵孵化而來的無節(jié)幼體是多種人工馴化養(yǎng)殖的海水魚蝦（如大菱鲆、牙鲆、半滑舌鰨、中國對(duì)蝦等）幼體的活餌料生物。鹵蟲的生活習(xí)性和生理結(jié)構(gòu)決定了容易受到毒物的攻擊，所以常被用于環(huán)境物毒性的評(píng)價(jià)和生態(tài)毒理學(xué)研究，已被《海洋石油勘探開發(fā)污染物的生物毒性檢驗(yàn)方法》（GB 18420.2—2001）列為標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)生物[1]。

在我國銷售的各鹵蟲卵品系中，渤海灣鹵蟲卵是品質(zhì)最好的種類之一，其孵化的無節(jié)幼體營養(yǎng)豐富、活力強(qiáng)且持久，廣受海水魚蝦育苗者的歡迎。近幾年渤海灣沿岸鹵蟲養(yǎng)殖發(fā)展迅速，但隨著我國工業(yè)的快速發(fā)展和人們生活水平的提高，工業(yè)及生活污水的排放量也在逐漸增加，污染物的排放，尤其是污水中的重金屬污染物對(duì)鹵蟲的養(yǎng)殖業(yè)造成了很大影響。Hg2+、Cu2+、Cd2+是渤海中常見的重金屬污染物[2]，它們對(duì)渤海灣鹵蟲無節(jié)幼體的影響尚不得知，本實(shí)驗(yàn)意在研究這3種重金屬對(duì)渤海灣鹵蟲無節(jié)幼體的急性毒性效應(yīng)，以期為渤海灣鹵蟲的養(yǎng)殖及海洋污染物的生物毒性評(píng)價(jià)提供更多可行的觀測(cè)指標(biāo)。

1材料與方法

1.1材料

鹵蟲卵購自河北省唐山市豐南區(qū)，為河北鹽田（渤海灣）鹵蟲，所用鹵蟲無節(jié)幼體為孵化出2～3 h的I期鹵蟲無節(jié)幼體；HgCl2為貴州省銅仁化工研究所生產(chǎn)，含量99.5%，CuSO4和CdCl2均為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，含量≥99.0%，試驗(yàn)用水為人工配制海水，使用海水晶（天津市塘沽區(qū)海生海水晶廠出品）+雙蒸水配制而來，鹽度27‰，試驗(yàn)水溫模仿鲆鰈類苗種人工培育的中后期水溫，保持在（18±0.5）℃。

1.2方法

1.2.1鹵蟲無節(jié)幼體的孵化鹵蟲卵在實(shí)驗(yàn)前保存于冰箱冷凍室內(nèi)，孵化前24 h取出，置于陰涼處；模仿實(shí)際生產(chǎn)時(shí)鹵蟲卵的孵化操作，并從有利于鹵蟲卵整齊破膜角度出發(fā)，鹵蟲卵孵化前使用淡水浸泡2 h，而后在500 mL燒杯中加入0.2 g鹵蟲卵和400 mL配制海水，燒杯放入恒溫水浴鍋內(nèi)，保持孵化溫度在（28±0.5）℃。孵化期間采用自然光照，其中孵化開始的前6 h內(nèi)光照度在1 000～1 500 lx。搜集孵化2～3 h內(nèi)的無節(jié)幼體進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)期間不換水、不充氣、不投喂。

1.2.2實(shí)驗(yàn)溶液的配制使用分析天平稱取一定量的HgCl2、CuSO4、CdCl2，用雙蒸水溶解、稀釋至一定濃度作為藥物母液，試驗(yàn)時(shí)用藥物母液配制各實(shí)驗(yàn)組所需要的藥物濃度。

1.2.3預(yù)實(shí)驗(yàn)用250 mL燒杯，加入200 mL配制海水，適量藥物母液，混勻后，放入20只I期鹵蟲無節(jié)幼體，同一藥物組試驗(yàn)的所有燒杯均放入同一恒溫水浴鍋中，保持實(shí)驗(yàn)水溫在（18±05）℃，自然光照。實(shí)驗(yàn)期間不換水，不充氣，不投餌。24 h和48 h后解剖鏡下觀察死亡情況，以10 s內(nèi)鹵蟲無節(jié)幼體的附肢不動(dòng)為判斷其死亡的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)查閱相關(guān)資料并進(jìn)行多次測(cè)試實(shí)驗(yàn)，設(shè)置預(yù)實(shí)驗(yàn)濃度梯度為：Hg2+0.007、0022、0.037、148.00、222.00、444.00、3 922.00 mg/L， Cu2+ 0.025、0.038、0.064、635.00、76200、889.00、6 096.00 mg/L， Cd2+ 3.92、554、7.84、882.00、1 176.00、1 470.00 mg/L。每個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)濃度做一組平行試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)一個(gè)對(duì)照組，取平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)查明重金屬離子不引起死亡的最大濃度（ILL）和最小100%致死濃度（LC100）。

1.2.4急性毒性實(shí)驗(yàn)經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定3種重金屬離子的實(shí)驗(yàn)濃度范圍，按照等比級(jí)數(shù)設(shè)定7個(gè)濃度組，每組設(shè)3個(gè)平行， 1個(gè)對(duì)照，每個(gè)燒杯內(nèi)隨機(jī)放入20只I期鹵蟲無節(jié)幼體，實(shí)驗(yàn)條件與預(yù)實(shí)驗(yàn)條件保持一致， 24 h和48 h后解剖鏡下觀察死亡情況并及時(shí)清除死亡個(gè)體。實(shí)驗(yàn)重復(fù)一次，最終數(shù)據(jù)取平均值。

計(jì)算平均死亡率，再換算成概率單位，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)藥液質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)，求出概率單位與實(shí)驗(yàn)藥液質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)的回歸方程，求出各自的半數(shù)致死濃度（LC50）；安全濃度為 LC50×AF，其中AF為應(yīng)用系數(shù)，對(duì)于穩(wěn)定且又易于在生物體內(nèi)積累的污染物，其系數(shù)多選在0.01～0.05這個(gè)范圍內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)中重金屬離子屬于難分解、積累性強(qiáng)的物質(zhì)，AF值皆取0.01。

2結(jié)果與分析

2.2分析

本試驗(yàn)符合對(duì)照組死亡率<10%、在所有試驗(yàn)中死亡率出現(xiàn)≤37%和≥67%的各有1組、設(shè)立5個(gè)以上的濃度組等水生生物急性毒性試驗(yàn)的質(zhì)量控制要求，本試驗(yàn)每個(gè)濃度組設(shè)置了3個(gè)平行、2個(gè)重復(fù)，重復(fù)試驗(yàn)的毒性之比符合美國實(shí)驗(yàn)與材料學(xué)（ASTM）提出的“用同種稀釋水，同種毒物，同種試驗(yàn)方法得到的2次試驗(yàn)結(jié)果之比均小于2”的要求[3]。

2.2.1重金屬Hg2+、Cu2+、Cd2+對(duì)渤海灣鹵蟲無節(jié)幼體的急性毒性效應(yīng)本實(shí)驗(yàn)在水溫（18±0.5）℃、鹽度27‰的環(huán)境下，研究了重金屬Hg2+、Cu2+、Cd2+對(duì)渤海灣鹵蟲無節(jié)幼體的急性毒性效應(yīng)，得出3種重金屬離子24、48 h的LC50值及安全濃度。結(jié)果表明，Hg2+對(duì)渤海鹵蟲無節(jié)幼體24 h、48 h的LC50分別為201.01 mg/L和0.05 mg/L，安全濃度分別為2.01 mg/L和0000 5 mg/L；Cu2+對(duì)渤海灣鹵蟲無節(jié)幼體24 h、48 h的LC50分別為197.17 mg/L和7.50 mg/L，安全濃度分別為1.97 mg/L和0.08 mg/L；Cd2+對(duì)渤海灣鹵蟲無節(jié)幼體24 h、48 h的LC50分別為331.30 mg/L和8.13 mg/L，安全濃度分別為3.31 mg/L和0.08 mg/L。

2.2.2重金屬Hg2+、Cu2+、Cd2+對(duì)渤海灣鹵蟲無節(jié)幼體的毒性差異實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種重金屬對(duì)渤海灣鹵蟲無節(jié)幼體的毒性由強(qiáng)至弱依次為Hg2+>Cu2+>Cd2+。其中Hg2+的毒性最大，遠(yuǎn)高于Cu2+和Cd2+的毒性，48 h時(shí)分別比Cu2和Cd2+高出150倍和163倍，這與眾多文獻(xiàn)中（鹵蟲及貝類、小型魚類等其它生物的毒性實(shí)驗(yàn)）報(bào)道的趨勢(shì)結(jié)果基本一致。

但本次實(shí)驗(yàn)中，Cu2+的毒性與Cd2+基本相似，48 h時(shí)Cu2比Cd2+高出1.08倍，這與眾多文獻(xiàn)中報(bào)道的趨勢(shì)結(jié)果雖然相同，但差異不明顯。張宜奎等[4]在研究重金屬離子對(duì)文蛤的急性毒性效應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)Cu2+對(duì)文蛤的毒性大于Cd2+，暴露96 h高出110倍；李國基等[5]在研究重金屬離子對(duì)櫛孔扇貝稚貝成活的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)Cu2+對(duì)櫛孔扇貝稚貝的毒性遠(yuǎn)大于Cd2+；在對(duì)其他水生動(dòng)物急性毒性效應(yīng)上，也存在相同的規(guī)律，毒性由強(qiáng)至弱依次為Hg2+>Cu2+>Cd2+。李娜等[6]進(jìn)行了重金屬污染物對(duì)鹵蟲無節(jié)幼體的毒性研究，報(bào)道認(rèn)為48 h時(shí)Cu2對(duì)鹵蟲無節(jié)幼體的毒性比Cd2+高出7.12倍，區(qū)別是李娜等人實(shí)

驗(yàn)時(shí)所采用的鹵蟲卵屬于新疆艾比湖品種，實(shí)驗(yàn)水溫為（27±0.5）℃；本次實(shí)驗(yàn)所采用的鹵蟲卵屬于渤海灣品種，實(shí)驗(yàn)水溫為（18±0.5）℃，這其中是否與毒性差異有直接關(guān)聯(lián)尚有待進(jìn)一步研究。

2.2.3重金屬Hg2+、Cu2+、Cd2+對(duì)渤海灣鹵蟲無節(jié)幼體急性毒性機(jī)理的初步探討本次實(shí)驗(yàn)中，渤海灣鹵蟲無節(jié)幼體對(duì)3種重金屬離子在暴露24 h時(shí)的反應(yīng)極不敏感，但在暴露48 h時(shí)卻表現(xiàn)出極為敏感。例如在暴露Hg2+溶液24 h時(shí)，濃度48.100 mg/L的實(shí)驗(yàn)組無節(jié)幼體才剛剛出現(xiàn)死亡（死亡率5%），但暴露48 h時(shí)，濃度0599 mg/L的實(shí)驗(yàn)組無節(jié)幼體已全部死亡（死亡率100%）；在暴露Cu2+溶液24 h時(shí)，濃度95959 mg/L的實(shí)驗(yàn)組無節(jié)幼體才剛剛出現(xiàn)死亡（死亡率5%），但暴露48 h時(shí)，濃度12.240 mg/L的實(shí)驗(yàn)組無節(jié)幼體已死亡90%；Cd2+實(shí)驗(yàn)組的變化趨勢(shì)也相類似。

分析認(rèn)為出現(xiàn)這種情況的原因可能與鹵蟲無節(jié)幼體的生理特點(diǎn)有關(guān)。孫建華等[7]的報(bào)道認(rèn)為，初孵無節(jié)幼體由于40 h才開始攝食，在此期間完全依靠卵黃維持生命活動(dòng)，對(duì)水環(huán)境的變化不敏感，對(duì)藥物的耐受力相對(duì)較強(qiáng)；等40 h后幼體開始攝食，雖然攝食量較少，但與水環(huán)境開始接觸，器官開始發(fā)育，對(duì)水環(huán)境的變化開始敏感。本次實(shí)驗(yàn)采用孵化后2～3 h的I期鹵蟲無節(jié)幼體，在實(shí)驗(yàn)24 h時(shí)無節(jié)幼體仍處于內(nèi)源性營養(yǎng)階段，因此對(duì)外界環(huán)境中的重金屬敏感性較差，而實(shí)驗(yàn)48 h時(shí)已開始器官發(fā)育，對(duì)外界環(huán)境敏感性增強(qiáng)，因而出現(xiàn)了這種現(xiàn)象。

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