張吉麗+司鴻飛+李冰+程富勝+周緒正+張繼瑜

摘要：為了對(duì)五氯柳胺混懸劑的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，采用簡(jiǎn)化寇氏法進(jìn)行了大鼠的急性毒性研究。首先通過(guò)預(yù)試驗(yàn)的最小致死劑量（LD100）和最大耐受劑量（LD0）確定給藥劑量及試驗(yàn)分組。灌胃給藥，觀察7 d， 記錄死亡數(shù)，計(jì)算LD50及95%的置信區(qū)間。結(jié)果表明，五氯柳胺混懸劑對(duì)大鼠的急性毒性LD50為3.333 g/kg，95%的置信區(qū)間為3.084 6～3.600 8 g/kg。表明如按照化學(xué)藥物劑量分級(jí)，五氯柳胺混懸劑可認(rèn)定為低毒物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：五氯柳胺混懸劑；大鼠；急性毒性；LD50

中圖分類號(hào)：S855.9；S859.79+5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）20-5313-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.036

Abstract： A acute toxicity test of oxyclozanide suspension on rats was taken to evaluate its safety by simplified Karbers method. The dosage and grouping were determined based on the minimum lethal dose（LD100） and the maximum tolerated dose（LD0） in preliminary experiment. The rats were gavaged with oxyclozanide suspension and observed seven days. The number of deaths was recorded for calculating the LD50（lethal dose 50%） and the 95% confidence limit. The results showed that the acute toxicity LD50 of Oxyclozanide suspension on rats was 3.333 g/kg，95% confidence limit ranges was from 3.084 6 g/kg to 3.600 8 g/kg. It indicated that the oxyclozanide suspension was low-toxic drug according to chemically drug classification.

Key words： oxyclozanide suspension； rats； acute toxicity； LD50

肝片吸蟲(chóng)?。‵ascioliasis hepatica）是由肝片吸蟲(chóng)引起的食源性的人畜共患病。該病遍及歐洲、亞洲、非洲、美洲和大洋洲等區(qū)域[1]。患病動(dòng)物出現(xiàn)消瘦、貧血、使役能力下降、乳牛產(chǎn)奶量降低等癥狀，嚴(yán)重阻礙了畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，對(duì)保障食品安全、公共衛(wèi)生安全和環(huán)境生態(tài)安全構(gòu)成了極大的威脅，同時(shí)也造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2，3]。目前對(duì)肝片吸蟲(chóng)的防治與其他蠕蟲(chóng)一樣，主要依靠化學(xué)藥物進(jìn)行控制。五氯柳胺混懸劑為水楊酰苯胺類化學(xué)合成類抗吸蟲(chóng)藥物，主要用于抗牛、羊的肝片吸蟲(chóng)感染，對(duì)絳蟲(chóng)和線蟲(chóng)也有較好的治療效果[4]。它可以抑制蟲(chóng)體線粒體中氧化磷酸化過(guò)程，阻礙能量（ATP）生成，使蟲(chóng)體因能量耗盡而死[5]。國(guó)外對(duì)于五氯柳胺的研究較早，特別是在印度、英國(guó)、美國(guó)等寄生蟲(chóng)感染的高發(fā)病地區(qū)，已有大量研究表明該藥具有較好的驅(qū)蟲(chóng)效果，應(yīng)用十分廣泛[6-8]。但由于該藥不溶于水，國(guó)內(nèi)并未對(duì)該藥進(jìn)行系統(tǒng)性研究，相關(guān)報(bào)道較少。筆者制備了五氯柳胺混懸劑，前期試驗(yàn)解決了制備工藝問(wèn)題以及臨床方便給藥、儲(chǔ)藏運(yùn)輸?shù)葘?shí)際需求。本試驗(yàn)以大鼠為試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行五氯柳胺混懸劑的急性毒性試驗(yàn)，旨在為指導(dǎo)臨床科學(xué)、安全地使用該混懸劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠110只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。體重在180～220 g，雌雄各半，雌性未產(chǎn)未孕。試驗(yàn)前飼養(yǎng)3～5 d，以適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境。

藥品：五氯柳胺混懸劑，由農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。試驗(yàn)前，精密稱定處方中主藥及輔料，配制成0.209 g/mL的混懸劑，待用。按照處方中各輔料的用料配比，配制輔料對(duì)照組（不含主藥五氯柳胺）的濃度為0.1 g/mL。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)試驗(yàn) 采用遞加法分別進(jìn)行五氯柳胺混懸劑組預(yù)試驗(yàn)以及輔料對(duì)照組預(yù)試驗(yàn)。

五氯柳胺混懸劑預(yù)試驗(yàn)：將20只SD大鼠平均分為5組，每組4只，雌雄各半，分別給大鼠稱重，計(jì)算給藥劑量。最高劑量組為5.0 g/kg，最低劑量組為1.0 g/kg。灌胃給藥，觀察7 d，記錄大鼠的死亡數(shù)，得到最小致死劑量（LD100）（記為b）和最大耐受劑量（LD0）（記為a）。確定組數(shù)N以及各組間劑量比r。

N由預(yù)試驗(yàn)的最小致死劑量（LD100）b與最大耐受劑量（LD0）a的比值來(lái)確定。

r=lg-1[（lgb-lga）/（N-1）]

輔料對(duì)照組預(yù)試驗(yàn)方法同上。

1.2.2 正式試驗(yàn) 由預(yù)試驗(yàn)結(jié)果可知，輔料預(yù)試驗(yàn)的LD100大于5.0 g/kg，將大鼠樣本量增至10只，雌雄各半，仍未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，按照化學(xué)藥物毒性分級(jí)屬于實(shí)際無(wú)毒，因此得到結(jié)論，該混懸劑輔料實(shí)際無(wú)毒。根據(jù)五氯柳胺混懸劑預(yù)試驗(yàn)得到的最小致死劑量（LD100）和最大耐受劑量（LD0），采用簡(jiǎn)化寇氏法計(jì)算正式試驗(yàn)組數(shù)N以及各組間劑量比r。

根據(jù)五氯柳胺混懸劑預(yù)試驗(yàn)結(jié)果將正式試驗(yàn)分為6組，其中包括空白對(duì)照組1組以及不同劑量給藥組5組。將60只SD大鼠（雌雄各半，體重180～220 g）隨機(jī)分為6組，每組雌雄各半。試驗(yàn)組的給藥劑量分別為5.000、3.375、2.250、1.500、1.000 g/kg，空白對(duì)照組給予等量的飲用水。灌胃給藥，觀察7 d，自由飲水，采食，觀察大鼠的外觀體征、飲食欲、行為活動(dòng)、大小便等相關(guān)癥狀。給藥后4 h，持續(xù)觀察；4～8 h內(nèi)每30 min觀察一次；8～12 h，每1 h觀察一次；12～48 h，每隔3 h觀察一次；3 d后每天觀察3次，直至第七天結(jié)束。記錄每組死亡大鼠個(gè)數(shù)，對(duì)死亡動(dòng)物進(jìn)行剖檢，與空白組對(duì)照，觀察各組織器官的病理變化。用改良寇氏法計(jì)算LD50及95%的置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

輔料預(yù)試驗(yàn)組的LD100大于5.0 g/kg，增加試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量至10只，仍未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，按照化學(xué)藥物的毒性分級(jí)可以視為實(shí)際無(wú)毒。

五氯柳胺混懸劑試驗(yàn)組預(yù)試驗(yàn)的LD100為5.0 g/kg，LD0為1.0 g/kg。從而確定正式試驗(yàn)的組數(shù)N為5。各組之間的劑量比值r=1.495。由此將預(yù)試驗(yàn)分為6組，其中5組為不同劑量給藥組，1組為空白對(duì)照組。

2.2 正式試驗(yàn)結(jié)果

觀察給藥后動(dòng)物表現(xiàn)出的癥狀為：大鼠被毛逆亂、精神沉郁，伏臥不動(dòng)，眼睛微閉，食欲不振，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，個(gè)別大鼠出現(xiàn)四肢無(wú)力、糞便變軟，少數(shù)大鼠出現(xiàn)后肢癱瘓等現(xiàn)象，死亡前出現(xiàn)全身震顫、側(cè)翻現(xiàn)象，大約持續(xù)5～10 min死亡。高劑量組的癥狀明顯，低劑量組癥狀較輕微，恢復(fù)快。大鼠死亡時(shí)間集中在8～15 h，2 d后再無(wú)死亡現(xiàn)象，癥狀逐漸緩解。

對(duì)死亡動(dòng)物剖檢，與空白對(duì)照組相比，死亡動(dòng)物的口唇、四肢、尾巴青紫。高劑量組中，個(gè)別大鼠出現(xiàn)脾腫大、肝有出血點(diǎn)、胃部膨大、胃壁變薄等現(xiàn)象。

正式試驗(yàn)死亡情況見(jiàn)表1。根據(jù)簡(jiǎn)化寇氏法計(jì)算LD50以及95%置信限公式如下：

式中，Xm為最大劑量的對(duì)數(shù)；i為組距，即相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)值之差；p為各劑量組死亡率，q為各劑量組存活率；∑p為各劑量組死亡率之和；n為各組動(dòng)物數(shù)；sx50為lgLD50的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

計(jì)算得到LD50為3.333 g/kg，95%置信區(qū)間為3.084 6～3.600 8 g/kg。根據(jù)化學(xué)物急性毒性（LD50）劑量分級(jí)可知五氯柳胺口服混懸劑為低毒物質(zhì)。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)嚴(yán)格遵守《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編》[9]中對(duì)藥物急性毒性試驗(yàn)的相關(guān)規(guī)定。試驗(yàn)采用SPF級(jí)SD大鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，保證試驗(yàn)動(dòng)物健康無(wú)污染，以防對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響。由于高劑量組藥物濃度較大，液體較黏稠，稀釋后給藥體積較大，考慮到大鼠的胃容積，為防止撐死現(xiàn)象的發(fā)生，采用多次給藥。給藥間隔為1～2 h，24 h內(nèi)給藥完成。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，大鼠給予五氯柳胺混懸劑后，出現(xiàn)精神倦怠、食欲減退、生長(zhǎng)遲緩等現(xiàn)象，根據(jù)大鼠的死亡數(shù)計(jì)算五氯柳胺混懸劑的半數(shù)致死劑量（LD50）為3.333 g/kg，95%置信區(qū)間為3.084 6～3.600 8 g/kg。由化學(xué)物毒性分級(jí)可知，五氯柳胺混懸劑為低毒物質(zhì)，臨床用藥安全。五氯柳胺作為廣譜抗寄生蟲(chóng)藥，具有廣譜高效、無(wú)耐藥性等特點(diǎn)[10]，本研究對(duì)其新制劑五氯柳胺混懸劑的安全性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，以期為該制劑的后續(xù)研究及臨床推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] ASHRAFI K，BARGUES M D，O'NEILL S，et al.Fascioliasis：A worldwide parasitic disease of importance in travel medicine[J].Travel Med Infect Dis，2014，12（6）：636-649.

[2] KHORAMIAN H，ARBABI M，OSQOI M M，et al. Prevalence of ruminants fascioliasis and their economic effects in Kashan， center of Iran[J].Asian Pac J Trop Biomed，2014，4（11）：918-922.

[3] ABDEL-NASSER A H，REFAAT K. Fascioliasis prevalences among animals and human in Upper Egypt[J].Journal of King Saud University（Science），2010，22（1）：15-19.

[4] SANABRIA R，MORENO L，ALVAREZ L，et al.Efficacy of oxyclozanide against adult Paramphistomum leydeni in naturally infected sheep[J].Veterinary parasitology，2014，206（3）：277-281.

[5] 崔 瑩.驅(qū)蟲(chóng)藥五氯柳胺的制備[J].現(xiàn)代商貿(mào)工業(yè)，2010（20）：300.

[6] GALDHAR C N，ROY M，ROY S. Efficacy of oxyclozanide （Neozide suspension） against paramphistomiasis in buffaloes[J]. Intas Polivet，2003，4（2）：266-268.

[7] PARAUD C，GAUDIN C，PORS I，et al.Efficacy of oxyclozanide against the rumen fluke Calicophoron daubneyi in experimentally infected goats[J].The Veterinary Journal，2009，180（2）：265-267.

[8] ATHAR L A，KHAN M N，SAJID M S，et al. Cost benefits analysis of anthelmintic treatment of cattle and buffaloes[J]. Pakistan Veterinary Journal，2011，31（2）：149-152.

[9] 農(nóng)業(yè)部獸藥評(píng)審中心.獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2012.

[10] ARIAS M S，SANCHIS J，F(xiàn)RANCISCO I，et al.The efficacy of four anthelmintics against Calicophoron daubneyi in naturally infected dairy cattle[J].Vet Parasitol，2013，197（1-2）：126-129.