湯繼順，章 薇，朱德建，惠文巧，蘇世廣，陳 勝

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，合肥 230031）

安徽白山羊GDF9基因群體遺傳效應(yīng)分析

湯繼順，章 薇，朱德建，惠文巧，蘇世廣，陳 勝

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，合肥 230031）

為驗(yàn)證GDF9基因是否與山羊產(chǎn)羔數(shù)存在關(guān)聯(lián)性，采集具有1~5胎產(chǎn)羔記錄的安徽白山羊經(jīng)產(chǎn)母羊血樣265份，提取血液總DNA；根據(jù)基因序列（GenBank:EF446168.2）和參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)4對(duì)引物，利用PCR-SSCP方法檢測GDF9基因2個(gè)外顯子在安徽白山羊品種中是否存在遺傳多態(tài)性，采用最小二乘均值法分析遺傳突變位點(diǎn)不同基因型產(chǎn)羔數(shù)之間的差異。結(jié)果表明：在外顯子1中存在1個(gè)SNPEF446168.2:c.1956A>C（同義突變），而在外顯子2中存在2個(gè)SNPs（EF446168.2:c.3319G> A，錯(cuò)義突變；EF446168.2:c.4085G>A，同義突變）。群體遺傳分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)SNP位點(diǎn)均存在3種基因型，優(yōu)勢基因型頻率分別為AA（0.607 5）、GG（0.750 9）、GG（0.786 8）。關(guān)聯(lián)性分析表明，在EF446168.2:c.1956A>C位點(diǎn)，3種基因型安徽白山羊產(chǎn)羔數(shù)LSM（最小二乘均值）無顯著差異；對(duì)EF446168.2:c.3319G>A位點(diǎn)，AA型產(chǎn)羔數(shù)LSM分別比GG型個(gè)體和GA型個(gè)體LSM高0.77只和0.41只（P<0.01）；對(duì)EF446168.2:c.4085G>A，AA型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)LSM分別比GG型個(gè)體和GA型個(gè)體LSM高0.43只和0.28只（P<0.01）。因此，GDF9基因與安徽白山羊產(chǎn)羔數(shù)密切相關(guān)，可能是影響產(chǎn)羔數(shù)的一個(gè)主效基因；EF446168.2:c.1956A>C、EF446168.2:c.3319G>A、EF446168.2:c.4085G>A可能作為分子標(biāo)記，應(yīng)用于安徽白山羊多胎性育種。

安徽白山羊；GDF9基因；產(chǎn)羔數(shù)；PCR-SSCP

安徽省是我國山羊主產(chǎn)區(qū)之一，境內(nèi)山羊主要品種為黃淮山羊安徽白山羊類群，集中分布于安徽省的阜陽、亳州、滁州以及淮北、宿州等市縣，具有耐粗飼，抗病力強(qiáng)，終年發(fā)情，繁殖力高，母性好和難產(chǎn)率低等優(yōu)點(diǎn)，一般5月齡母羔就能發(fā)情配種［1］。近年來，為改善肉用性能，對(duì)安徽白山羊進(jìn)行選育提高。經(jīng)選育后，安徽白山羊生長性能有了很大提高，但產(chǎn)羔率卻出現(xiàn)下降。采取常規(guī)的育種方法，很難較為迅速地改善該山羊群體中的繁殖性能。產(chǎn)羔數(shù)受基因和環(huán)境等影響，是一個(gè)遺傳力很低的數(shù)量性狀（遺傳力僅0.1左右［2］），但經(jīng)濟(jì)價(jià)值十分巨大，是影響肉羊養(yǎng)殖效益的主要因素。隨著分子育種技術(shù)和現(xiàn)代分子生物學(xué)方法的發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）為解決這一問題提供了新的方向和契機(jī)。MAS可以消除性別、年齡、環(huán)境等因素對(duì)表型選擇的干擾，從而彌補(bǔ)常規(guī)表型選擇方法的不足，但找到與這些數(shù)量性狀基因座相連鎖的分子遺傳標(biāo)記，是實(shí)現(xiàn)標(biāo)記輔助選擇的先決條件［3］。

生長分化因子9（GDF9）是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的一個(gè)新成員，對(duì)卵巢卵泡的發(fā)育起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［4］。自1993年發(fā)現(xiàn)GDF9基因以來，圍繞其功能，國內(nèi)外科研工作者開展了一系列研究工作。已發(fā)現(xiàn)GDF9基因在人、嚙齒類、牛、綿羊及有袋類動(dòng)物卵巢的卵母細(xì)胞中特異性表達(dá)，在山羊的卵母細(xì)胞和黃體中能同時(shí)表達(dá)［5-6］。目前，對(duì)綿羊GDF9基因群體遺傳學(xué)研究較多，而在山羊，尤其是在安徽白山羊上的研究相對(duì)較少。因此，本研究以安徽白山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采用PCR-SSCP技術(shù)檢測GDF9基因在安徽白山羊群體內(nèi)的遺傳多態(tài)性，統(tǒng)計(jì)對(duì)應(yīng)的產(chǎn)羔記錄，分析不同GDF9基因型與產(chǎn)羔數(shù)之間的相關(guān)性，旨在尋找與產(chǎn)羔性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，為安徽白山羊高繁殖力選育的標(biāo)記輔助選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物在亳州、宿州兩地的安徽白山羊養(yǎng)殖場，共選擇265只安徽白山羊經(jīng)產(chǎn)母羊，要求母羊有1～5胎以上產(chǎn)羔記錄。

1.1.2樣品的采集每只母羊頸靜脈采血5mL，ACD抗凝，低溫冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，-20℃凍存。

1.1.3主要試劑 血液基因組DNA提取試劑盒購自北京諾博萊德科技有限公司，2×Reaction Mix和Marker B1（600 bp）等均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。引物合成由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.1.4其他試劑耗材Tris、冰乙酸、硼酸、無水乙醇、碳酸氫鈉、瓊脂糖、甲醛、EDTA、5×TBE緩沖液、核酸染料、聚丙烯酰胺（29∶1）、APS、TEMED、去離子甲酰胺、溴酚藍(lán)、硝酸銀和二甲苯氰FF等均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)山羊GDF9基因序列（GenBank: EF446168.2）和參考文獻(xiàn)［7］設(shè)計(jì)4對(duì)引物，引物1和2擴(kuò)增第1外顯子產(chǎn)物，引物3和4擴(kuò)增第2外顯子（見表1）。

表1　用于GDF9基因PCR-SSCP分析的4對(duì)引物序列

1.2.2DNA提取 根據(jù)血液基因組DNA提取試劑盒說明步驟提取DNA，其中全血?jiǎng)┝繛?00μL，提取后的基因組DNA，經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)檢測OD值，均在100 ng/μL以上，能滿足整個(gè)試驗(yàn)的要求。

1.2.3PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25μL）:100μmol/L上、下游引物各0.1μL，2×Reaction Mix 12.5μL，超純水10.3μL，DNA模板2μL。4對(duì)引物的擴(kuò)增程序相同，即94℃預(yù)變性3min；94℃變性30 s，退火溫度退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min，4℃保存。退火溫度見表1。PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4SSCP分析參照王百川等［3］方法。取PCR產(chǎn)物4μL和上樣緩沖液［98%去離子甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、0.025%二甲苯青、10mmol/LEDTA（pH值為8.0）］6μL，98℃變性10min后立即冰浴10min，上樣于預(yù)冷的12%聚丙烯酰胺凝膠上，160 V電泳10min，再將電壓調(diào)到100 V電泳6～8 h，銀染強(qiáng)堿顯色，掃描儀成像保存及分析。

1.2.5測序 在經(jīng)過SSCP法分析后，對(duì)不同基因型PCR產(chǎn)物（25μL）直接測序，序列測序由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.3數(shù)據(jù)處理

根據(jù)下列模型進(jìn)行最小二乘均值（LSM）分析，比較安徽白山羊產(chǎn)羔數(shù)在GDF9不同基因型之間的差異。

其中，Yij為個(gè)體性狀觀察值，μ為群體平均值，Gi為基因型效應(yīng)值，Pj為胎次效應(yīng)，Eij為隨機(jī)誤差。根據(jù)以上線性模型，用SPSS 22.0 ANOVA軟件對(duì)產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1GDF9基因的PCR擴(kuò)增

用所設(shè)計(jì)的引物（4對(duì)）對(duì)安徽白山羊基因組進(jìn)行擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA Marker為100～600 bp，擴(kuò)增結(jié)果見圖1a~d。結(jié)果表明:擴(kuò)增片段與目的片段大小一致，且特異性良好，可直接進(jìn)行SSCP分析。

圖1　4對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA結(jié)果分析

2.24對(duì)引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的SSCP分析

如圖2顯示，4對(duì)引物中除了引物1擴(kuò)增片段沒有多態(tài)性，其余均有多態(tài)性，引物2擴(kuò)增片段出現(xiàn)多態(tài)，分別定義為AA型、CC型和AC型3種基因型；引物3擴(kuò)增片段出現(xiàn)多態(tài)，可定義為GG型、AA型和GA型3種基因型；引物4擴(kuò)增片段出現(xiàn)多態(tài)，定義為GG型、AA型和GA型3種基因型。

圖2　4對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物SSCP結(jié)果分析

2.33個(gè)位點(diǎn)不同基因型純合型個(gè)體測序分析

由圖3、圖4和圖5得知，經(jīng)過SSCP分析的不同引物擴(kuò)增的純合子基因型個(gè)體，重新擴(kuò)增PCR產(chǎn)物后進(jìn)行測序分析。引物2擴(kuò)增產(chǎn)物中，AA型與CC型相比在外顯子1第183 bp處有1個(gè)A→C的單堿基突變（EF446168.2: c.1956A＞C）。該SNP不改變編碼的氨基酸（ABR10699.1: p.Leu61Leu），屬于同義突變。

圖3　安徽白山羊GDF9基因編碼區(qū)第183 bp處AA和CC基因型的序列比較

圖4　安徽白山羊GDF9基因編碼區(qū)第3 319 bp處GG和AA基因型的序列比較

圖5　安徽白山羊GDF9基因編碼區(qū)第4 085 bp處GG和AA基因型的序列比較

引物3擴(kuò)增產(chǎn)物中，GG型和AA型外顯子2的第26 bp處有1個(gè)G→A的單堿基突變（EF446168.2:c.3319G＞A）。該SNP可致編碼的氨基酸序列改變，即由纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼幔ˋBR10699.1:p.Val9Ile），屬于錯(cuò)義突變。

引物4擴(kuò)增產(chǎn)物中，EE型和FF型外顯子2第792bp處有1個(gè)G→A的單堿基突變（EF446168.2:c.4085G＞A）。該SNP不改變編碼的氨基酸（ABR10699.1:p.Arg264Arg），屬于同義突變。

2.4GDF9基因在安徽白山羊品種中的遺傳多態(tài)性

不同引物擴(kuò)增GDF9基因在安徽白山羊品種中的基因型頻率及基因頻率的分布（見表2）。由表2可知，在安徽白山羊群體中，對(duì)于EF446168.2:c.1956A＞C，AA、CC和AC基因型頻率分別為0.607 5、0.064 2和0.328 3，AA型為優(yōu)勢基因型；等位基因A和C的頻率分別為0.771 7和0.228 3，A為優(yōu)勢等位基因。

對(duì)于EF446168.2:c.3319G＞A，GG、AG和AA基因型頻率分別為0.581 1、0.339 6和0.079 2，GG型為優(yōu)勢基因型；等位基因G和A的頻率分別為0.750 9和0.249 1， G為優(yōu)勢等位基因。

對(duì)于EF446168.2:c.4085G＞A，GG、GA和AA基因型頻率分別為0.634 0、0.305 7和0.060 4，等位基因G和A的頻率分別為0.786 8和0.213 2，G為優(yōu)勢等位基因。

2.5GDF9基因的Hardy-Weinberg平衡檢測

從表2可以看出，經(jīng)χ2適合性檢驗(yàn)表明，GDF9基因中EF446168.2:c.1956A＞C、EF446168.2:c.3319G＞A和EF446168.2:c.4085G＞A位點(diǎn)P值均大于0.05，達(dá)到Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表2　不同引物擴(kuò)增GDF9基因在安徽白山羊中的等位基因頻率和基因型頻率

2.6安徽白山羊GDF9基因不同基因型產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值

由表3可見：對(duì)于EF446168.2:c.1956A＞C，3種基因型母羊產(chǎn)羔數(shù)LSM沒有明顯差異。

對(duì)于EF446168.2:c.3319G＞A，AA型安徽白山羊產(chǎn)羔數(shù)LSM比AG型的多0.41只（P＜0.01），比GG型的多0.77只（P＜0.01）；AG型產(chǎn)羔數(shù)LSM比GG型多0.36只（P＜0.01）。

對(duì)于EF446168.2:c.4085G＞A，AA型安徽白山羊產(chǎn)羔數(shù)LSM比AG型的多0.28只（P＜0.01），比GG型的多0.43只（P＜0.01）；AG型產(chǎn)羔數(shù)LSM和GG型之間沒有顯著差異。

表3　不同GDF9基因型的安徽白山羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

3　討論

3.1安徽白山羊GDF9基因的遺傳多態(tài)性

GDF9基因生理效應(yīng)主要是對(duì)卵泡發(fā)育和生殖功能產(chǎn)生影響［8］。在研究肉羊GDF9基因多態(tài)性方面，綿羊的GDF9基因研究較多［12-13］，對(duì)山羊如濟(jì)寧青山羊、魯北白山羊、沂蒙黑山羊等的研究也在逐步開展。Hanrahan等［14］研究發(fā)現(xiàn)，GDF9基因外顯子2編碼活性肽的全部序列，綿羊GDF9基因編碼區(qū)有8個(gè)突變，其中G8突變（FecGH）對(duì)卵巢發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用。孟麗娜等［15］研究發(fā)現(xiàn)，山羊GDF9基因編碼區(qū)有4個(gè)突變位點(diǎn)，后2個(gè)突變位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致編碼氨基酸改變。周澤曉等［16］利用AS-PCR方法分析貴州白山羊GDF9基因發(fā)現(xiàn)，790位點(diǎn)的SNP多態(tài)性與繁殖率相關(guān)，對(duì)山羊繁殖率的調(diào)節(jié)可能與綿羊相類似。本研究以安徽白山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采用PCR-SSCP方法分析只發(fā)現(xiàn)3個(gè)突變位點(diǎn)，分別在1 956、3 319和4 085 bp處（GenBank:EF446168.2），其中3 319 bp處G→A突變導(dǎo)致編碼氨基酸殘基改變，由半胱氨酸殘基變?yōu)槔野彼釟埢?，而其?次堿基突變屬于同義突變。但程蕭等［17］在安徽白山羊和波爾山羊沒有發(fā)現(xiàn)GDF9基因FecGH突變，何遠(yuǎn)清等［18］在濟(jì)寧青山羊等6個(gè)山羊品種中也未檢測出GDF9基因G8突變。這些可能是由于研究方法和樣本數(shù)量不同而導(dǎo)致結(jié)論不同。對(duì)GDF9基因進(jìn)行 Hardy-Weinberg平衡檢測發(fā)現(xiàn)，除1956A＞C達(dá)到Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）外，3319G＞A和4085G＞A均未達(dá)到平衡狀態(tài)（P＜0.05），這可能是受到安徽白山羊選育措施的影響。

3.2GDF9基因與安徽白山羊產(chǎn)羔的相關(guān)性分析

王百川等［3］采用PCR-SSCP技術(shù)檢測GDF9基因外顯子2在濟(jì)寧青山羊、嶗山奶山羊和萊蕪黑山羊中的單核苷酸多態(tài)性后指出，GDF9基因可能是控制濟(jì)寧青山羊和萊蕪黑山羊多胎性能的一個(gè)主效基因或是與之存在緊密遺傳連鎖的分子標(biāo)記。朱廣琴等［19］通過對(duì)169只黃淮山羊采用PCR-SSCP技術(shù)分析后發(fā)現(xiàn)，GDF9基因擴(kuò)增片段均存在多態(tài)性，但只有2種基因型，產(chǎn)羔數(shù)最小二乘平均值在基因型之間均存在極顯著差異（P＜0.01）。

吳澤輝等［2］為了研究GDF9基因單核苷酸多態(tài)性對(duì)高繁殖力山羊品種（濟(jì)寧青山羊）以及低繁殖力山羊品種（波爾山羊、文登奶山羊、遼寧絨山羊、北京本地山羊）繁殖力的影響，采用PCR-SSCP技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，GDF9基因可能是控制濟(jì)寧青山羊多胎性能的1個(gè)主效基因或是與之存在緊密遺傳連鎖的分子標(biāo)記。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4對(duì)引物中3對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物有多態(tài)，在外顯子1中存在1個(gè)SNPEF446168.2:c.1956A＞C（同義突變），而在外顯子2中存在2個(gè)SNPs（EF446168.2:c.3319G＞A，錯(cuò)義突變；EF446168.2:c.4085G＞A，同義突變）。群體遺傳分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)SNP位點(diǎn)均存在3種基因型。關(guān)聯(lián)性分析證實(shí)，在EF446168.2:c.3319G＞A位點(diǎn)，AA型產(chǎn)羔數(shù)LSM較GG型個(gè)體和GA型個(gè)體分別高0.77只和0.41只（P＜0.01）；對(duì) EF446168.2:c.4085G＞A，AA型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù) LSM較GG、GA型個(gè)體分別高 0.43只和0.28只（P＜0.01）。可以判斷：EF446168.2:c.4085G＞A的單堿基突變影響了GDF9基因功能表達(dá)，從而導(dǎo)致不同基因型母羊出現(xiàn)產(chǎn)羔數(shù)的差異。因此，可以猜測GDF9基因是影響安徽白山羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因，EF446168.2:c.4085G＞A可能作為分子標(biāo)記，應(yīng)用于安徽白山羊多胎性育種。

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Analysison Population Genetic Effectof GDF9Gene of AnhuiW hite Goat

Tang Jishun，ZhangWei，Chen Sheng，etal
（InstituteofAnimalHusbandryand Veterinary，AnhuiAcademyofAgriculturalScience，Hefei230031，China）

To certify the possibleeffectof the GDF9 gene asamajor gene on lambing rate of Anhuiwhite goat，the blood samples were collected from 265Anhuiwhite doeswith the record of1-5 fetal littersizes.The totalDNA wasextracted from theblood，the 4 pairs of primers were designed according to the gene sequence（GenBank:EF446168.2）and reference to detect the polymorphism of two exonsmutation site in GDF9 by using PCR-SSCPmethod and analyze litter sizes of difference between different genotypes by using least squaresmeans（LSM）in Anhuiwhite goat.The results showed that there was one SNP EF446168.2:c.1956A＞C（synonymousmutation）in the exonⅠ，and two SNPS（EF446168.2:c.3319G＞A，missensemutation，EF446168.2:c.4085G＞A，synonymousmutation）in the exonⅡ.Population genetic analysis showed thatallof the 3 SNPSsites had three kindsofgenotypesand the preponderantgenotype frequencieswere AA genotype（0.607 5），GG（0.7509），GG（0.7868）respectively.Correlation analysisshowed that the lambing number LSM of three genotypeshad no difference in the EF446168.2:c. 1956A＞Csite；the lambingnumber LSM ofAA genotypeweremore than thoseofGG and GA genotypeby 0.77 and 0.41（P＜0.01）in the EF446168.2:c.3319G＞A site；the lambing number LSM of AA genotype weremore than those of GG and GA genotype by 0.43 and 0.28（P<0.01）in the EF446168.2: c.4085G＞A site.Therefore，it couldbe concluded that the GDF9 genemightbe amajor genewhich influenced the littersize；the three SNPS sites of EF446168.2:c.1956A＞C，EF446168.2:c.3319G＞A and EF446168.2:c.4085G＞A might be used in prolificacybreedingasamolecularmarker in Anhuiwhitegoat.

Anhuiwhitegoat；GDF9；litter size；PCR-SSCP

S827.2

A

2095-3887（2016）06-0001-06

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.06.001

2016-09-19

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目（15b0415）

湯繼順（1979-），男，助理研究員，主要從事肉羊繁育和疾病防治研究。

陳勝（1974-），男，副研究員，主要從事草食動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。