呂春榮，王思宇，趙其毅，楊維林，邵慶勇，洪瓊花

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224；2.云南省龍陵縣畜牧工作站，龍陵 768300）

龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性分析

呂春榮1，王思宇1，趙其毅2，楊維林2，邵慶勇1，洪瓊花1

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224；2.云南省龍陵縣畜牧工作站，龍陵 768300）

實驗采用龍陵黃山羊耳緣組織塊貼壁培養(yǎng)法首次對龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、冷凍保存建立了龍陵黃山羊耳緣成纖維細(xì)胞系；并對其細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活率、細(xì)胞核型等生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：細(xì)胞倍增時間48 h，生長曲線為“S”型；染色體中正常二倍體染色體2n=60所占比例為91.68%。

龍陵黃山羊；成纖維細(xì)胞系；生物學(xué)特性

龍陵黃山羊為云南省的地方優(yōu)良品種［1］，因其被毛黃色且產(chǎn)于龍陵縣而得名。該品種具有適應(yīng)性強、耐粗飼的特點，并以肉質(zhì)細(xì)嫩、味美多汁、膻味小而著稱［2］。龍陵縣地處中緬邊境。龍陵黃山羊是在特殊的地理環(huán)境下，經(jīng)過長期的自然選擇和人工選育形成的。該羊于1987年被列為云南省山羊保種品種之一，目前保種主要采取原產(chǎn)地活體保種的方式，保種方式單一、保種成本高，難以承擔(dān)繁重的保種任務(wù)。而體細(xì)胞建系和冷凍保存技術(shù)是解決云南省地方家畜品種遺傳資源保護(hù)的有力手段，它不但可以長時間保存優(yōu)良家畜品種遺傳資源，而且結(jié)合其他生物技術(shù)，如體細(xì)胞克隆或轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以加快新品種培育速度，從而提高云南省家畜種質(zhì)資源創(chuàng)新利用的技術(shù)水平。本研究針對此背景，以龍陵黃山羊這一省級保護(hù)動物的細(xì)胞為研究對象，利用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，從染色體水平、形態(tài)學(xué)水平進(jìn)行了研究，并對遺傳種質(zhì)資源進(jìn)行了保存。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料龍陵黃山羊耳樣采自云南省保山市龍陵縣烏木山良種繁育場，試驗用耳樣來源于1月齡龍陵黃山羊耳緣組織。

1.1.2主要試劑、儀器高糖DMEM、胎牛血清（FBS）由Gibco公司生產(chǎn)。青鏈霉素溶液和胰蛋白酶溶液購自Bioind公司；一次性塑料培養(yǎng)皿為Nunclon公司生產(chǎn)。

主要儀器設(shè)備：倒置相差顯微鏡（Olympus，Nikon）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo）；透射電鏡（JEM-1011）；實體顯微（Olympus）；細(xì)胞計數(shù)儀；程序降溫盒；液氮罐等。

1.2方法

1.2.1耳緣組織成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)選擇健康的龍陵黃山羊耳緣組織刮凈毛，用碘伏消毒后再用75%的酒精擦拭。用滅過菌的耳號鉗取耳緣組織樣本，75%酒精浸泡2min，再用生理鹽水+1%青鏈霉素溶液沖洗3次，然后放入高糖DMEM+1%青鏈霉素溶液中，并放入4℃泡沫箱，24 h內(nèi)帶回實驗室進(jìn)行培養(yǎng)。在超凈工作臺上用柳葉刀刮去皮膚表面污物。用含1%青鏈霉素的PBS溶液沖洗4次，再用手術(shù)剪剪成碎塊，放入直徑50mm的培養(yǎng)皿中，每皿7～8塊，緩慢加入少量培養(yǎng)液。培養(yǎng)液：高糖DMEM+10%FBS+1%青鏈霉素。最后放入培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2，飽和濕度）中培養(yǎng)。每天在倒置相差顯微鏡下觀察、照相、記錄細(xì)胞遷移和增殖情況。

1.2.2成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)當(dāng)成纖維細(xì)胞長至培養(yǎng)皿（瓶）底壁85%左右時，用PBS清洗3次，再用槍頭吸凈培養(yǎng)皿（瓶）里的PBS，加入0.125%胰酶（含0.01%EDTA）37℃消化5min左右后，在倒置相差顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞開始變圓并有少量細(xì)胞脫落時，加高糖DMEM+15% FBS液終止消化，吹打細(xì)胞使其完全脫落，以1∶2或1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察傳代細(xì)胞生長增殖狀況，并拍照。傳代培養(yǎng)液與原代培養(yǎng)液相同。

1.2.3成纖維細(xì)胞冷凍與復(fù)蘇細(xì)胞冷凍：0.125%胰酶（含0.01%EDTA）消化收集細(xì)胞，1 500 r/min離心5min，棄上清，用高糖DMEM+30%FBS+10%二甲基亞砜（DMSO）凍存液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107～3×107/mL，充分混勻，分裝在凍存管中。凍存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱、凍存管編號、性別和凍存日期。然后放入程序降溫盒中，于-80℃冰箱過夜，次日投入液氮罐中長期保存［3］。

細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮中取出凍存管，迅速投入42℃水浴鍋中，不停搖動使其受熱均勻達(dá)1 min，轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，移至培養(yǎng)皿（瓶）中，在（37℃，5%CO2，飽和濕度）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察復(fù)蘇細(xì)胞生長狀況，并拍照。

1.2.4成纖維細(xì)胞生長曲線測定取傳至第2代、第4代、第6代的龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞，胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/孔，接種于24孔培養(yǎng)板。從第2天開始到細(xì)胞長滿，每天隨機取3孔，連續(xù)7 d記數(shù)。用血球計數(shù)板在倒置相差顯微鏡下計數(shù)，取其平均值，以時間（d）為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.5成纖維細(xì)胞的核型檢測取培養(yǎng)至匯合度為85%左右，并處于對數(shù)生長期的細(xì)胞為實驗材料，參照Sun［4］方法進(jìn)行染色體制備。

1.2.6細(xì)胞活率測定選取龍陵黃山羊第2、4、6代凍存前后的成纖維細(xì)胞，分別對細(xì)胞進(jìn)行PI染色，在熒光顯微鏡下拍照，統(tǒng)計計算細(xì)胞存活率。

2　結(jié)果與分析

2.1龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

耳緣組織塊培養(yǎng)約5 d時，龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞、少量類上皮細(xì)胞從組織塊移出生長。隨著培養(yǎng)時間的延長，大量成纖維細(xì)胞從組織塊周圍遷出并迅速增殖，成纖維細(xì)胞呈長梭形。當(dāng)細(xì)胞長至培養(yǎng)皿（瓶）底壁85%左右時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)后，生長速度加快，3～4 d細(xì)胞即可長滿瓶底并再次傳代。原代細(xì)胞及傳代后細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果見圖1。

圖1　龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞

2.2龍陵黃山羊耳緣成纖維細(xì)胞凍存前及復(fù)蘇后細(xì)胞活率

龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞第2代、第4代、第6代凍存前活率分別為93.16%、92.58%、92.01%，復(fù)蘇后活率分別為91.22%、91.06%、90.47%，細(xì)胞在凍存前和復(fù)蘇后都有較高的存活率，均達(dá)90%以上，表明成纖維細(xì)胞培養(yǎng)條件適宜。另外，凍存對成纖維細(xì)胞存活率影響不大。

2.3龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞生長的動態(tài)觀察

根據(jù)每組每天測得的結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線。如圖2所示，各代細(xì)胞都經(jīng)歷了大約72 h的潛伏期，不同代次的細(xì)胞生長曲線均為“S”型。隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞增值速度有所變慢。

圖2　龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞生長曲線

2.4龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞核型分析

參照Levan等［5］的標(biāo)準(zhǔn)，第3代細(xì)胞核型取100個分裂相進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明，龍陵黃山羊染色體數(shù)為2n=60的所占比例為91.68%，常染色體及X染色體均為端部著絲粒染色體，說明所培養(yǎng)的細(xì)胞遺傳性能穩(wěn)定，該細(xì)胞系為穩(wěn)定的二倍體細(xì)胞系。

圖3　龍陵黃山羊核型圖（母）（1 000×）

3　討論

進(jìn)行細(xì)胞染色體核型分析時，當(dāng)山羊的成纖維細(xì)胞用終濃度為0.1μg/mL時，秋水仙素處理時間為7～8 h、低滲時間為18～22min。在配制磷酸鹽緩沖液時，用鈉鹽取代鉀鹽可以得到同樣效果，同時降低了成本。據(jù)吳帥帥等［6］報道，云嶺黑山羊的染色體數(shù)目2n=60；葉紹輝等［7］報道，龍陵黃山羊的染色體數(shù)目為2n=60。本實驗結(jié)果表明，龍陵黃山羊的染色體數(shù)目為2n=60，與上述結(jié)論一致。

通過繪制龍陵黃山羊第2、4、6代細(xì)胞生長曲線，可以看出隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞增殖速度有所減緩。此外，細(xì)胞解凍后活率也隨著傳代次數(shù)的增加有所降低。而本實驗要求培養(yǎng)的細(xì)胞始終維持二倍體生物學(xué)性狀，保持與體內(nèi)細(xì)胞有較大相似性，因此不能傳代太多，傳6代細(xì)胞不用于實驗就立即低溫凍存。對第3代細(xì)胞中染色體眾數(shù)進(jìn)行檢測，2n=60的占91.68%，染色體沒有異常表現(xiàn)，說明該細(xì)胞系為穩(wěn)定二倍體細(xì)胞系。

本研究建立的龍陵黃山羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系增殖快，遺傳性能穩(wěn)定。此細(xì)胞系的建立，不但使龍陵黃山羊這一云南省優(yōu)良遺傳資源在細(xì)胞水平上得以保存下來，而且結(jié)合其他生物技術(shù)，如體細(xì)胞克隆或轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以加快新品種培育速度，從而提高云南省家畜種質(zhì)資源創(chuàng)新利用的技術(shù)水平，并為相關(guān)遺傳學(xué)研究提供了有效的理論依據(jù)和理想的生物材料。同時對于開展其他動物成纖維細(xì)胞系的建立也有一定的理論和技術(shù)指導(dǎo)意義。

［1］云南家畜家禽品種志編委會.云南家畜家禽品種志［M］.昆明：云南科技出版社，1987：171-175.

［2］陳韜，彭和祿，譚麗勤，等.龍陵黃山羊屠宰性能及肉質(zhì)研究［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1996，11（3）：162-167.

［3］Ren FL，LiY，Zhang Y.In vitro cultivation and freezingofbovine skin fibroblastcells［J］.ScalperMagazine，2002，28：8-10.

［4］Sun Y L，Lin C S，Chou Y C.Establishment and characterization of a spontaneously immortalized porcinemammary epithelial cell line［J］. CellBiol Int，2006，30：970-976.

［5］Levan A，F(xiàn)redga K，Sandberg A A.Nomenclature for centromeric position on chromosomes［J］.Heredita，1964，52（2）：201-220．

［6］吳帥帥，呂春榮，權(quán)國波，等.云嶺黑山羊成纖維細(xì)胞系建立及其生物學(xué)特性分析［J］.黑龍江動物繁殖，2013，21（4）：16-20.

［7］葉紹輝，彭和祿，林世英，等.云南龍陵黃山羊的核型及C-帶和Ag—NORs研究［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1996，11（2）：96-99.

Establishm entand the BiologicalCharacteristicsof Fibroblast Cell Line in Yunnan Longling Yellow Goat

LüChunrong，Wang Siyu，HongQionghua，etal
（Yunnan InstituteofAnimalScienceand Veterinary，Kunming650224，China）

In this study，the fibroblasts cell line derived from ear marginal tissue of Longling yellow goat was successfully established using the primary explants technique and cryopreservation technology.Themorphology，dynamic growth and karyotypes of the cells cultured after different passages were analyzed，the tissue cells of the ear were observed by transmission electronmicroscopy.The results showed that the population doubling time（PDT）of the cellswas 48 h；the growth curve of the cultured cellsappeared“S”shape；the frequencyofcellchromosomenumber tobe2n=60was91.68%.

Longlingyellow goat；fibroblastcell line；biologicalcharacteristics

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.06.003

S827.2

A

2095-3887（2016）06-0011-03

2016-09-11

云高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展（201404）

呂春榮（1982-），女，助理研究員，碩士。

洪瓊花（1968-），女，白族，研究員，碩士，主要從事綿羊、山羊的育種和高效繁殖新技術(shù)研究。