姜玉松， 樊汶樵， 徐敬明

(1. 重慶文理學院林學與生命科學學院，重慶 402160； 2. 重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護與開發(fā)研究中心，重慶 402168)

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利用RNA-seq技術分析棘腹蛙編碼區(qū)微衛(wèi)星特征

姜玉松1， 樊汶樵1， 徐敬明2*

(1. 重慶文理學院林學與生命科學學院，重慶 402160； 2. 重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護與開發(fā)研究中心，重慶 402168)

棘腹蛙Paaboulengeri的遺傳研究和基因組信息比較匱乏，致使可有效利用的分子標記非常有限。以棘腹蛙RNA-seq高通量測序數(shù)據(jù)為基礎進行微衛(wèi)星分子標記的大規(guī)模發(fā)掘和特征分析，結(jié)果顯示：在121.6 Mb的棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組序列中發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星位點3165個，包含于3034條Contig序列中。在篩選到的1～6堿基重復核心的微衛(wèi)星中，單堿基重復核心的比例最高，之后為三堿基、二堿基、四堿基、六堿基和五堿基重復核心，分別占29.0%、25.2%、21.7%、10.0%、10.0%和3.0%。其中A/T、AC/GT、AGG/CCT、ACAT/ATCT、AAAAT/ATTTT和AAAAAG/CTTTTT分別是單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基重復類型中對應的優(yōu)勢重復單元。棘腹蛙編碼區(qū)微衛(wèi)星多為重復長度小于24 bp的短序列，長度大于24 bp的微衛(wèi)星僅占總數(shù)的0.92%。對編碼區(qū)微衛(wèi)星的側(cè)翼序列分析發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星側(cè)翼序列的GC含量顯著低于轉(zhuǎn)錄組整體GC含量，且在含有微衛(wèi)星上下游側(cè)翼序列的Contig中，71.9%的序列可以設計特異引物擴增出含有微衛(wèi)星序列的位點。研究結(jié)果為棘腹蛙的遺傳研究和分子系統(tǒng)地理學研究提供了豐富的序列信息和標記資源。

高通量測序；棘腹蛙；微衛(wèi)星

棘腹蛙Paaboulengeri又名石坑、石蛙等，隸屬于兩棲綱Amphibia無尾目Anura蛙科Ranidae，廣泛分布于我國四川、重慶等地(費梁等，2005)，是我國特有的大型野生蛙類。近年來，由于水體污染、生態(tài)環(huán)境破壞等因素，野生棘腹蛙資源日趨匱乏，種群規(guī)模不斷縮小，已被《中國瀕危動物紅皮書》列為易危物種(趙爾宓，2000)。保護現(xiàn)存的野生種群，采取科學的繁殖配對措施以避免近交衰退和遺傳多樣性丟失，已成為目前棘腹蛙保護和養(yǎng)殖中面臨的關鍵問題。

微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)又稱簡單重復序列(simple sequence repeats, SSR),突變率高、多態(tài)性強，是研究種群遺傳多樣性、近交衰退、種群遺傳結(jié)構和適應潛力、分類和系統(tǒng)進化等的有力工具(曾聰?shù)龋?013)。微衛(wèi)星普遍存在于原核、真核生物基因組中，其側(cè)翼序列比較保守，核心區(qū)以1～6個堿基組成串聯(lián)重復序列(Mrazeketal.，2007)。傳統(tǒng)的微衛(wèi)星序列獲取主要有3種途徑：一是利用其他物種已有的標記進行直接克隆，這種方法在中國魚類群體遺傳結(jié)構研究中較常見，如利用鯉Cyprinuscarpio標記分析鰱魚Hypophthalmichthysmolitrix、鳙Aristichthysnobilis、草魚Ctenopharynodonidellus等的研究都有報道(Tongetal.，2002；廖小林等，2005；Zhengetal.，2007)。然而，這種方法工作量大、效率低，而且高度依賴于側(cè)翼序列的保守性；二是構建富含微衛(wèi)星位點的基因組文庫(Changetal.，2005)，通過雜交篩選出含有微衛(wèi)星序列的陽性克隆，但是篩選過程較復雜，篩選效率低，需要大量的人力和資金的投入；三是基于“生物素-磁珠”富集的微衛(wèi)星序列克隆技術(Kijasetal.，1994)，該技術使微衛(wèi)星這一共顯性標記能夠高效快速地克隆，因此很快用于種質(zhì)鑒定和育種研究之中。高通量測序技術的發(fā)展為微衛(wèi)星測序帶來了革命性的變化，可實現(xiàn)一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，使得從基因組和轉(zhuǎn)錄組水平對一個物種進行全面分析成為可能。目前已經(jīng)在草魚、鰱魚、團頭魴Megalobramaamblycephala、斑馬魚Daniorerio、中國對蝦Fenneropenaeuschinensis等數(shù)百個物種中進行了大規(guī)模測序和微衛(wèi)星分布特征分析(曾聰?shù)龋?013)。這些結(jié)果為遺傳多樣性分析、連鎖圖譜制作、疾病連鎖分析和品種鑒定等方面提供了可能。

本研究利用RNA-seq高通量測序平臺對棘腹蛙進行轉(zhuǎn)錄組測序，并分析其微衛(wèi)星序列組成及特征，旨在了解棘腹蛙微衛(wèi)星的特征，繼而為微衛(wèi)星標記的開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

棘腹蛙采自重慶酉陽，生長在本實驗室的流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中。隨機挑選健康的2齡成蛙6只，采集皮膚、肝臟、腎臟、肌肉、腦、心臟組織，立即用液氮冷凍，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取

總RNA提取參照Trizol試劑盒(Invitrogen，美國)說明書進行。RNA的完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，濃度用紫外分光光度計(Amersham，美國)檢測。各組織RNA經(jīng)檢測后等量混合，基于Illumina公司的Hiseq 2000進行RNA測序。

1.3 Contig序列的獲取

以FastQC軟件(http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc)評估轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量，利用Trim_galore腳本(http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/trim_galore)去除低質(zhì)量序列和接頭序列，獲得Clean Reads數(shù)據(jù)。

Clean Reads用Trinity軟件包(https://trinityrnaseq.github.io)進行denovo組裝，使用cd-est-hit軟件(http://weizhong-lab.ucsd.edu/cd-hit)進行序列聚類，去除冗余。

1.4 微衛(wèi)星分析

微衛(wèi)星位點的搜索及分析，采用Misa腳本(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)從Contig轉(zhuǎn)錄本中查找1～6堿基重復核心的微衛(wèi)星位點，微衛(wèi)星的查找標準為不同重復核心的微衛(wèi)星總重復序列長度不低于18個核苷酸(1～18，2～9，3～6，4～5，5～4，6～3)，2個微衛(wèi)星位點的間隔最大為10 bp(Kofleretal.，2008)。側(cè)翼序列的查找通過自編Perl腳本，對微衛(wèi)星核心序列上游100 nt和下游100 nt(剔除上下游序列少于50 nt的Contig)進行GC含量分析，用Blastn程序?qū)ξ⑿l(wèi)星側(cè)翼序列比對分析，其中E值設置為1.0 E-5。

2 結(jié)果

2.1 測序及拼接結(jié)果

利用Illumina Solax測序平臺進行棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)Trim_galore腳本去除低質(zhì)量序列和接頭序列，獲得76 891 848對長度為100 bp的Clean Reads。經(jīng)Trinity軟件包拼接及cd-hit-est聚類后獲得94 108條無冗余的Contig序列，平均長度1293 bp，最大長度17 335 bp，共121.6 Mb的棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組序列(表1)，其中AT比例為52.33%，GC比例為47.67%。

2.2 微衛(wèi)星序列的查找

微衛(wèi)星按重復序列結(jié)構的不同，可分為完整型微衛(wèi)星(Perfect)、不完整型微衛(wèi)星(Imperfect)以及復合型微衛(wèi)星(Compound)。完整型微衛(wèi)星是由1種重復單元以不間斷的重復方式構成單一重復類型的微衛(wèi)星；不完整型微衛(wèi)星是指2個或2個以上的同類型重復單元被3個或3個以下的非重復堿基分隔；復合型微衛(wèi)星指2個或2個以上的不同重復單元序列被3個或者3個以上連續(xù)的非重復堿基所間隔(Weber，1990)。本研究通過Misa腳本對棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組Contig序列進行微衛(wèi)星查找，從總長為121 644 048 bp的94 108條Contig序列中發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星位點3165個，包含于3034條Contig序列中，其中完整型微衛(wèi)星、不完整型微衛(wèi)星以及復合型微衛(wèi)星分別為3023個、112個和15個(表2)。

表1 棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組測序組裝質(zhì)量評估

表2 棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組序列微衛(wèi)星預測

2.3 微衛(wèi)星豐度分析

棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組Contig數(shù)據(jù)庫中，單堿基重復的微衛(wèi)星含量最多，約占總數(shù)的29.0%，其次為三堿基(25.2%)、二堿基(21.7%)、四堿基(10.0%)、六堿基(10.0%)、五堿基(3.0%)(表3)。從棘腹蛙編碼區(qū)微衛(wèi)星分布的密度來看，平均每Mb堿基中出現(xiàn)26.01個微衛(wèi)星，不同重復類型微衛(wèi)星數(shù)量和密度有明顯差異(表3)。

表3 不同重復類型微衛(wèi)星所占比例及分布密度

2.4 優(yōu)勢重復單元堿基在棘腹蛙編碼區(qū)微衛(wèi)星中的組成

每種堿基重復單元包含不同種類的堿基，其中單堿基微衛(wèi)星由2種不同的重復單元堿基組成，二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基微衛(wèi)星分別由3種、10種、23種、38種和83種組成，復合型微衛(wèi)星由21種不同重復單元組成。對棘腹蛙不同類型微衛(wèi)星中各重復單元數(shù)量的變化情況進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)單堿基重復微衛(wèi)星中，A/T為最主要的重復單元，共863個，占93.3%；在二堿基重復類型中，AC/GT重復的數(shù)量最多，共436個，占60.4%；在三堿基重復類型中，AGG/CCT為最主要的重復單元，占22.8%，其次為ATC/ATG(18.7%)、AAT/ATT(17.9%)、ACC/GGT(12.3%)、AGC/CTG(12.3%)，其他重復堿基類型則相對較少；在四堿基重復類型中，ACAT/ATCT數(shù)量最多，占31.6%，五堿基重復類型中，AAAAT/ATTTT重復的數(shù)量最多，共36個，占21.6%，其他的重復類型較少；六堿基重復類型中，AAAAAG/CTTTTT和AAGCTC/AGCTTG的重復數(shù)量最多，分別占11.4%和10.1%。

2.5 棘腹蛙微衛(wèi)星長度分布及變異分析

根據(jù)Misa腳本的查找結(jié)果，棘腹蛙編碼區(qū)微衛(wèi)星的平均長度為20.4 bp，最長為136 bp，以18～24 bp為主，長度大于24 bp的微衛(wèi)星僅占0.92%(圖1)。為了解不同長度重復單元微衛(wèi)星長度的變異情況，對不同重復類型微衛(wèi)星的相對豐度與重復次數(shù)的關系進行了分析，結(jié)果表明棘腹蛙微衛(wèi)星相對豐度隨著重復次數(shù)的增加而減少，但不同長度重復單元微衛(wèi)星的下降速度不同。單堿基核心重復次數(shù)超過24(數(shù)據(jù)未顯示)、二堿基超過12、三堿基超過8、四堿基超過6、五堿基超過5、六堿基超過4后相對豐度接近于0。從重復次數(shù)變化看出，三堿基核心微衛(wèi)星長度的變化次數(shù)最高，二堿基和四堿基核心次之，六堿基核心次數(shù)最少(表4)。

圖1 棘腹蛙微衛(wèi)星長度分布及不同長度微衛(wèi)星頻率

2.6 棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星側(cè)翼序列分析

利用perl腳本截取微衛(wèi)星序列上下游各100 nt的側(cè)翼序列進行GC含量分析，結(jié)果顯示棘腹蛙編碼區(qū)微衛(wèi)星上游序列的GC含量主要集中在38%左右(圖2：A)，下游序列的GC含量主要在41%左右(圖2：B)，均顯著低于轉(zhuǎn)錄組整體GC含量(47%)(圖2：C)。利用本地Blastn程序?qū)Τ蓪Υ嬖诘纳舷掠蝹?cè)翼序列(1160對)與組裝的棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組序列進行同源比對，發(fā)現(xiàn)上下游側(cè)翼序列的查詢覆蓋率均為100%，其中834對側(cè)翼序列為單拷貝，326對側(cè)翼序列查詢?yōu)槎嗫截?，特異性比例?1.9%。

表4 不同重復單元微衛(wèi)星長度變異分析

3 討論

微衛(wèi)星標記是了解種群結(jié)構、種群動態(tài)和基因流等分子生態(tài)學問題的重要工具之一(Roweetal.，2000)。近年來，該技術在兩棲動物分子生態(tài)學的研究中日趨增多，但相對于其他脊椎動物的研究仍處于初級階段，可能與兩棲動物基因組中存在大量的重復序列，導致較低的微衛(wèi)星位點篩選成功率有關(Garner，2002；Jehle & Arntzen，2002；Yuanetal.，2015)。本研究利用高通量測序技術分析了棘腹蛙總長為121 644 048 bp 的編碼區(qū)序列，獲得了3165個微衛(wèi)星位點(表2)，豐富了棘腹蛙微衛(wèi)星標記數(shù)據(jù)庫，為后續(xù)棘腹蛙不同群體的鑒定及地理生態(tài)學的研究提供了基礎資料。

棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組中單堿基(A/T)重復是最豐富的一類微衛(wèi)星，占編碼區(qū)微衛(wèi)星總量的27.3%，屬于絕對優(yōu)勢類型。然而，考慮到本研究是基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行的挖掘，單堿基(A/T)重復的高豐度可能與mRNA的poly(A/T)結(jié)構有關。為了驗證這一結(jié)果，我們統(tǒng)計了位于Contig序列3’或者5’端的微衛(wèi)星數(shù)量，結(jié)果顯示88.2%的A/T核心重復微衛(wèi)星位于Contig序列的3’或者5’端(數(shù)據(jù)未顯示)，說明通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選到的微衛(wèi)星標記，尤其是以A/T為重復核心的微衛(wèi)星標記存在較多的假陽性，在微衛(wèi)星標記的開發(fā)過程中應該加以區(qū)分。

圖2 微衛(wèi)星側(cè)翼序列及轉(zhuǎn)錄組GC含量分析

A. 微衛(wèi)星上游側(cè)翼序列GC含量The GC content of upstream flanking sequences of microsatellite, B. 微衛(wèi)星下游側(cè)翼序列GC含量The GC content of downstream flanking sequences of microsatellite, C. 轉(zhuǎn)錄組序列GC含量The GC content of transcriptomic sequences.

目前已在小樹蛙Dendropsophusminutus、高山倭蛙Nanoranaparkeri、鳙、巖原鯉Procyprisrabaudi、長江江豚Neophocaenaphocaenoidesasiaeorientalis等物種中分離出大量的微衛(wèi)星分子標記(魯翠云等，2005；袁慧等，2008；鄭勁松等，2008；Wangetal.，2013；Oyamaguchietal.，2015)，主要以二堿基核苷酸核心序列為主，然而在棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組序列中，三堿基重復類型是僅次于單堿基重復的類型(表3)。Kijas等(1997)在有關于堿基重復類型的研究中指出，三堿基和四堿基重復單元比二堿基重復單元具有更高的遺傳穩(wěn)定性。但由于三堿基、四堿基核苷酸在真核生物基因組重復較少，傳統(tǒng)的分離方法效率較低，能夠獲得的序列有限，而高通量測序的應用完美地解決了這個難題。曾曉蕓等(2015)通過Mi-Seq篩選裸體異鰾鰍Xenophysogobionudicorpa的微衛(wèi)星標記，發(fā)現(xiàn)三堿基重復類型中優(yōu)勢類型是AAT。而本實驗中卻是AGG，原因可能是通過編碼區(qū)篩選到的微衛(wèi)星與基因組篩選微衛(wèi)星存在差異(周小龍等，2013)。棘腹蛙二核苷酸重復類型中AC/GT重復最多，與中國對蝦、雜色鮑Haliotisdiversicolor和刺參Apostichopusjaponicus等大多數(shù)水產(chǎn)動物的研究結(jié)果相一致(孫國華等，2010)，推測這可能與不同編碼基因的堿基組成偏好及體內(nèi)甲基化酶活性有關。在四堿基、五堿基、六堿基重復中，重復單元種類分別有23種、38種和83種，重復類型豐富，但分布相對分散，說明堿基偏倚性不太明顯。從棘腹蛙微衛(wèi)星的單元重復次數(shù)和長度來看，主要集中在6次重復，約20 bp(圖1，表4)。通常認為微衛(wèi)星重復單元長度的變化與選擇壓力密切相關，重復單元長度越長，所受的選擇壓力越大，拷貝數(shù)就越少，因此基因組中長度較短的微衛(wèi)星變異速率較快，而較長的重復單元變異速率較慢，相對較為穩(wěn)定(Samadietal.，1998)。

微衛(wèi)星DNA均由中間的核心區(qū)和外圍的側(cè)翼區(qū)兩部分構成(Mrazeketal.，2007)。核心區(qū)為串聯(lián)在一起的重復序列，重復單元數(shù)目多樣，串聯(lián)重復單元的上下游序列為側(cè)翼區(qū)。對棘腹蛙編碼區(qū)微衛(wèi)星側(cè)翼序列的分析發(fā)現(xiàn)，上游與下游側(cè)翼區(qū)GC含量均低于轉(zhuǎn)錄組整體(圖2)，這在一定程度上說明側(cè)翼序列對AT的偏好性。利用本地Blastn程序?qū)Τ蓪Υ嬖诘?160對上下游側(cè)翼序列與所測的棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組序列進行比對，發(fā)現(xiàn)834對側(cè)翼序列位于單一微衛(wèi)星的兩側(cè)，為單拷貝，根據(jù)這些序列設計引物能夠特異擴增出含有相應微衛(wèi)星序列的位點；另有326對側(cè)翼序列不僅僅出現(xiàn)在微衛(wèi)星的兩側(cè)，同時也出現(xiàn)在非微衛(wèi)星區(qū)域，為多拷貝，因此根據(jù)這些側(cè)翼序列設計引物不能特異性地擴增出微衛(wèi)星位點。在常規(guī)的微衛(wèi)星引物設計中，通常利用試驗來進行篩選，工作耗時又存在誤差。本研究中利用序列比對分析，可以為后期微衛(wèi)星引物的開發(fā)提供一種可靠而快速的方法。

盡管轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星標記在揭示遺傳多樣性方面要低于基因組微衛(wèi)星標記，但是由于轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星代表了編碼基因表達的信息，能為功能基因提供“絕對”標記(張瓊等，2010；周小龍等，2013)，而且轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星標記的種間通用性較好，從而更有利于分子生態(tài)學的研究。因此，本研究微衛(wèi)星標記的開發(fā)對棘腹蛙的親子譜系分析、群體遺傳結(jié)構分析、圖譜構建以及分子輔助育種等研究方面具有重要參考和利用價值。

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四川鳥類新紀錄——黑翅鳶

2015年3月28日09∶30左右，在攀枝花市鹽邊縣紅格鎮(zhèn)新農(nóng)村境內(nèi)(26°28′28.08″N，101°53′25.86″E，海拔1234 m)發(fā)現(xiàn)2只鷹科鳥類，經(jīng)相機拍攝和雙筒望遠鏡觀察確認為黑翅鳶Elanuscaeruleus。發(fā)現(xiàn)時該鳥停歇于農(nóng)田和果園附近的電線上，一段時間后，2只黑翅鳶突然起飛并4爪抓握，在空中進行翻騰和旋轉(zhuǎn)。該鳥體長30～35 cm，全身以白、黑、藍灰色為主基調(diào)。眼先及眼上部呈黑色，虹膜呈血紅色，喙黑色。前額至頭頸部為白灰色，后頸、背、腰、尾上覆羽、初級飛羽、次級飛羽及初級覆羽呈藍灰色。小覆羽和中覆羽呈黑色。除初級飛羽下表面呈黑色外，整個腹面和翅下覆羽為白灰色。趾和跗跖呈深黃色，爪黑色，跗跖一半被羽，一半裸露。平尾，尾羽中間略凹。

黑翅鳶隸屬于隼形目Falconiformes鷹科Accipitridae黑翅鳶屬Elanus，為國家Ⅱ級重點保護鳥類，現(xiàn)已被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》附錄Ⅱ(2015)。其主要分布于非洲、亞洲南部、歐洲西南部和美洲(高瑋，2002；Karaka，2012)，在國內(nèi)見于云南、廣西、浙江、河北、海南、廣東、福建、香港、臺灣、江西、山東、天津、北京(史海濤，1998；高育仁等，2002；林清閑等，2004；單凱等，2005；王鳳琴等，2006；聞丞等，2013)，近年來有向北擴散的趨勢(單凱等，2005；王鳳琴等，2006；聞丞等，2013)。

此前西昌的薛敏先生(網(wǎng)名：美文兄)于2013年11月14日在西昌邛海曾拍攝到2只黑翅鳶，但已有文獻資料(李桂垣等，1985；李桂垣，1993；張俊范，2007；徐雨等，2008；鄭光美，2011)及觀鳥記錄中尚無該鳥在四川分布的正式報道。因此，此次發(fā)現(xiàn)的黑翅鳶應為四川鳥類新紀錄。

黑翅鳶Elanus caeruleus (王平 攝)

王疆評1, 王平2, 劉洋1, 孫治宇1, 鐘光輝2

(1. 四川省林業(yè)科學研究院，成都610081； 2. 宜賓學院，四川宜賓644000)

E-mail：31696343@qq.com

Analysis of Microsatellite Composition inPaaboulengeriusing RNA-seq

JIANG Yusong1, FAN Wenqiao1, XU Jingming2*

(1. College of Life Science & Forestry, Chongqing University of Art & Science, Chongqing 402160, China;2. Chongqing Research Centers of Conservation & Development on Rare & Endangered Aquatic Resources, Chongqing 402168, China)

The genetic and genomic information ofPaaboulengeriwas relatively lacking, which have caused a limited number of effective DNA markers. Based on the RNA-seq database, microsatellite markers inP.boulengeriwere analyzed by the Misa program. A total of 3165 microsatellite loci that occurred in 3034 Contig sequences were identified in a total of 121.6 Mb nucleotides. Mononucletide repeats was the major types, followed by the trinucleotide, dinucleotide, tetranucleotide, hexanucleoide and pentanucleotide, accounting for 29.0%, 25.2%, 21.7%, 10.0%, 10.0% and 3.0%, respectively. A/T, AC/GT, AGG/CCT, ACAT/ATCT, AAAAT/ATTTT and AAAAAG/CTTTTT were the most frequent motifs in mon-, din-, tri-, tetra-, penta- and hexa-nucleotide repeats, and all of them were rich in A or T. The average length of microsatellites in the coding region ofP.boulengeriwas 18-24 bp, and the length more than 24 bp only accounted for 0.92%. In addition, we found that the GC content of the flanking sequences was significantly lower than that of transcriptomic sequences. For the Contig sequences with paired flanking sequences longer than 50 nt, 71.9% of them contained the sequences corresponding to the predicted microsatellite loci as determined by PCR. These results provided abundant sequences and microsatellite markers for molecular phylogeography and genetic research onP.boulengeri.

high-throughput sequencing;Paaboulengeri; microsatellite

10.11984/j.issn.1000-7083.20150147

2015-04-24 接受日期：2015-10-10 基金項目:重慶文理學院人才引進項目(R2014LX07，R2013LS13); 重慶市前沿與應用基礎研究(一般)項目(cstc2014jcyjA80042); 重慶市科技攻關計劃(cstc2012gg-yyjs80004)

姜玉松(1984—), 博士, 講師, 主要從事基因的分子生物學研究, E-mail:jysong@126.com

*通信作者Corresponding author， 博士, 教授, 主要從事兩棲動物的分子系統(tǒng)地理學研究, E-mail:proteomics@163.com

Q78; Q959.5

A

1000-7083(2016)01-0024-07

全國第二次陸生野生動物調(diào)查——金沙江雅礱江切割山地