王 巖(黑龍江省環(huán)境應(yīng)急與事故調(diào)查中心 黑龍江 哈爾濱 150040)

低溫淀粉菌群篩選及對(duì)降解率的影響

王 巖(黑龍江省環(huán)境應(yīng)急與事故調(diào)查中心 黑龍江 哈爾濱 150040)

北方大量農(nóng)業(yè)廢棄物堆積，通過(guò)對(duì)農(nóng)業(yè)廢棄物篩選，得到淀粉的低溫降解單菌。將這些單菌進(jìn)行混合、復(fù)配，得到低溫淀粉菌群，使降解率提高12.81％。同時(shí)低溫淀粉降解菌群可使物料升溫，從而進(jìn)入中溫期，帶動(dòng)中溫菌株和高溫菌株生長(zhǎng)、繁殖，產(chǎn)生大量的生物能，進(jìn)入高溫階段，完成物料的無(wú)害化處理。

低溫菌株；降解菌；混合發(fā)酵劑；淀粉；溫度

黑龍江省處于中國(guó)最北端，是高寒高緯度地區(qū)，同時(shí)作為全國(guó)的產(chǎn)糧大省，每年有大量的秸稈、畜禽糞便等農(nóng)業(yè)廢棄物無(wú)法得到及時(shí)有效的處置，致使大量秸稈焚燒造成環(huán)境嚴(yán)重污染和資源浪費(fèi)。提高溫度是低溫發(fā)酵技術(shù)的關(guān)鍵，快速進(jìn)入高溫期決定整個(gè)發(fā)酵的周期和無(wú)害化進(jìn)程。

多數(shù)淀粉降解菌屬于嗜冷菌，嗜冷菌通過(guò)自身特殊的生理機(jī)制在低溫條件下能夠降解淀粉并使物料溫度迅速升高，從而帶動(dòng)其他有機(jī)物降解菌，如纖維素降解菌等中溫菌進(jìn)入中溫期。纖維素降解菌的分解作用可以繼續(xù)提升物料溫度，進(jìn)入高溫期完成物料無(wú)害化處理。

本試驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)室中長(zhǎng)期保存的土壤、堆肥樣品中篩選出不同菌株，根據(jù)溫度對(duì)其的影響，篩選出具有協(xié)同作用的低溫復(fù)合淀粉降解菌劑，用于農(nóng)業(yè)廢棄物中淀粉的降解。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試驗(yàn)試劑

乳糖、氯化鉀、硝酸鈉、氫氧化鈉、乙酸鈉、羧甲基纖維素鈉、硫酸亞鐵、苯酚、冰乙酸等分析純?cè)噭?/p>

牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、微晶纖維素等生物試劑。

乳糖蛋白胨培養(yǎng)基、酪素培養(yǎng)基、羧甲基纖維素培養(yǎng)基、Hutchison液體培養(yǎng)基、酪素培養(yǎng)基等培養(yǎng)基。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

YXQ-SG56-480S型不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器、SPX-460D-Z型生化培養(yǎng)箱、THZ-56D型氣浴恒溫振蕩器、TGL-34E高速臺(tái)式離心機(jī)、856N型可見分光光度計(jì)等儀器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

樣品取自于哈爾濱市信義村的自然堆肥堆，主要成分為牛糞、秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物，以及大慶雙榆樹鄉(xiāng)的堿性土壤。

1.2.2 菌株的分離與提純

取10g樣品加入100ml蒸餾水于錐形瓶中，置于120r/min、20℃的搖床中，充分搖動(dòng)，使菌種完全游離。3d后，按照濃度梯度將菌液進(jìn)行稀釋，并在LB培養(yǎng)基上均勻涂布。菌落生長(zhǎng)茂盛后，將單體菌落轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基上，反復(fù)劃線后，得到純菌落。

1.2.3 低溫淀粉降解菌的篩選

將分離、提純的單菌菌株于15℃條件下，點(diǎn)接在淀粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)。菌落生長(zhǎng)茂盛后滴加少量碘液，并使碘液均勻布滿培養(yǎng)基上。具有分解淀粉能力的菌落周圍會(huì)出現(xiàn)透明圈，用劃線法將其純化。

1.2.4 低溫淀粉降解單菌的混合

將得到的低溫淀粉降解單菌進(jìn)行混合培養(yǎng)，8℃恒溫條件下培養(yǎng)5d后觀察生長(zhǎng)情況。若在兩株菌株仍能正常生長(zhǎng)則代表此兩株菌株間不存在拮抗反應(yīng)，反之則存在拮抗反應(yīng)。

1.2.5 低溫淀粉降解菌降解率的測(cè)定

通過(guò)滴定法測(cè)定淀粉降解菌的降解率。取菌液10ml，定容至100ml。添加30ml 6mol·L-1的HCl溶液，沸水浴中冷凝回流2h。待冷卻后，添加兩滴甲基紅試劑，再添加10mol·L-1的NaOH溶液，滴加5mol·L-1的HCl溶液使溶液變紅，最后添加2.5mol·L-1的NaOH溶液使溶液紅色消失，定容至500ml?？瞻捉M取100ml蒸餾水，進(jìn)行相同操作。根據(jù)公式計(jì)算淀粉含量。

式中：

X—樣品中淀粉含量，％；

F—10ml堿性酒石酸銅相當(dāng)?shù)钠咸烟橇浚琺g；

V—滴定時(shí)樣品水解液消耗量，ml；

V0—滴定時(shí)空白溶液消耗量，ml；

500—樣品水解液總體積，ml；

0.9—還原糖換算淀粉的系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫淀粉降解菌株的分離和純化

低溫條件下，降解菌能夠保持一定的活性，通過(guò)對(duì)物料中的淀粉、糖等簡(jiǎn)單有機(jī)物的降解產(chǎn)生生物能并使肥堆升溫。選擇培養(yǎng)基中透明圈直徑D與菌落直徑d的比值大小則代表著降解淀粉的能力。

通過(guò)表1得知，由樣品分離得到的13株單菌中有8株單菌在淀粉培養(yǎng)基中產(chǎn)生透明圈，其中D2和D6的透明圈與菌落直徑比值較大，其中D2的D/d為5.86，D6的D/d為5.74。由此可知，D2、D6具有較強(qiáng)的淀粉降解能力。

2.2 低溫淀粉降解菌株的混合

表1 菌株的初篩結(jié)果

當(dāng)菌株生長(zhǎng)緩慢被其他菌株覆蓋時(shí)，或是由于相互接觸菌株收到抑制無(wú)法生長(zhǎng)，都說(shuō)明在菌株間存在拮抗作用。

通過(guò)拮抗試驗(yàn)觀察，D2與D6單菌菌株混合培養(yǎng)后仍能正常生長(zhǎng)，不存在拮抗現(xiàn)象。

2.3 混合低溫淀粉降解菌菌群降解率的測(cè)定

由于淀粉的結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，所以分解時(shí)容易產(chǎn)生生物熱能并提高物料溫度。由圖1可知，D2和D6兩株單菌的淀粉分解能力分別為38.82％和35.48％，明顯高于不接菌的對(duì)照組，說(shuō)明這兩株菌都具有較強(qiáng)的淀粉降解能力。混合菌株D2+D6的淀粉降解率達(dá)到了48.29％，較D2和D6分別提高了9.47％和12.81％。

3 結(jié)論

圖1 D2、D6及其組合在低溫下的淀粉降解率

(1)從普通農(nóng)業(yè)廢棄物中篩選出13株單菌，8株具有降解物料中淀粉的功能。其中D2、D6菌株具有較強(qiáng)的降解能力。

(2)混合培養(yǎng)的低溫淀粉降解菌的淀粉降解率達(dá)到48.29％，相比低溫淀粉降解單菌分別提升了9.47％和12.81％。同時(shí)提高物料溫度，進(jìn)入中溫期，從而帶動(dòng)中溫菌株和高溫菌株生長(zhǎng)、繁殖，產(chǎn)生大量的生物能，進(jìn)入高溫階段，完成無(wú)害化處理。

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Screening of Low Temperature Starch Bacteria and Its Effect on Degradation Rate

WangYan(Environmental Emergency and Accident Investigation Center of HeiLongjiang Province Harbin Hei-Longjiang 150040)

In the north，a lot of agricultural wastes are accumulated.Low temperature degradation monoxenies of starch are obtained by screening the agricultural wastes.The monoxenies are mixed to obtain bacterial flora of low temperature starch，and the degradation rate is increased by 12.81％.Low temperature starch degradation flora can heat material to mesothermal condition and drive the growth and reproduction of mesothermal and mesophilic strains.The process produces a large number of biological energy，enters high temperature stage and completes material harmless treatment.

Low temperature bacteria Degrading bacteria Mixed leavening agent Starch Temperature

X835

A

1674-263X(2016)03-0074-03

2016-09-30

王巖(1989-)男，碩士，助理工程師，從事環(huán)境應(yīng)急管理工作。