賈 姝 宋 策 赫英姿 劉孝良 于庭洪 趙 翀 左玲玲

(遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所，遼寧鳳城 118100)

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柞蠶微粒子蟲在母蛾不同腹節(jié)分布的研究

賈 姝 宋 策*赫英姿1劉孝良1于庭洪1趙 翀1左玲玲1

(遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所，遼寧鳳城 118100)

研究柞蠶微粒子蟲在母蛾不同部位的分布，對提高柞蠶制種過程中鏡檢準(zhǔn)確性，確保柞蠶種質(zhì)量及柞蠶生產(chǎn)安全性具有重要意義。本研究共檢測了30只患病母蛾不同腹節(jié)的微粒子孢子數(shù)量分布情況，發(fā)現(xiàn)不同感染程度的母蛾均是第一或第二腹節(jié)的微粒子孢子數(shù)量最多，說明病原位置主要密集在第一第二腹節(jié)；重度感染病蛾，各腹節(jié)均可見較多的微粒子孢子，而中度感染和輕微感染母蛾其它腹節(jié)微孢子數(shù)量相對較少。在柞蠶制種鏡檢時(shí)，點(diǎn)片取樣位置不同會(huì)影響鏡檢結(jié)果。

柞蠶微粒子蟲 母蛾腹節(jié) 分布 微粒子病檢測

柞蠶微粒子病(Pebrine of Chinese tussah silkworm)，又稱柞蠶微孢子蟲病，俗稱銹病、渣子病、底子病等[1]，是影響柞蠶生產(chǎn)最為嚴(yán)重的病害之一。其優(yōu)勢病原為柞蠶微粒子蟲(NosemapernyiWen et Ding sp. nov.)[2]，可通過胚胎垂直傳染給子代，給蠶種生產(chǎn)帶來毀滅性病害，因而被列為柞蠶種生產(chǎn)中的唯一檢疫對象[3]。目前在柞蠶制種過程中，控制柞蠶微粒子病的最有效方法是“鏡檢法”，即利用顯微鏡檢測柞蠶微孢子蟲并淘汰患病蛾卵[4]，該法也是控制微粒子病的根本環(huán)節(jié)[4]。鏡檢法雖然直觀、方便，但該法由于人為、設(shè)備和微孢子蟲發(fā)育階段等因素，常常會(huì)造成漏檢，很難保證淘汰的準(zhǔn)確性和全面性[5]，其中一個(gè)重要影響因素就是點(diǎn)片誤差，對于輕微感病母蛾，采樣不準(zhǔn)，未能取到病原，必定會(huì)造成漏檢，影響蠶種質(zhì)量[6]。本研究測定了柞蠶微粒子蟲在母蛾不同腹節(jié)的分布情況，以確定病原相對密集部位，為鏡檢時(shí)準(zhǔn)確取樣提供依據(jù)，以確保鏡檢準(zhǔn)確性，提高微粒子病的控制效果，實(shí)現(xiàn)柞蠶產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 材料

柞蠶微粒子病母蛾

1.2 試驗(yàn)方法

取產(chǎn)完卵的柞蠶微粒子病母蛾30只，置于-20℃冰箱中冷凍保存。用刀片將冷凍的病蛾解剖并收集其第一至第五及末端腹節(jié)(雌蛾可見7個(gè)腹節(jié)，第八至第十腹節(jié)形成外生殖器，稱為 “生殖節(jié)”[2]，第七腹節(jié)短小，故第六、第七腹節(jié)與生殖節(jié)合并為末端腹節(jié))，稱重，加3 mL蒸餾水充分研磨[7]，收集濾液經(jīng)500 r/min，離心1 min，取上清液，再經(jīng)3000 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清，用PBS緩沖液(pH 7.8)懸浮沉淀，再經(jīng)3000 r/min，4℃離心5 min，重復(fù)3次，離心后棄上清，按每1 g重量添加1 mL無菌水混勻沉淀，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

微粒子病蛾的感病程度按計(jì)數(shù)板上微粒子孢子的密集程度劃分為“輕微感染”、“中度感染”、“重度感染”。 “輕微感染”病蛾為每3個(gè)視野或以上視野可見1～5個(gè)微粒子孢子；“中度感染”病蛾為每個(gè)視野或每2個(gè)視野可見1～10個(gè)微粒子孢子；“重度感染”病蛾為每個(gè)視野有10個(gè)以上微粒子孢子。

2.1 輕微感染病蛾

測定輕微感染微粒子病母蛾不同腹節(jié)的微孢子數(shù)量分布如表1所示。結(jié)果顯示，3、5、6、7、9號(hào)病蛾第一腹節(jié)的微粒子孢子最多；而1、2、4、8號(hào)病蛾第二腹節(jié)微孢子最多，這可能與不同微病母蛾的個(gè)體差異有關(guān)。對于輕微感染的母蛾，部分中間腹節(jié)未發(fā)現(xiàn)微粒子孢子，而在第五腹節(jié)、及末端腹節(jié)發(fā)現(xiàn)微粒子孢子并且數(shù)量相對較多。

表1 輕微感染病蛾不同腹節(jié)微粒子數(shù)量分布

2.2中度感染病蛾

測定中度感染微粒子病母蛾不同腹節(jié)的微孢子數(shù)量分布如表2所示。結(jié)果顯示，1、2、3、6、8號(hào)病蛾的第一腹節(jié)微粒子孢子最多；而4、5、7、9、10、11、12號(hào)病蛾病原密集的位置為第二腹節(jié)。

2.3 重度感染病蛾

測定重度感染微粒子蟲母蛾不同腹節(jié)的微孢子數(shù)量分布如表3所示。結(jié)果顯示，2、3、4、6、7、9號(hào)病蛾第一腹節(jié)的微孢子最多；1、5號(hào)和8號(hào)病蛾第二腹節(jié)的微孢子最多。

表2 中度感染病蛾不同腹節(jié)微粒子數(shù)量分布

表3 重度感染病蛾不同腹節(jié)微粒子數(shù)量分布

3 結(jié)論與討論

本文測定了柞蠶微粒子病母蛾不同腹節(jié)的微粒子孢子數(shù)量分布。結(jié)果表明，輕微感染母蛾、中度感染母蛾、重度感染母蛾均是第一或第二腹節(jié)的微孢子最多，說明其病原相對密集部位在第一第二腹節(jié)。在光學(xué)顯微鏡下，對于重度感染病蛾，各腹節(jié)均可見較多的微粒子孢子，因而點(diǎn)片的不同取樣位置不會(huì)影響鏡檢結(jié)果。對于中度感染病蛾，在病原密集部位，每個(gè)視野或每2個(gè)視野可見1～10個(gè)微粒子，而其他部位微粒子孢子相對較少，如果取樣位置不準(zhǔn)確很容易造成漏檢。歷紅達(dá)[8]指出同一頭種蛾，若準(zhǔn)確點(diǎn)取脂肪體，在顯微鏡下就比較容易發(fā)現(xiàn)微粒子孢子，如果平均每個(gè)視野里分布有10個(gè)以下的孢子，點(diǎn)取蛾體其他部位的樣片，檢出微粒子孢子的概率會(huì)降至5%以下。對于輕微感染母蛾，由于感染程度輕，微粒子孢子未擴(kuò)散到蛾體部分中間腹節(jié)，而第一、第二腹節(jié)為母蛾中腸位置，是微粒子孢子最先感染增殖的位置[2]，第五腹節(jié)及末端腹節(jié)是母蛾的生殖器位置，這可能是因?yàn)樽跣Q微粒子病有垂直傳播的特點(diǎn)，因而微粒子孢子也能擴(kuò)散到母蛾的生殖器官。因此，點(diǎn)片取樣時(shí)是否能采集病原密集部位對于是否能準(zhǔn)確檢出微粒子病蛾至關(guān)重要。

對于如何提高鏡檢法在柞蠶制種中的準(zhǔn)確性，相關(guān)學(xué)者做了研究，提出了2次檢查[5]、對檢法[4]，對提高檢出率效果顯著，本文研究了微病母蛾不同腹節(jié)的微孢子的數(shù)量分布，確定了其病原相對密集部位，為柞蠶制種過程中的微粒子檢測提供了理論依據(jù)和指導(dǎo)。

雖然通過鏡檢方法的改進(jìn)可以在一定程度提高鏡檢效果，但是這些都需要消耗大量的人力，降低了工作效率。近年來，關(guān)于微粒子病檢測新方法也取得了一定成果，建立了PCR技術(shù)檢測[9]、ELISA檢測法[10]，準(zhǔn)確性高，但操作成本高、周期長；提出了膠體金免疫層析檢測法[11]，雖簡便快捷，但靈敏度低，以致新方法尚未在柞蠶生產(chǎn)中推廣和應(yīng)用。因此，亟待研究建立一種簡便、快捷、準(zhǔn)確的柞蠶微孢子蟲檢查技術(shù)(如對于家蠶微粒子病檢測中的PCR檢驗(yàn)試劑盒[12]或快速檢測試紙[13])，來彌補(bǔ)鏡檢法在生產(chǎn)應(yīng)用中的不足，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而杜絕柞蠶微粒子病的胚種傳染。

[1] 李樹英,秦利.柞蠶病理學(xué)[M].遼寧科學(xué)技術(shù)出版社,2015:135.

[2] 遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所.中國柞蠶[M].遼寧科學(xué)技術(shù)出版,2003:64.

[3] 秦利.中國柞蠶學(xué)[M].北京:中國科學(xué)文化出版社,2003:347-352.

[4] 魏慶國,呂明濤.對檢法在柞蠶微粒子病鏡檢中的應(yīng)用實(shí)踐[J].北方蠶業(yè),2011,32(2):63-65.

[5] 季春廣,王秉義,劉忠春.蛾期鏡檢柞蠶微粒子病應(yīng)注意的幾個(gè)問題[J].疾病防治,2010,4:18.[6] 姜義仁.柞蠶微孢子蟲檢測及感染柞蠶中腸轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué),2012:23-24.

[7] 姜義仁,鄧真華,王伯陽,等.柞蠶微孢子蟲孢子分離純化方法[J].應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào),2011,48(2):452-456.

[8] 歷紅達(dá),李喜升.論柞蠶微粒子病的顯微鏡補(bǔ)正檢查[J].中國蠶業(yè),2003,24(5):47.

[9] 鄧真華,姜義仁,楊瑞生,等.應(yīng)用PCR技術(shù)檢測柞蠶微孢子蟲[J].蠶業(yè)科學(xué),2010,36(2):359-362.

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[13] 蘆琨.家蠶微粒子病免疫學(xué)快速檢測試紙條的研制[D].西南大學(xué),2009:38-41.

Study on Distribution of Nosema pernyi at Different Parts of Female Moth

JIA Shu，SONG Ce*，HE Yingzi ，LIU Xiaoliang，YU Tinghong，ZHAO Chong，ZUO Lingling

(Liaoning Provincial Sericultural Research Institute,118100, Fhengcheng, Liaoning, China)

Studying the distribution of Nosema pernyi at different parts of female moth is of significance for improving accuracy microscopy, ensuring tussah’s quality and production safety. This research tested the contents of Nosema pernyi in different abdominal sections of 30 female moths. According to statistics result, the density of the first and second abdominal section is the highest. The results show that pathogenic location was mainly in 1 ～ 2 abdomen section. For severely infected moth, high density of Nosema pernyi was observed at different abdominal segments, and lower density of it was found at other abdominal segments for mild and moderate infection female moth. It is concluded the sampling position could affect the results of microscopy in the process of seed production microscopy.

Nosemapernyi; female moth abdominal segment; distribution; detection

賈姝(1987—)，女，碩士，研究實(shí)習(xí)員，從事柞蠶病害防治研究工作。

宋策(1966—)，男，研究員。E-mail：songce2006@163.com.