張 洋 金 英 薛 強(qiáng) 沈 群 張俊輝

(吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院，吉林吉林 132112)

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適于蟻蠶的基因組DNA提取方法

張 洋 金 英 薛 強(qiáng) 沈 群 張俊輝

(吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院，吉林吉林 132112)

昆蟲基因組DNA提取是對昆蟲在分子水平上進(jìn)行研究的關(guān)鍵，提取的DNA的純度、濃度及完整性是進(jìn)行基因工程各項研究所必須的條件。本研究主要對應(yīng)用4種方法，以柞蠶蟻蠶時期組織材料為樣品提取DNA后進(jìn)行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用BIOMIGA試劑盒，置于36℃條件，經(jīng)50 μL蛋白酶K 70℃消化6 h后，5 μLRNase A酶37℃消化10 min，提取的DNA質(zhì)量較好。且樣品易于保存，保存時間長，提取時間短的優(yōu)點，對提高柞蠶研究效率具有實用價值。

蟻蠶 基因組DNA 提取

分子生物學(xué)技術(shù)已成為生命科學(xué)強(qiáng)勁的推動力量，為傳統(tǒng)的及新興的生物學(xué)科注入了新的能量，因此21世紀(jì)被稱為生命科學(xué)的時代。利用分子生物學(xué)技術(shù)從核酸水平對動物進(jìn)行物種鑒定以及探討物種的起源和進(jìn)化，是現(xiàn)在生物系統(tǒng)學(xué)和生物進(jìn)化學(xué)的研究熱點之一，這類研究的第一步也是最關(guān)鍵步驟是獲得物種的脫氧核糖核酸(DNA)[1]。

DNA又稱去氧核糖核酸，是生物體的重要組成部分，是生命科學(xué)研究的物質(zhì)基礎(chǔ)。高質(zhì)量的基因組DNA是進(jìn)行分子標(biāo)記、基因克隆及基因表達(dá)研究等下游技術(shù)的必要前提[2-3]。因此DNA的分離純化成為分子生物學(xué)研究中的一個重要環(huán)節(jié)。為探討一種方便、省時、省力、效果好、簡便易行的提取方法，本研究對蟻蠶為樣品提取DNA的不同方法和條件進(jìn)行了對比分析，期望探索出一種快速、便捷的柞蠶基因組DNA提取方法，以達(dá)到快速高效的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蟻蠶樣品來源于吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院。

1.2 主要試劑與儀器

試劑：Tris(三羥甲基氨基乙烷)、EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)、SDS(十二烷基磺酸鈉)、DTT(二硫蘇糖醇)、CTAB(溴化十六烷三甲基銨)、氯化鈉、β-巰基乙醇、瓊脂糖購自于上海生工。三氯甲烷、異丙醇購自于北京化工廠。

兩種昆蟲DNA提取試劑盒購自于Omega和Biomiga。蛋白酶K、RNase A酶購于北京天根生物技術(shù)有限公司。

儀器：低溫離心機(jī)、紫外成像儀、微量紫外分光光度計、電泳儀、水浴鍋、溫箱。

1.3 樣品處理

單蛾交配后置于產(chǎn)卵袋，置于25℃恒溫育卵，出蠶后(未添食)置于1.5 mL離心管中，加入無水乙醇于-20℃保存。實驗時，每組取10頭蟻蠶，用蒸餾水沖洗，晾干后放入1.5 mL離心管中，加入液氮充分研磨至粉末狀，備用。

1.4 提取方法

1)方法A(SDS)與方法B(CTAB)，參考文獻(xiàn)[4-9]：

①將液氮小心的倒入預(yù)冷的含有樣品的1.5 mL離心管中，用研磨杵將樣品充分研磨粉碎。②A加入650 μL預(yù)熱的SDS斑跡抽提液(10 mMol/L Tris-HCl，pH 8.0； 10 mMol/L EDTA， pH 8.0；100 mMol/L NaCl；2% SDS； 0.039 Mol/L DTT)；B加入650 μL預(yù)熱的CTAB抽提液(100mMol/L Tris-HCl， pH 8.3； 20 mMol/L EDTA， pH 8.3；1.4 Mol/L NaCl； 2% CTAB)漩渦振蕩混勻后加入蛋白酶K，置于56℃條件下水浴。③加入2 μL(10 mg/mL)RNase A酶液，置于36℃條件下水浴。④樣品消化液于4℃，12000 rpm離心10 min。⑤上清移入新的1.5 mL離心管中，加入等體積的苯酚，混勻后靜置片刻，然后于4℃，12000 rpm離心5 min。⑥上清移入新的1.5 mL離心管中，再加入等體積的三氯甲烷∶異戊醇(24∶1)，上下顛倒混勻后靜置片刻，然后于4℃，12000 rpm離心5 min。⑦再將上清移入新的1.5 mL離心管中，加入2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，于-20℃靜置30 min。⑧于4℃，10000 rpm離心10 min，去上清，留沉淀。⑨沉淀用500 μL 70%的乙醇洗滌，于4℃，4000 rpm離心5 min，徹底棄上清。⑩將離心管倒扣在濾紙上，室溫自然干燥后加入75 μL TE緩沖液溶解干燥的DNA。加入2 μL(10 mg/mL)RNase A酶液，于37℃水浴鍋中保溫30 min，然后用氯仿抽提一次。

2)方法C(Omega)、方法D(Biomiga)試劑盒提取方法按照使用說明書步驟進(jìn)行提取，相關(guān)步驟進(jìn)行了調(diào)整。

根據(jù)提取過程中的蛋白酶K、RNase A酶消化時間及使用量，設(shè)置蛋白酶K消化2 h、4 h、6 h、8 h，加入量為12.5 μL、25 μL、37.5 μL、50 μL，RNase A酶消化時間10 min、15 min、20 min、25 min，加入量為2.5 μL、5 μL、7.5 μL、10 μL，設(shè)計四因素四水平的正交試驗，如表1。

表1 正交試驗設(shè)計表

注：KT-蛋白酶K消化時間；ProK-蛋白酶K；R酶-RNase A酶；RT-RNase A酶消化時間

1.5 基因組總DNA瓊脂糖電泳及紫外分光光度計檢測

取4 μL DNA溶液與適量上樣緩沖液(6ⅹLoading buffer)混合，用1.2%瓊脂糖經(jīng)GelRedTM染色后，電泳后經(jīng)紫外成像檢測DNA片段大小及質(zhì)量。用微量紫外分光光度計檢測樣品DNA的OD260/230和OD260/280值及濃度，判斷DNA的純度[10]。

2 結(jié)果與分析

液氮研磨后的蟻蠶為樣品，分別經(jīng)過蛋白酶K消化2 h、4 h、6 h、8 h，加入量分別為12.5 μL、25 μL、37.5 μL、50 μL，RNase A酶消化時間10 min、15 min、20 min、25 min，加入量分別為2.5 μL、5 μL、7.5 μL、10 μL，消化后提取柞蠶基因組，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳展示如圖1-4，結(jié)果可以看出不同消化時間及方法均能成功提取的基因組，DNA的電泳條帶位置在1.5 kb分子量標(biāo)準(zhǔn)帶的上方，且處于同一水平排列，目的條帶清晰、完整。

從圖1-4中可以看出，在不同消化時間及酶處理條件下SDS和CTAB法提取的柞蠶基因組條帶均出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，存在一定程度的降解情況。在250 bp條帶下方有明顯的彌散條帶，表明存在大量RNA，且隨著蛋白酶K、RNase A酶的消化時間的延長及酶添加量的加大而未出現(xiàn)明顯的減弱現(xiàn)象。

應(yīng)用Omega和Biomiga試劑盒在相同的條件下提取基因組，當(dāng)消化時間延長至6 h時，DNA條帶拖尾的現(xiàn)象明顯減弱，當(dāng)酶處理達(dá)到4 h時在電泳圖片中未檢測到RNA及出現(xiàn)DNA的降解情況。

不同方法提取后的DNA樣品經(jīng)微量紫外分光光度計檢測DNA的OD260/230和OD260/280值及濃度，結(jié)果見表2。結(jié)果可見，應(yīng)用Omega和Biomiga試劑盒在相同的條件下提取基因組，OD260/230均大于2.0，Omega試劑盒提取的基因組OD260/280均大于2.0，Biomiga試劑盒提的基因組絕大多數(shù)在1.8≤OD260/280≤2.0范圍內(nèi)，兩種試劑盒提取的DNA濃度隨著蛋白酶K的消化時間的延長而降低，但不具有規(guī)律性。

應(yīng)用SDS、CATB兩種提取方法在相同的條件下提取基因組，OD260/230值絕大多數(shù)均大于2.0，OD260/230值在1.28≤OD260/280≤1.68范圍內(nèi)，絕大部分在相同條件下較Omega和Biomiga試劑盒比值小，說明SDS、CATB兩種提取方法在提取過程中存在蛋白質(zhì)或者氨基酸的濃度污染問題。

觀察表2，可以看出在相同的處理條件下SDS、CATB兩種提取方法的濃度是兩種試劑盒的提取濃度的8～10倍。

比較不同提取方法的濃度含量可以看出，SDS、CTAB方法核酸提取量明顯大于應(yīng)用Omega和Biomiga試劑盒提取的結(jié)果。結(jié)合圖1-4與表2，可以分析出可能是由于大量的DNA降解以及RNA殘留造成濃度結(jié)果偏高。

3 討論

重復(fù)3次試驗，結(jié)合以上電泳圖片和DNA樣品OD值和濃度表?？梢钥闯?，利用Biomiga試劑盒提取柞蠶基因組DNA OD260/280值絕大多數(shù)在1.8≤OD260/280≤2.0范圍內(nèi)，OD260/230均大于2.0，在相同的處理條件下為提取效果最佳。無需其他純化可直接用于下游的分子生物學(xué)試驗。其他不同組方法織均出現(xiàn)DNA裂解、拖尾、點樣孔出現(xiàn)蛋白核酸復(fù)合體等現(xiàn)象?；蚴怯捎跇悠凡牧虾兄尽⒌鞍踪|(zhì)、糖類雜志程度不同對提取結(jié)果造成干擾。

多糖(其他雜質(zhì)等)在OD230具有最大的吸收值，雙鏈DNA在OD260下具有最大的吸收值，蛋白質(zhì)或者氨基酸的濃度在OD280下具有最大的吸收值。樣品中如果含有蛋白質(zhì)及苯酚，OD260/280值會明顯下降。樣品中若含有碳水化合物(糖類)、鹽類或有機(jī)溶劑污染，OD260/230值小于2.0。一般情況下DNA的OD值約為1.8≤OD260/280≤2.0，OD260/230≥2.0。

表2 DNA OD值及濃度

注：處理方法與表1序號相同

比較表2中OD值及濃度可以看出，Omega試劑盒OD260/280≥2.0，存在RNA污染，這一點也可以在圖1-4中看出。SDS、CTAB兩種提取方法OD260/280≤1.8，說明在提取過程中存在蛋白質(zhì)、多酚等物質(zhì)的污染。

SDS、CTAB兩種提取方法在抽提過程中，需要經(jīng)過兩次的轉(zhuǎn)移上清溶液，分析原因應(yīng)該是由于此過程在吸取上清過程中中間層、有機(jī)層溶液吸取，造成對提取結(jié)果的影響。

現(xiàn)有的報道大多從中腸、絲腺[9-11]、蠶蛹[12-15]、五齡蠶足部血液[16]中提取。這些組織在進(jìn)行液氮研磨時較蟻蠶耗時耗力，或提取較多數(shù)量樣本時容易出現(xiàn)樣品間污染的情況，或取樣時間特定、樣品制備時間長，或在保存方面也存在一定程度的困難。相對于蟻蠶在保存時期較上述樣品的保存較容易，可長時間保存于-20℃無水乙醇中。

另一方面，且上述樣品中含有大量的脂肪和蛋白質(zhì)類物質(zhì)等雜質(zhì)，這些物質(zhì)易與DNA結(jié)合形成粘稠的膠狀物，影響基因組DNA的提取。又易抑制Tag酶活性，從而影響PCR反應(yīng)，進(jìn)而影響實驗結(jié)果。而蟻蠶可能由于體內(nèi)組織、雜質(zhì)相對較少、簡單等原因，從而適合提取DNA。

綜上所述，Biomiga試劑盒提取的DNA，質(zhì)量較好，能夠滿足實驗需求?？梢杂糜趯NA量不是要求很高的分子生物學(xué)實驗，如PCR實驗等。

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The Extraction Method of Genomic DNA for Newly Hatched Antheraeapernyi

ZHANG Yang，JIN Ying，XUE Qiang，SHEN Qun，ZHANG Junhui

(Jinlin Sericultural Research Institute,132112,Jilin,Jinlin,China)

Insect genomic DNA extraction is the key to the study of insects at molecular level. The purity, density and completeness of extracted DNA are necessary criteria for genetic engineering researches. This study did a comparative analysis on extracted DNA from samples of newly-hatched silkworms with four methods. The results show the extracted DNA quality is better by using BIOMIGA kit which was placed under 36 degrees Celsius and for 6 hours after 50μl pro K of 70 ℃, digested for 10min by 5μl RNase at 37℃. And the sample was easy to be stored for a long time. These merits plus short extraction time make the study having practical value.

newly-hatchedAntheraeapernyi;genomic DNA;extraction

吉林省財政行業(yè)與基本課題(吉科發(fā)財[2016]40號)

張洋(1983—)，男，碩士，研究方向為柞蠶病蟲害防治。