葉崇軍 李 冰 陳復(fù)生

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所，安徽合肥 230061)

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天然絲膠蛋白及其酶解產(chǎn)物抑制酪氨酸酶活性研究

葉崇軍 李 冰 陳復(fù)生*

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所，安徽合肥 230061)

絲膠蛋白是一種擁有多種特殊功能的蛋白質(zhì)，在化妝品、保健食品及醫(yī)用材料等領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究從全天然絲膠繭中提取絲膠蛋白，采用多種蛋白酶進(jìn)行酶解，選取最佳蛋白酶；測(cè)定絲膠蛋白及其酶解產(chǎn)物的溶解性，分析其對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用。結(jié)果表明：絲膠蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶酶解后產(chǎn)物的分子量集中分布在14～29 kDa，溶解性增強(qiáng)；絲膠蛋白及其酶解產(chǎn)物均能夠抑制酪氨酸酶的活性，尤以分子量較小的酶解產(chǎn)物抑制能力較強(qiáng)；抑制能力與樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈明顯的量效關(guān)系。

絲膠蛋白 木瓜蛋白酶 酶解產(chǎn)物 酪氨酸酶

絲膠蛋白是一種天然的高分子蛋白質(zhì)，呈球狀，約占絲蛋白總量的20%～30%[1-2]。已經(jīng)證實(shí)絲膠中含有18種氨基酸，其中甘氨酸、絲氨酸和丙氮酸的含量都比較高，具有許多藥理作用及保健功能，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于化妝品、保健品、生物醫(yī)學(xué)材料等領(lǐng)域[3-4]。

酪氨酸酶(Tyrosinase)是廣泛存在于人體、動(dòng)物、植物及微生物中的含銅氧化還原酶[5]，具有奇特的催化作用，是生物體內(nèi)黑色素合成的關(guān)鍵酶，與皮膚的衰老及惡性黑色素瘤的發(fā)生有著緊密的關(guān)系[6]。酪氨酸酶的活性受到酪氨酸酶抑制劑的抑制，使生物體內(nèi)不能正常地合成黑色素。因此，在醫(yī)學(xué)和化妝品領(lǐng)域中常采用酪氨酸酶抑制劑來(lái)預(yù)防和治療色素沉積、黑色素瘤等。此外，酪氨酸酶抑制劑還可用作果蔬的防腐及害蟲的調(diào)控劑[7]。當(dāng)前對(duì)酪氨酸酶抑制劑的研究已經(jīng)引起相關(guān)研究學(xué)者的高度重視。絲膠蛋白具有抑制酪氨酸酶的活性是由日本學(xué)者Kato[8]首先發(fā)現(xiàn)。自此之后，盡管也有絲膠蛋白抑制酪氨酸酶活性的報(bào)道，但是絕大多數(shù)所研究的絲膠蛋白都是利用有機(jī)溶劑從工業(yè)廢水中進(jìn)行提取，很大程度上制約了絲膠蛋白在皮膚護(hù)理產(chǎn)品、食品添加劑等領(lǐng)域的應(yīng)用[9]。安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所陳復(fù)生等[10]根據(jù)多年的家蠶遺傳育種工作，選育得到全天然絲膠繭，其天然活性物質(zhì)—絲膠蛋白不僅含量豐富，而且對(duì)皮膚的刺激性小、乳化性能優(yōu)良、安全性高，因而在化妝品和保健食品等行業(yè)中具有廣闊的發(fā)展前景。

本研究以育成的天然絲膠繭為材料，從中提取絲膠蛋白，采用多種蛋白酶進(jìn)行酶解，從中選取最佳蛋白酶；通過(guò)測(cè)定絲膠蛋白及其酶解產(chǎn)物的溶解性，并以多巴為底物，分析其對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用，為發(fā)掘絲膠蛋白這一優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的應(yīng)用潛能提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

天然絲膠繭品種：綠S，由本單位選育并飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度在25℃左右，常規(guī)桑葉育，化蛹后取繭殼作為實(shí)驗(yàn)材料。中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶(南寧龐博生物工程有限公司)，十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、低標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量(Takara公司)，蘑菇酪氨酸酶、L-多巴(美國(guó)Sigma公司)，其他試劑均為分析純。

1.2 絲膠蛋白粉的制備

溫水洗滌蠶繭，60℃烘干后剪碎。準(zhǔn)確稱取5.00 g碎繭殼，加入到含250 mL去離子水的燒瓶中，于高溫滅菌鍋中125℃煮沸2.5 h。室溫冷卻后采用四層紗布過(guò)濾，將所獲得的絲膠溶液進(jìn)行真空抽濾，于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約100 mL。將絲膠蛋白濃縮液在-40℃下預(yù)凍2 h后于-33℃，壓強(qiáng)1 Pa條件下進(jìn)行冷凍真空干燥，所得絲膠粉末即為絲膠蛋白粉[11]。

1.3 蛋白酶對(duì)絲膠蛋白的酶解效果

參照文獻(xiàn)[12]的方法選取中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)提取的絲膠蛋白進(jìn)行酶解。在pH 7.0、反應(yīng)溫度50℃、酶濃度為0.5%、底物濃度10%、反應(yīng)時(shí)間 1 h的條件下進(jìn)行酶解。反應(yīng)結(jié)束后立即加熱至95℃，保持5 min，進(jìn)行滅酶活處理。待溶液冷卻至室溫，即可將獲得的絲膠蛋白酶解產(chǎn)物采用聚丙烯酰氨凝膠電泳法(SDS-PAGE，10%分離膠，5%濃縮膠)測(cè)定其分子量大小。將所得的絲膠蛋白酶解產(chǎn)物濃縮、冷凍干燥，研磨成粉末狀備用。

1.4 絲膠蛋白及其酶解產(chǎn)物的溶解性

準(zhǔn)確稱取1.00 g絲膠蛋白及酶解產(chǎn)物，配成質(zhì)量百分比為10%的懸浮液，于95℃水浴鍋中振蕩保溫2.5 h后，5000 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min，然后將上清液置于平面皿中烘干(60℃)，稱取溶出物的質(zhì)量，根據(jù)以下公式計(jì)算溶解率。

溶解率=m /m0×100

其中m為溶出物的干質(zhì)量，m0為樣品的干質(zhì)量。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

1.5 酪氨酸酶活性的抑制率測(cè)定

在黑色素合成的過(guò)程中，酪氨酸在酪氨酸酶的作用下轉(zhuǎn)化為多巴。多巴又被酪氨酸酶催化為多巴醌。多巴醌是體內(nèi)黑色素合成的一個(gè)中間體，也是一種有色物質(zhì)，可用分光光度計(jì)在475 nm處測(cè)定其含量[13]。

準(zhǔn)確吸取絲膠蛋白或酶解產(chǎn)物溶液、磷酸緩沖液(pH 6.8)、L-多巴溶液(0.5 mg/mL)比色管中混合均勻，25℃下放置約10 min ，緩慢加入適量的酪氨酸酶液，迅速轉(zhuǎn)移到石英比色皿中，于475 nm處測(cè)第10 min 的吸光度。pH 6.8的磷酸緩沖液為參比，總反應(yīng)體系為5 mL。具體各組分含量見(jiàn)表1。

表1 反應(yīng)液的組成

酪氨酸酶活性的抑制率(%) =[1- (OD3- OD4)/( OD1- OD2)]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶對(duì)絲膠蛋白的酶解效果

在蛋白酶(木瓜/中性/堿性蛋白酶)濃度為0.5%，pH 7.0，50℃，底物濃度10%，反應(yīng)時(shí)間1 h的條件下，分析這3種蛋白酶對(duì)絲膠蛋白的酶解效果。由圖1可以看出，絲膠蛋白的分子量在14～97.2 kDa均有分布；絲膠蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶降解后，其酶解產(chǎn)物的分子量集中分布

在14～29 kDa；而中性蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)絲膠蛋白的水解作用與對(duì)照組(無(wú)蛋白酶)相比幾乎沒(méi)有差別。顯而易見(jiàn)，木瓜蛋白酶對(duì)絲膠蛋白的酶解功效優(yōu)于其他兩種蛋白酶。因此，選取絲膠蛋白的木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物進(jìn)行下一步研究。

3—中性蛋白酶 4—堿性蛋白酶 M—蛋白標(biāo)準(zhǔn)

圖1 蛋白酶對(duì)絲膠蛋白的酶解效果(SDS-PAGE圖譜)

2.2 絲膠蛋白及酶解產(chǎn)物的溶解性

如表2所示，酶解產(chǎn)物的平均溶解率(68.83%)高于絲膠蛋白(52.77%)。猜想原因可能是絲膠蛋白的肽鏈被木瓜蛋白酶切斷，蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)受到損壞，從而使水解產(chǎn)物本身含有的親水性基團(tuán)暴露出來(lái)，與外界的水更易結(jié)合，最終使其溶解性增強(qiáng)[14]。

2.3 絲膠蛋白及其酶解產(chǎn)物抑制酪氨酸酶的活性

絲膠蛋白及其酶解產(chǎn)物都具有不同程度的抗酪氨酸酶活性的能力(圖2)。在相同的濃度下，酶解產(chǎn)物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率要高于絲膠蛋白，可能是因?yàn)槊附猱a(chǎn)物的分子量較小。隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，絲膠蛋白對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率也隨之提高，說(shuō)明絲膠蛋白的濃度與酪氨酸酶活性的抑制作用成正相關(guān)關(guān)系。酶解產(chǎn)物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率也出現(xiàn)類似現(xiàn)象，呈劑量依賴性。

表2絲膠蛋白及酶解產(chǎn)物的溶解率

3 討論

采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性白酶降解高分子量的絲膠，結(jié)果顯示木瓜蛋白酶降解能力高于其他兩種蛋白酶。SDS-PAGE結(jié)果顯示使用木瓜蛋白酶在反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度 50℃、底物濃度10%、pH 7.0、酶濃度0.5%、反應(yīng)時(shí)間為1 h，可以獲得在14～29 kDa范圍的酶解產(chǎn)物(圖1)。這是因?yàn)槟竟系鞍酌鸽`屬于巰基蛋白酶，首先分解精氨酸、賴氨酸的羧基端[15]。而絲膠蛋白含有較為豐富的精氨酸，經(jīng)木瓜蛋白酶酶解后，釋放出小分子的多肽和游離氨基酸[14]。這就說(shuō)明了絲膠蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶降解后產(chǎn)物的分子量大幅減少。

絲膠蛋白中含有大量的親水性氨基酸，其中絕大多數(shù)都能夠被人體吸收，并且含有類黃酮等活性物質(zhì)[16]。而黃酮類物質(zhì)已經(jīng)被證實(shí)具有抑制酪氨酸活性的作用[17]。這從理論上闡明了絲膠蛋白抑制酪氨酸酶活性的機(jī)制。本研究及前人的研究結(jié)果也進(jìn)一步證明絲膠蛋白能夠抑制酪氨酸酶活性[18]。

在本研究中，絲膠蛋白的酶解產(chǎn)物對(duì)酪氨酸酶同樣具有抑制作用，且隨著酶解產(chǎn)物濃度的增加，其對(duì)酪氨酸酶的抑制率也隨之提高，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。這是因?yàn)榻z膠蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶降解后產(chǎn)生了小分子量的絲膠多肽。這些多肽中又含有豐富的羥基、羧基等官能團(tuán)，使其與微量元素如銅、鐵絡(luò)合的幾率大大提高，最終抑制了酪氨酸酶的活性[7-8]。

絲膠及其水解產(chǎn)物可以根據(jù)其分子量大小應(yīng)用到不同的領(lǐng)域中。10～70 kDa的絲膠多肽與胰島素共軛結(jié)合后添加到糖尿病小鼠中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種經(jīng)過(guò)改良后的藥物能夠起到緩釋作用[19]；4～60 kDa的絲膠多肽能夠頭發(fā)護(hù)理產(chǎn)品中常用的添加劑—水溶性的殼聚糖衍生物以及三甲胺衍生物發(fā)生相互作用，更好地發(fā)揮產(chǎn)品的優(yōu)良性能[12]；平均分子量為30 kDa的絲膠多肽可以取代哺乳類動(dòng)物、昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中的胎牛血清，從而大幅度地降低成本[20]；低于20 kDa的絲膠多肽還可以應(yīng)用到包括皮膚和頭發(fā)護(hù)理產(chǎn)品的化妝品、保健品和藥物中[21]。

綜上所述，絲膠蛋白及小分子量的酶解產(chǎn)物都具有明顯的抑制酪氨酸酶活性的作用，且同時(shí)具備保濕、抗氧化、紫外吸收等功能特性，在化妝品領(lǐng)域中具有優(yōu)越的應(yīng)用潛能，已引起相關(guān)研究者的密切關(guān)注。然而，如何充分利用優(yōu)質(zhì)的絲膠蛋白質(zhì)資源，和將其應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中還有待進(jìn)一步研究。

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Inhibition of Natural Sericin Protein and its Enzymatic Hydrolysate on Tyrosinase Activity

YE Chongjun，LI Bing，CHEN Fusheng*

(The Sericultural Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, 230061,Hefei ,China)

Sericin is a protein with variety of unique features, which has significant application value the fields of food, cosmetics and medical materials. In this study, sericin cocoons were used to extract sericin which was enzymatically hydrolyzed by various proteases to select the best protease. The solubility of sericin protein and its hydrolysate was determined to analyze its inhibitory effect on tyrosinase activity. The results showed that the molecular mass after dealing with papain hydrolysate was between 14 kDa and 29 kDa，with strong solubility. Sericin and its enzymatic hydrolysate have different degrees of inhibitory effect on tyrosinase activity, especially, the sericin peptide sample with lower molecular mass having greater inhibitory effect. In addition, inhibitory effect and mass fraction of samples displayed an obvious dose-effect relationship.

sericin protein；Papain；enzymatich ydrolysate；tyrosinase

國(guó)家蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系合肥綜合實(shí)驗(yàn)站(CARS-22-SYZ09)；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子工程項(xiàng)目(15B0605)

葉崇軍(1983—)，女，碩士，助理研究員。

陳復(fù)生(1958—)，男，博士，研究員。E-mail：chenfs58@163.com