梁恒之

(建德市畜牧獸醫(yī)局，浙江建德 311600)

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膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)在豬病檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

梁恒之

(建德市畜牧獸醫(yī)局，浙江建德 311600)

膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)是以膠體金為標(biāo)記物，利用抗原抗體的特異性反應(yīng)，對(duì)抗原(或抗體)物質(zhì)進(jìn)行定性、半定量乃至定量研究的免疫檢測(cè)技術(shù)，是融合酶聯(lián)免疫吸附、單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)和新材料技術(shù)等多種技術(shù)，建立的一種新型體外快速診斷技術(shù)。

GICA的主要原理是以硝酸纖維素膜為載體，將膠體金標(biāo)記物固定在金標(biāo)塾上，其一端與膜相連，另一端與樣品墊相連，將己知的特異性抗原或抗體固定于膜上的檢測(cè)線。利用微孔膜的毛細(xì)管作用，使樣品溶液(全血、血清、尿或其他體液)在層析條上泳動(dòng)，若樣品中含有待測(cè)物，則標(biāo)記蛋白與待測(cè)物形成的復(fù)合物與檢測(cè)線上的抗體(或抗原)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，復(fù)合物被檢測(cè)線捕獲，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紅色條帶(T)；如樣品中不含待測(cè)物，則會(huì)和游離標(biāo)記物一起越過(guò)檢測(cè)線，可被質(zhì)控線截留，出現(xiàn)明顯的紅色條帶(C)。因此，可以根據(jù)試紙條上檢測(cè)線和質(zhì)控線的顯色情況判斷樣品溶液中是否含有待測(cè)物以及試紙條是否失效[1-2]。

GICA具有快速簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低廉，通常數(shù)分鐘內(nèi)就可用肉眼直觀判斷檢測(cè)結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)。

圖1 膠體金免疫層析技術(shù)示意圖

1 豬瘟病毒檢測(cè)

豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒引起的一種高度接觸性的烈性傳染病，對(duì)養(yǎng)豬生產(chǎn)的危害極大，多年來(lái)一直是我國(guó)豬病防治研究的首要對(duì)象之一。世界許多國(guó)家雖采取了許多措施較好地控制了豬瘟的大規(guī)模流行,但自20世紀(jì)70年代末以來(lái)豬瘟的流行與發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了很大變化,近年來(lái)豬瘟疫情又呈明顯上升趨勢(shì),臨床表現(xiàn)更為復(fù)雜?！敦i瘟檢疫技術(shù)規(guī)范》(GB/T16551)提供了兔體交叉免疫試驗(yàn)、免疫酶染色試驗(yàn)、病毒分離與增毒試驗(yàn)、直接免疫熒光抗體試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法[2]，但上述方法對(duì)儀器設(shè)備和人員要求較高，且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，不適用于屠宰檢疫環(huán)節(jié)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求。

王向鵬等(2010)[3]建立了檢測(cè)豬瘟病毒(CSFV)野毒的膠體金免疫層析方法(GICA),該研究采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒,標(biāo)記純化的抗CSFVE2蛋白的單克隆抗體(MAb)6E10作為捕捉抗體,將純化的抗CSFVE2蛋白MAbHQ06和兔抗鼠IgG抗體包被在硝酸纖維素膜上,分別作為檢測(cè)線(T)和質(zhì)控線(C),優(yōu)化反應(yīng)條件,組裝成膠體金免疫層析試紙條。該試紙條不與豬瘟兔化弱毒(HCLV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬輪狀病毒(PRV)、偽狂犬病病毒(PrV)、豬細(xì)小病毒(PPV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)產(chǎn)生反應(yīng)。所制備的試紙條具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性,初步達(dá)到了區(qū)分檢測(cè)CSFV野毒株和弱毒株的目的，檢測(cè)效果良好。

楊明(2009)[4]建立了檢測(cè)豬瘟病毒的膠體金免疫層析法(GICA)。該研究主要采用檸檬酸鈉還原法制備膠體顆粒,用辛酸-硫酸銨鹽析法純化小鼠抗CSFV抗體,確定標(biāo)記膠體金的最適pH值和抗體的最佳包被量,用膠體金標(biāo)記抗體,且包被在玻璃纖維膜上,另將純化的CSF抗體和羊抗鼠抗體包被在硝酸纖維膜上,組裝成CSF快速檢測(cè)試紙條,對(duì)豬瘟病毒進(jìn)行檢測(cè)。使用所研制的CSF快速檢測(cè)試紙條陽(yáng)性符合率達(dá)92.8%,且敏感性較高,用試制條對(duì)NDV、EDS-76病毒、TGEV、PRRSV等病毒進(jìn)行快速檢測(cè),其結(jié)果無(wú)交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。

表1 兩種豬瘟病毒快速檢測(cè)方法比較

2 口蹄疫病毒檢測(cè)

口蹄疫(FMD)是多種偶蹄動(dòng)物共患的急性、熱性、高度接觸性傳染病，是全球最重要的影響動(dòng)物健康疫病之一，世界各地時(shí)有發(fā)生。該病傳播媒介眾多、速度快，是世界性流行性傳染病之一。FMDV引發(fā)的病死率較低，但其感染率較高，被世界各國(guó)列為必須申報(bào)的動(dòng)物疾病之一。目前，口蹄疫的檢測(cè)技術(shù)主要有病毒分離技術(shù)、血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)等。病毒分離、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)和病毒中和試驗(yàn)(VNT)等經(jīng)典實(shí)驗(yàn)室方法，雖較為可靠準(zhǔn)確，但試驗(yàn)步驟復(fù)雜，工作量大，花時(shí)長(zhǎng)，需要采用活病毒，要求有特定的實(shí)驗(yàn)室以及熟練的操作人員，推廣難度較大，ELISA PCR等方法雖特異性較好，靈敏度較高，但需配置專(zhuān)用儀器設(shè)備，因而檢測(cè)費(fèi)用較高[5]。

蔣韜等(2008)[6]建立了一種從田間樣品中快速、靈敏、簡(jiǎn)便檢測(cè)O、A、AsiaI型口蹄疫病毒抗原的膠體金免疫層析方法(GICA)。研究采用檸檬酸三鈉還原制備膠體金顆粒,標(biāo)記純化的標(biāo)準(zhǔn)株O、A、AsiaI型口蹄疫抗體。將純化的口蹄疫流行株O/China 99, A/AF72及AsiaⅠ/China 05抗體和羊抗豚鼠抗體分別包被在硝酸纖維素膜上,作為檢測(cè)帶(T)與質(zhì)控帶(C)。經(jīng)試驗(yàn)條件優(yōu)化,組裝形成膠體金定型診斷試劑盒。該試驗(yàn)研制的口蹄疫定型試劑盒具有良好的靈敏度、較好的重復(fù)性;特異性試驗(yàn)證實(shí)該方法在檢測(cè)口蹄疫臨床癥狀相似病原,如豬水皰病抗原(SVD)、水泡性口炎(VS)、水泡性疹(VES)等病毒時(shí)無(wú)交叉反應(yīng)，可檢測(cè)病毒的最低含量為7.8×104LD50;試劑盒對(duì)206份已知血清型田間及實(shí)驗(yàn)室樣品的檢測(cè)符合率試驗(yàn), O、A、AsiaⅠ型和陰性樣本的符合率分別為92.45%、91.66%、92.75%和100%，定型準(zhǔn)確率94.58%。試劑盒在4℃下可保存6個(gè)月。

任維維等(2012)[7]將純化的Asia 1/China 05流行毒株12S偶聯(lián)抗原的兔抗體制備免疫膠體金,噴免疫膠體金于玻璃纖維制成金標(biāo)墊，其建立的檢測(cè)方法，在敏感度和陽(yáng)性準(zhǔn)確率方面有了進(jìn)一步提高。且與豬水皰病抗原病毒(SVD)、水泡性口炎(VS)、水泡性疹(VES)等病毒無(wú)交叉反應(yīng)，可檢測(cè)到病毒的最低含量為0.98×104LD50，陽(yáng)性樣本的符合率為96.70%，陰性樣本的符合率為100%(詳見(jiàn)表2)。

3 豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是一種新發(fā)現(xiàn)的接觸性傳染病，最早報(bào)道于20世紀(jì)80年代,患豬主要發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎和呼吸道等癥狀,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的母豬繁殖障礙以及仔豬呼吸系統(tǒng)癥狀和高死亡率的一種接觸性傳染病。我國(guó)將其列為二類(lèi)傳染病。《高致病性藍(lán)耳病防治技術(shù)規(guī)范》(GB/T18090)中檢測(cè)該病的方法為病毒分離鑒定和RT-PCR[8],實(shí)際生產(chǎn)中不適用于屠宰檢疫環(huán)節(jié)的檢測(cè)。

表2 兩種口躥疫病毒快速檢測(cè)方法比較

陳一鳴(2011)[9]將純化的PRRSV POP3株病毒蛋白和兔抗PRRSV IgG分別作為診斷試紙條的檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)包被于硝酸纖維素膜(NC膜)上,組裝成快速檢測(cè)試紙條。同時(shí)應(yīng)用研制的PRRS抗體試紙條與ELISA檢測(cè)方法分別對(duì)36份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示PRRS抗體試紙條的敏感度為81.5%,特異度為100%,符合率為86.1%。

李雪松等(2011)[10]采用檸檬酸三鈉還原法制備了膠體金顆粒,標(biāo)記抗PRRSV N蛋白的單克隆抗體(MAb)2D7制備免疫檢測(cè)探針,將抗PRRSV N蛋白的MAb 1G7和羊抗鼠IgG抗體印跡在硝酸纖維素膜上,分別作為檢測(cè)線(T)和質(zhì)控線(C),經(jīng)條件優(yōu)化,組裝成膠體金免疫層析試紙條。最低檢測(cè)限度為103.0TCID50/mL;對(duì)豬場(chǎng)送檢的150份病料樣品進(jìn)行PRRSV病原檢測(cè),與RT-PCR相比較,試紙條的特異性和敏感性分別為98.13%和88.37%，總符合率為95.33%。

牟林琳等(2014)[11]、周盛華(2004)[12]等所研制的膠體金檢測(cè)試紙卡與膠體金免疫診斷試紙條，其檢測(cè)的總符合率低于上述研究，與RT-PCR檢測(cè)方法比較，符合率分別為93.3%和90.0%。

4 豬2型鏈球菌病原檢測(cè)

豬2型鏈球菌病(SS2)是由多種鏈球菌引起的一種人獸共患的重要傳染病，以膿腫為主要臨床癥狀，引起患豬大腦炎、中耳炎、內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎或并發(fā)敗血癥，可對(duì)集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)和從業(yè)人員健康造成重大危害。

胡玉山等(2013)[13]建立豬鏈球菌2型感染膠體金快速診斷方法。利用該試紙條對(duì)50份豬鏈球菌2型感染患豬血清樣品和100份人血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性和陰性檢出率均達(dá)到100%，而ELISA 法的陽(yáng)性符合率僅為98.0%。

5 豬支原體肺炎病原檢測(cè)

豬肺炎支原體(Mhp)是引起豬支原體肺炎(MPS)的病原微生物。該病以接觸性、高度傳染性、慢性、高發(fā)病率和低死亡率為特點(diǎn),主要癥狀為咳嗽、氣喘、飼料利用率降低,病豬生長(zhǎng)緩慢,甚至成為僵豬,嚴(yán)重影響?zhàn)B豬生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。

易兵(2010)[14]建立了豬肺炎支原體膠體金快速診斷方法，但該方法與ELISA方法相比，陽(yáng)性檢出率低了7個(gè)百分點(diǎn)，僅為83.8%。

6 旋毛蟲(chóng)病原檢測(cè)

旋毛蟲(chóng)病是一種人獸共患的寄生蟲(chóng)病,由毛首目、毛形科的旋毛形線蟲(chóng)寄生所致。目前，國(guó)內(nèi)用于豬旋毛蟲(chóng)病檢測(cè)的方法，主要采用壓片鏡檢法為主，檢出率只有50%左右。

黃小燕等(2008)[15]利用河南某生物工程有限公司研制的金標(biāo)試紙條對(duì)感染旋毛蟲(chóng)的仔豬進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)試紙條的檢測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確可靠,且敏感性明顯強(qiáng)于抗原試紙條，建議在檢疫檢驗(yàn)工作中使用抗體試紙條檢測(cè)血清或肌肉樣品。

任科研(2012)[16]所建立的旋毛蟲(chóng)膠體金快速診斷法，在敏感性、特異性、重復(fù)性等方面則與ELISA方法接近。

7 小結(jié)與討論

據(jù)資料介紹，膠體金免疫層析技術(shù)已在動(dòng)植物檢疫、食品安全、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛推廣應(yīng)用，但目前在豬病及屠宰檢疫檢測(cè)中的應(yīng)用，還存在以下問(wèn)題。

一是臨床應(yīng)用方面。黃小燕等(2008)[15]的研究材料為旋毛蟲(chóng)商用試紙條，蔣韜等(2008)[6]的研究成果已在國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，但其余研究成果是否已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化則尚無(wú)所知。

二是血樣制備。需配備專(zhuān)用離心機(jī)分離血清，且需人員配合進(jìn)行前腔靜脈或耳緣靜脈采血，耳緣靜脈采血?jiǎng)t相對(duì)比較方便。

三是正確率方面。與經(jīng)典檢測(cè)方法相比，檢出符合率存在一定差距。但其優(yōu)點(diǎn)在于快速、靈敏、成本低廉。

[1]尹梅. 豬瘟病毒抗體膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條的研制及初步應(yīng)用[D]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

[2] 編輯豬業(yè)科學(xué). 豬瘟檢疫技術(shù)規(guī)范[J]. 豬業(yè)科學(xué). 2006, 23(3): 32-33.

[3] 王向鵬，孫元，楊增岐，等. 檢測(cè)豬瘟病毒野毒株膠體金免疫層析方法的建立[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2010(06): 441-445.

[4] 楊明. 豬瘟C株單克隆抗體制備和豬瘟膠體金快速診斷試紙條的研制[D]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

[5] 蔣韜. 免疫層析技術(shù)在口蹄疫POCT中的應(yīng)用研究[D]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[6] 蔣韜，梁仲，陳涓，等. 口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型定型診斷膠體金免疫層析方法的建立[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2008(11): 3801-3808.

[7] 任維維，梁仲，智曉瑩，等. 口蹄疫病毒通用型金標(biāo)檢測(cè)試紙條診斷方法的建立[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2012(02): 255-262.

[8] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 高致病性藍(lán)耳病防治技術(shù)規(guī)范[S]. 北京, 2007.

[9] 陳一鳴. 豬繁殖與呼吸綜合征抗體免疫膠體金快速診斷試紙的研制[D]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

[10] 李雪松，符芳，李海忠，等. 快速檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金免疫層析方法的建立[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2011(09): 718-722.

[11] 牟林琳，劉潔，李建，等. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金檢測(cè)試紙卡的研制[J]. 中國(guó)獸藥雜志. 2014(10): 18-21.

[12] 周盛華. 快速檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒免疫膠體金診斷試紙條的研制[D]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[13] 胡玉山，肖麗紅，劉巧誼，等. 豬鏈球菌2型感染膠體金診斷方法的研究[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué). 2015(06): 675-678.

[14] 易兵. 豬肺炎支原體免疫膠體金快速診斷試紙的研制[D]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[15] 黃小燕，張新高，梁珠嫻，等. 膠體金法檢測(cè)豬旋毛蟲(chóng)病的敏感性研究[J]. 畜牧獸醫(yī)雜志. 2008(06): 28-30.

[16] 任科研. 應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)對(duì)豬旋毛蟲(chóng)病診斷方法的研究[D]. 吉林大學(xué), 2012.

2016-07-18

梁恒之(1988-)，男，湖南懷化人，碩士，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)及動(dòng)物檢疫，E-mail：794858559@qq.com

S858.28

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1005-7307(2016)06-0011-004