袁芳芳，王永興，楊 琳

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642；2.廣東天農(nóng)食品有限公司；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院)

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代謝組學(xué)及相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展

袁芳芳1，王永興2，楊 琳3*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642；2.廣東天農(nóng)食品有限公司；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院)

代謝組學(xué)又稱代謝物組學(xué)，是研究機(jī)體代謝產(chǎn)物譜變化的一種新系統(tǒng)方法，借助高通量、高靈敏度與高精確度的現(xiàn)代分析技術(shù)，分析細(xì)胞、組織和其它生物樣本，如血液、尿液、唾液和體液中內(nèi)源性代謝物整體組成并通過其復(fù)雜、動態(tài)變化，從整體上反應(yīng)代謝物圖。代謝產(chǎn)物的分離、檢測及分析鑒定是代謝組學(xué)技術(shù)的核心部分，分離技術(shù)包括氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)和毛細(xì)管電泳(CE)；常用的檢測和鑒定技術(shù)有核磁共振、質(zhì)譜、光譜、電化學(xué)(EC)等；采取一系列的數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法獲得足夠有用的信息；最常用的分析方法是主成分分析法(PCA)，將一組分散于變量上的信息集中于幾個綜合指標(biāo)上，其他常用的模式識別技術(shù)有偏最小二乘聚類分析、正交偏最小二乘聚類分析等。

自從發(fā)現(xiàn)了必需營養(yǎng)素和主要代謝產(chǎn)物后，營養(yǎng)學(xué)家們一直在努力探索人類營養(yǎng)代謝的真相。傳統(tǒng)的營養(yǎng)支持主要是為營養(yǎng)不良患者提供營養(yǎng)素。傳統(tǒng)營養(yǎng)學(xué)研究認(rèn)為，營養(yǎng)素對代謝的影響是通過研究單一的營養(yǎng)素引起的某種酶或基因等生物學(xué)反應(yīng)而獲得，無法在一個實(shí)驗(yàn)中同時獲得多種營養(yǎng)素全貌，只是將多種營養(yǎng)素的代謝作用簡單匯總，并未考慮到各種營養(yǎng)物質(zhì)間的相互作用，具有一定的片面性[1-2]。

隨著生命科學(xué)逐漸進(jìn)入后基因組時代，營養(yǎng)支持的研究亦有傳統(tǒng)內(nèi)容和方法擴(kuò)大至營養(yǎng)基因組學(xué)和營養(yǎng)蛋白質(zhì)組學(xué)[3]。代謝組學(xué)是蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組和基因組總體表達(dá)的結(jié)果，直接反映組織的生化狀態(tài)，能比較靈敏地刻畫動物機(jī)體的生理、病理的各種變化，對闡明生命活動的復(fù)雜體系具有極為重要的意義[4]。

1 代謝組學(xué)的含義及與其他組學(xué)的比較

1.1 代謝組學(xué) 代謝組學(xué)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的一門對某一生物或細(xì)胞所有低分子量代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析的一門新學(xué)科[5]。

隨著人類基因組測序工作的完成，人們對生命過程的理解有了很大提高，研究的熱點(diǎn)已轉(zhuǎn)移到基因的功能及“組學(xué)”研究，包括研究生物整個基因組的基因組學(xué)，研究某一生物或細(xì)胞所有基因表達(dá)的RNA(如mRNA)進(jìn)行全面分析的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和對某一種生物或細(xì)胞在各種不同環(huán)境條件下表達(dá)的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的蛋白質(zhì)組學(xué)，研究代謝產(chǎn)物變化及代謝途徑的代謝組學(xué)[6-7]。

代謝組學(xué)作為一門新發(fā)展的技術(shù)，所研究的是相對分子質(zhì)量在1000以下的小分子，對低分子量的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，以檢測活細(xì)胞中化學(xué)變化的科學(xué)。

1.2 代謝組學(xué)與其它組學(xué)的比較 代謝組學(xué)與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之間有著明顯的差別。

一是研究對象不同?；蚪M學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的研究對象分別是DNA(基因)、mRNA、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物。

二是研究對象之間的對應(yīng)關(guān)系有差別?；?、mRNA和蛋白質(zhì)之間具有一一對應(yīng)的關(guān)系(如果不包括蛋白質(zhì)的修飾情況)，即一個基因?qū)?yīng)于一種mRNA，一種mRNA對應(yīng)于一種蛋白質(zhì)，而基因、mRNA或蛋白質(zhì)與代謝產(chǎn)物之間則不存在一一對應(yīng)關(guān)系。

三是研究方法不盡相同?；蛴上汆堰?A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)四個堿基所組成，蛋白質(zhì)由20幾種氨基酸組成，而代謝產(chǎn)物則是以元素組成、原子排列、立體結(jié)構(gòu)和分子電荷等特征來區(qū)分。

四是代謝組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)：①基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的微小變化會在代謝物上得到放大，從而使檢測更容易；②代謝組學(xué)的研究不需要建立全基因組測序及大量表達(dá)序列標(biāo)簽的數(shù)據(jù)庫；③代謝物的種類要遠(yuǎn)小于基因和蛋白質(zhì)的數(shù)量(每個組織中大約為103數(shù)量級，即使在最小的細(xì)菌基因組中也有數(shù)千個基因)；④代謝組學(xué)研究中采用的技術(shù)更通用，這是給定的代謝物在每個組織中都是一樣的緣故[8-9]。

2 代謝組學(xué)研究的技術(shù)平臺

大規(guī)模代謝組學(xué)研究過程包括樣品制備、分離、檢測、鑒定、數(shù)據(jù)分析與可視化以及建模與仿真等[4-5]。

2.1 樣品制備 樣品制備包括樣品提取和預(yù)處理。代謝產(chǎn)物通常用水或有機(jī)溶劑(如甲醇、己烷等)分別提取，以分別獲得水提取物或有機(jī)溶劑提取物，從而把非極性的親脂相和極性相分離，以便分別進(jìn)行分析。根據(jù)目前方法最多可分析約300種化合物。實(shí)際操作時，應(yīng)該根據(jù)不同的化合物選擇不同的提取方法，并對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 化合物的分離和鑒定 代謝組學(xué)的分析技術(shù)，包括化合物分離與檢測及鑒定技術(shù)兩部分。分離技術(shù)通常采用氣相色譜(GC)，液相色譜(LC)，毛細(xì)管電泳(CE)等。而檢測及鑒定技術(shù)通常采用質(zhì)譜(一般質(zhì)譜，時間飛行質(zhì)譜)、光譜(紅外光譜，紫外，熒光)、核磁共振、電化學(xué)(EC)等。目前，最常用的則是氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)，液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC/MS)，毛細(xì)管電泳和質(zhì)譜聯(lián)用儀(CE/MS)以及核磁共振(NMR)等。

3 代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)分析

選擇適當(dāng)?shù)拇x組學(xué)分析方法，其原則是要同時考慮儀器和技術(shù)的檢測速度、選擇性和靈敏度，以選擇出一種最適合目標(biāo)化合物的分析方法。

3.1 歸一化與慮噪 獲得分析對象的原始圖譜后，首先應(yīng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理(包括歸一化與慮噪)，處理后保留與分類有關(guān)的大部分信息，消除多余的干擾因素影響[8]。

3.2 非監(jiān)督法 該方法可用于從原始譜圖信息或預(yù)處理后的信息中對樣本進(jìn)行歸類，采用相應(yīng)的可視化技術(shù)進(jìn)行直觀表達(dá)，將獲得的分類信息與樣本的原始信息(如藥物的作用位點(diǎn)或疾病的種類等)進(jìn)行比較，建立代謝產(chǎn)物與這些原始信息的聯(lián)系，篩選與原始信息相關(guān)的標(biāo)記物，進(jìn)而考察其中的代謝途徑。應(yīng)用于該領(lǐng)域的方法有主成分分析法(PCA)、非線性映射法(NLM)、簇類分析法(HCA)等。

3.3 監(jiān)督學(xué)習(xí)方法 該方法可用于建立類別間的數(shù)學(xué)模型，使各類樣品間達(dá)到最大分離，利用建立的多參數(shù)模型對未知樣本進(jìn)行預(yù)測。應(yīng)用于該領(lǐng)域的方法有主成分分析法(PCA)、最小二乘法(PLS)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法(NN)，常用的有SIMCA與偏最小二乘法-顯著性分析(PLS-DA)。

3.4 數(shù)據(jù)庫與專家系統(tǒng) 作為代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)分析，其最終目的在于建立可利用的該研究領(lǐng)域的相應(yīng)數(shù)據(jù)庫及專家系統(tǒng)。

4 代謝組學(xué)在動物營養(yǎng)研究中的相關(guān)應(yīng)用

代謝組學(xué)作為一門新興學(xué)科，對許多研究領(lǐng)域產(chǎn)生了深刻影響，在生物、農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、資源與環(huán)境等研究領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用，有著非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

4.1 研究營養(yǎng)素與機(jī)體相互關(guān)系方面的應(yīng)用 運(yùn)用代謝組學(xué)研究營養(yǎng)學(xué)問題，可從代謝水平研究營養(yǎng)素與機(jī)體的相互作用及營養(yǎng)素在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，還可測定許多營養(yǎng)代謝物與疾病及健康的關(guān)系。目前，代謝組學(xué)在營養(yǎng)方面的研究主要集中在與營養(yǎng)密切相關(guān)的糖代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝等方面，進(jìn)而在分子水平上研究營養(yǎng)素對人和動物的生理機(jī)能影響。代謝組學(xué)在動物營養(yǎng)中的研究多集中在模型動物上，通過研究來尋求最佳飼料搭配的依據(jù)和機(jī)制，提供最佳飼料配方，通過調(diào)整營養(yǎng)供給促使動物達(dá)到最佳健康狀況[4]。

4.2 代謝組學(xué)用于飼料營養(yǎng)對動物機(jī)體影響的評價 動物飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)對動物健康起著非常重要的作用，其潛在營養(yǎng)價值和保健效用是當(dāng)前營養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。有研究者應(yīng)用LC-TOF-MS檢測大鼠飼料中木質(zhì)素、阿魏酸、芥子酸的代謝利用情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素在體內(nèi)不被吸收，而阿魏酸、芥子酸在尿液中的代謝譜與純化膳食組相比有很大不同，表明機(jī)體對不同物質(zhì)的利用率大不相同。有研究者利用代謝組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)肥育豬日糧中添加精氨酸能夠降低血清超低密度脂蛋白、脂質(zhì)、甘油磷酸膽堿、膽堿、檸檬酸、1-甲基組氨酸、糖蛋白、二甲胺和三甲基氧化物，能增加血清中3-甲基組氨酸、甜菜堿、甲胺、丙酮酸、琥珀酸和酮體的濃度。血清總脂質(zhì)及其相關(guān)代謝物的變化進(jìn)一步證明精氨酸在能量物質(zhì)代謝中有著非常重要的作用[10-11]。

王小雪等(2008)[12]利用代謝組學(xué)的方法從家貓這一特殊哺乳動物機(jī)體系統(tǒng)代謝物變化的角度揭示了不同含量蛋白質(zhì)飼料對家貓機(jī)體代謝的影響機(jī)制、研究不同營養(yǎng)干預(yù)對機(jī)體造成的影響，從而為該動物的飼料供應(yīng)研究提供了重要依據(jù)。

4.3 代謝組學(xué)用于研究動物消化道菌群與宿主的相互作用 動物腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，微生物和營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收與動物產(chǎn)品(肉、蛋、奶)的形成有著密切關(guān)系，與宿主之間進(jìn)行著活躍的代謝交換和共同代謝過程。尤其是反芻動物瘤胃微生物對反芻動物營養(yǎng)物質(zhì)的代謝起著非常重要的作用，但瘤胃微生物菌群中影響宿主代謝和生產(chǎn)性能的關(guān)鍵功能菌鑒定及其作用模式仍是研究的難題，綜合利用代謝組學(xué)、分子生態(tài)學(xué)、元基因組學(xué)等方法，為其提供了新的突破口。

王保紅等(2007)[13]利用代謝組學(xué)方法研究了人體腸道菌群結(jié)構(gòu)和人體代謝表型的關(guān)聯(lián)，為尋找影響人體代謝的關(guān)鍵功能菌，解析腸道微生物與人體相互作用機(jī)制提供了新的研究策略和研究方法。另有研究者運(yùn)用代謝組學(xué)方法研究了萬古霉素作用下小鼠尿液與糞便代謝組的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨基酸、斷鏈脂肪酸等物質(zhì)的代謝發(fā)生明顯改變，提示腸道菌群與這些物質(zhì)的產(chǎn)生和代謝可能有著密切關(guān)系。上述研究結(jié)果表明，腸道微生物菌群在影響宿主代謝中所起到的重要作用，一方面菌群可以影響宿主的整體代謝特性；另一方面，改變菌群結(jié)構(gòu)可以相應(yīng)改變宿主的生理代謝特性。

4.4 代謝組學(xué)在發(fā)酵飼料開發(fā)中的作用 發(fā)酵產(chǎn)品在飼料工業(yè)中占據(jù)著非常重要的地位，代謝組學(xué)在這方面同樣發(fā)揮著重要作用。有研究者將快速取樣技術(shù)和其他分析技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)大量代謝產(chǎn)物的快速、高頻率定量，使之能用于發(fā)酵過程的動態(tài)檢測。該技術(shù)將有助研究各種因素對發(fā)酵的影響，從而提高生物工程產(chǎn)品的產(chǎn)量。

有研究者采用液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對發(fā)酵過程中的氨基酸實(shí)現(xiàn)了監(jiān)測；有研究者對計算機(jī)模擬的微生物細(xì)胞模型進(jìn)行了大規(guī)模的代謝組學(xué)研究，均取得了顯著成效，對提高生物工程的產(chǎn)品產(chǎn)量有著非常重要的作用[3-5]。

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2014-09-20

作者介紹：袁芳芳(1988-)，女，江西人，碩士，主要從事非常規(guī)飼料原料開發(fā)利用研究。E-mail:yff13631419023@126.com

楊琳，E-mail: ylin@scau.edu.cn

S816.1

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1005-7307(2016)06-0015-003