李培奇 周文濤 娜爾給扎·艾爾肯

【摘 要】 目的：通過(guò)膠原型誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型，初步研究維藥野西瓜對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的抗炎機(jī)制。方法：構(gòu)建II型膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察維藥野西瓜治療前后CIA大鼠足踝腫脹程度及踝關(guān)節(jié)組織病理的改變；ELISA法檢測(cè)大鼠血清中TNF-α表達(dá)水平的變化；免疫組化法檢測(cè)大鼠足踝關(guān)節(jié)組織中TNF-α的表達(dá)。結(jié)果：維藥野西瓜可有效緩解CIA大鼠關(guān)節(jié)的腫脹情況，減緩組織炎癥發(fā)展；藥物作用25d后，與模型組血清中TNF-α含量（608±135）ng/mL相比，維藥野西瓜處理組血清中TNF-α的含量（439±26）ng/mL明顯降低；與模型組相比，維藥野西瓜治療組大鼠足踝關(guān)節(jié)組織中TNF-α的表達(dá)也明顯減少。結(jié)論：維藥野西瓜對(duì)CIA大鼠具有較好的抗RA作用，其作用機(jī)制可能與降低血清及組織中的TNF-α水平有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；維藥野西瓜；CIA大鼠模型；TNF-α

【中圖分類(lèi)號(hào)】R59322 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）20-0009-04

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以累積周?chē)P(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)慢性炎癥性自身免疫疾病，可導(dǎo)致不可逆的關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞，甚至關(guān)節(jié)畸形和殘疾[1]。RA的發(fā)病機(jī)制至今仍未證實(shí)，近年來(lái)研究顯示RA的發(fā)病機(jī)制可能與感染、遺傳和內(nèi)分泌等有關(guān)，但臨床上依然缺乏特異性治療措施，尚無(wú)治愈方法。維藥野西瓜（Capparis Spinosal）廣泛分布于新疆天山南北，其為新疆維吾爾醫(yī)治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)及瘡毒等疾病的外敷用藥，具有祛風(fēng)除濕，止痛消痛的作用。研究通過(guò)構(gòu)建大鼠Ⅱ型膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型（Type Ⅱ Collagen Induced Arthritis，CIA），觀察維藥野西瓜外敷法對(duì)CIA型關(guān)節(jié)炎大鼠左足踝關(guān)節(jié)腫脹程度、組織病理、細(xì)胞因子TNF-α在血清與組織中的表達(dá)，對(duì)維藥野西瓜抗膠原型關(guān)節(jié)炎大鼠模型的效果及作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 儀器與材料

11 動(dòng)物 清潔級(jí)雌性Wistar大鼠40只，7～9周齡，體重（200±15）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

12 儀器 游標(biāo)卡尺（最小刻度為02mm，上海精密儀器廠）； Labsystems Dragon wellscanMK3酶標(biāo)儀。

13 材料 維藥野西瓜（新疆新特藥有限公司提供，新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥系鑒定）；雷公藤多甙片（批號(hào)：140701，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司）；酸溶性型牛Ⅱ膠原（美國(guó)Sigma公司）；弗氏完全佐劑（Freunds Complete Adjuvent，F(xiàn)CA，美國(guó)Sigma公司）；ELISA大鼠TNF-α定量試劑盒（ebioscience公司）；anti-TNF-α抗體（武漢博士德公司）；DAB顯色試劑盒（北京金杉公司）。

2 方法

21 動(dòng)物模型的分組、構(gòu)建及給藥 將40只Wistar雌性大鼠隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組（NS）、模型組、雷公藤甙治療組及野西瓜治療組。根據(jù)參考文獻(xiàn)[2]，配制IFA：完全佐劑 （FCA）石蠟=1∶[KG-*3/5]2，造模前模型組將酸溶性型牛Ⅱ膠原與IFA等體積進(jìn)行混合、乳化。在大鼠左側(cè)后足跖肉墊處皮內(nèi)注射 01mL混懸乳劑致敏，背部皮內(nèi)注射005mL混懸乳劑致敏，每天測(cè)量足趾腫脹程度，7d后在鼠尾根部注射相同乳劑加強(qiáng)1次。正常對(duì)照組在相同的部位注射 01mL滅菌石蠟。致敏2周后，成功建立CIA型關(guān)節(jié)炎大鼠模型，參照關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]對(duì)模型復(fù)制效果進(jìn)行評(píng)估，評(píng)分達(dá)6分以上的大鼠用于實(shí)驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照組給予雷公藤甙（001mg/kg）灌胃治療；治療組為維藥野西瓜粗提取物加白酒及蛋清混勻（45°白酒∶[KG-*3/5]蛋清=1∶[KG-*3/5]2，5%維藥野西瓜打粉粗提物），用紗布包裹于大鼠左后足踝進(jìn)行治療，隔日一次換藥；正常對(duì)照組及模型組以生理鹽水灌胃，每日一次。

22 取材 治療25d后取材，處死大鼠，采取大鼠腹主動(dòng)脈采血，將其左右足踝關(guān)節(jié)的滑膜組織用10%甲醛溶液進(jìn)行固定。

23 觀察檢測(cè) 用游標(biāo)卡尺每日測(cè)量大鼠左后足踝關(guān)節(jié)的上下徑并記錄數(shù)據(jù)，觀察其腫脹程度（精確至02mm）；同時(shí)鏡下觀察大鼠左后足踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理切片（HE染色）變化，ELISA法觀察血清中TNF-α的變化，免疫組化法觀察足踝關(guān)節(jié)組織TNF-α的表達(dá)水平。

24 免疫組化結(jié)果評(píng)分 采取每張切片隨機(jī)觀察具有代表性的10個(gè)高倍鏡視野，根據(jù)胞膜胞質(zhì)染色程度及染色細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分：基本不著色者為0分，著色淡者為1分，著色適中者為2分，著色深者為3分；著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分比≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。將每張切片著色程度得分與著色細(xì)胞百分比得分相乘為其最后得分，0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽(yáng)性（+），≥4分為強(qiáng)陽(yáng)性（++）。

25 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS170進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX-*3]±s）表示，計(jì)量資料經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，方差齊則采用方差分析的方法，兩兩比較采用SNK法；等級(jí)資料進(jìn)行Kruskal-Wallis H test秩和檢驗(yàn)；方差不齊，則采用秩和檢驗(yàn)。P<005表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

31 對(duì)CIA大鼠足踝關(guān)節(jié)腫脹程度的影響 維藥野西瓜對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)的急性炎癥反應(yīng)有較好抑制作用。與空白對(duì)照組比較，造模后第14天（藥前）各組踝關(guān)節(jié)均明顯腫脹（P<001），表明造模成功。用藥第25天后，雷公藤甙組及維藥野西瓜對(duì)大鼠右足踝關(guān)節(jié)腫脹均有明顯的緩解作用（P<005）。

32 組織病理切片觀察 HE染色組織切片鏡下可見(jiàn)，正常組大鼠關(guān)節(jié)組織無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及毛細(xì)血管的增生；CIA大鼠模型組可見(jiàn)到淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)滑膜細(xì)胞增殖，毛細(xì)血管的增生，軟骨組織破壞嚴(yán)重；而雷公藤甙治療組和維藥野西瓜外敷組鏡下觀察可見(jiàn)軟骨組織破壞減輕，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善。見(jiàn)圖1～4。

33 外周血中TNF-α含量變化 由圖5可知，與正常對(duì)照組外周血中TNF-α含量（518±101）ng/mL比較，模型組大鼠外周血中TNF-α含量（608±135）ng/mL明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2582，P<005）。雷公藤甙治療組大鼠外周血中TNF-α含量為（475±74）ng/mL、維藥野西瓜治療組大鼠外周血中TNF-α含量為（439±26）ng/mL，均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為-3265、-2601，P<005）。

34 足踝關(guān)節(jié)組織中TNF-α表達(dá)水平變化 由圖6可見(jiàn)，CIA關(guān)節(jié)炎大鼠模型組足踝關(guān)節(jié)組織中TNF-α表達(dá)明顯升高（Z=-300，P<005）。與模型組相比，雷公藤甙治療組及維藥野西瓜治療組大鼠踝關(guān)節(jié)組織中TNF-α表達(dá)水平明顯下降（Z值分別為-2449、-2362，P<005）。

4 討論

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)主要為關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥反應(yīng)，該病具有診斷不易，易反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)。治療不佳的患者可隨著病情發(fā)展，逐漸侵害關(guān)節(jié)，直至關(guān)節(jié)畸形，甚至功能喪失，因此早期干預(yù)有利于延緩病情進(jìn)展，對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義[2]。RA從組織病理變化上而言可能涉及關(guān)節(jié)腔滑膜炎癥、細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肉芽腫形成、軟骨及骨組織破壞等多個(gè)環(huán)節(jié)，目前尚無(wú)特效治療措施[3]。

維吾爾醫(yī)藥用植物野西瓜，因多分布于新疆南北坡地而最早報(bào)道于《新疆中草藥》，其維文名為：開(kāi)派、菠里科果，在沙特阿拉伯做為傳統(tǒng)藥物常被用作治療風(fēng)濕病、關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)等；在維吾爾醫(yī)學(xué)中，野西瓜被認(rèn)為具有祛風(fēng)除濕、散寒除濕、消腫止痛的功效，常被作為治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物。近年來(lái)，野西瓜經(jīng)過(guò)粗提取后的臨床應(yīng)用已引起國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注。有研究已表明[4]，維藥野西瓜可緩解佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腫脹，降低外周炎性因子的水平。Ⅱ型膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型（type Ⅱ collagen induced arthritis）由Trentham等于1977年首次建立，并隨研究的不斷深入和相關(guān)實(shí)驗(yàn)的大量重復(fù)，目前已成為公認(rèn)的研究人類(lèi)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的經(jīng)典模型[5]。CIA模型在病證表現(xiàn)性更加的穩(wěn)定、持久[6]，并更接近于人類(lèi)的RA模型，具有研究的代表性和經(jīng)典性。實(shí)驗(yàn)依據(jù)參考文獻(xiàn)[2]，免疫2周后成功構(gòu)建CIA大鼠模型。參照關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]對(duì)模型的復(fù)制效果進(jìn)行評(píng)估，評(píng)分達(dá)6分以上。結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，造模后第2周（給藥前）各組踝關(guān)節(jié)均明顯腫脹，CIA大鼠模型制備較為成功（P<001）。藥物干預(yù)第25天時(shí)，模型組CIA大鼠足踝關(guān)節(jié)直徑為（1005±05）mm，雷公藤治療組及野西瓜治療組大鼠足踝關(guān)節(jié)的腫脹程度明顯減輕，分別為（933±08）mm、（872±07）mm，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。從組織切片上也可以看出，野西瓜治療組大鼠軟骨組織破壞減輕，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)得到明顯改善。

腫瘤壞死因子（TNF-α）通常由單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌。做為主要前炎癥因子，TNF-α對(duì)關(guān)節(jié)實(shí)質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞具有廣泛作用，在形成RA炎癥、新生血管生成和骨質(zhì)減少過(guò)程中起著重要作用[8]：TNF-α可促進(jìn)趨化因子的合成和分泌、增加細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，從而加速淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的募集[9]。TNF-α也可促進(jìn)提呈抗原肽的MHCⅡ類(lèi)分子表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)對(duì)自身抗原的反應(yīng)激活T細(xì)胞，繼而誘導(dǎo)結(jié)締組織細(xì)胞，包括滑膜成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2（PGE2）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP），致滑膜炎癥和增生、軟骨破壞[10]。TNF-α還可促進(jìn) RA滑膜細(xì)胞的凋亡[10]。有研究顯示RA患者血和病變關(guān)節(jié)滑液中 TNF-α水平隨同期關(guān)節(jié)炎活動(dòng)指數(shù)的改善而顯著下降，使用抗 TNF-α單抗治療后，RA患者病變關(guān)節(jié)內(nèi)的滑膜炎和軟骨破壞得以抑制，患者癥狀體征明顯減輕[10]。實(shí)驗(yàn)中利用ELISA實(shí)驗(yàn)及免疫組化實(shí)驗(yàn)，試圖從血清學(xué)水平及組織學(xué)水平上分別對(duì)CIA大鼠血清及組織中TNF-α的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，藥物處理25天后，正常對(duì)照組血清中TNF-α含量為（518±101）ng/mL，CIA模型組大鼠血清中TNF-α為（608±135）ng/mL，與正常組相比明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；雷公藤甙治療組大鼠外周血中TNF-α為（475±74）ng/mL，維藥野西瓜治療組為（439±26）ng/mL，與CIA模型組相比，兩者均明顯降低（P<005），但兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示維藥野西瓜可通過(guò)降低CIA大鼠血清中TNF-α水平起到抗RA的作用。免疫組化技術(shù)是利用抗原抗體特異性反應(yīng)對(duì)組織細(xì)胞中的特定抗原（或抗體）進(jìn)行定位和定性的一種染色技術(shù)，具有直觀的特點(diǎn)。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CIA模型組大鼠在關(guān)節(jié)滑膜組織上TNF-α表達(dá)明顯增高 （P<005）；與模型組相比，雷公藤甙治療組及維藥野西瓜治療組大鼠踝關(guān)節(jié)組織中TNF-α表達(dá)水平明顯下降 （P<005）。ELISA及免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示抑制血清及足踝關(guān)節(jié)組織中TNF-α的表達(dá)可能是維藥野西瓜抗類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制之一。

綜上所述，維藥野西瓜可有效減輕CIA大鼠模型的足趾腫脹程度，緩解病理?yè)p害，其機(jī)制可能與降低血清及組織中的TNF-α水平有關(guān)。RA 的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，臨床治療手段較局限，通過(guò)現(xiàn)代的研究手段和方法運(yùn)用，來(lái)發(fā)掘特色維藥的獨(dú)特治療效果，有利于進(jìn)一步研究并闡明維藥野西瓜在抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用及機(jī)制，以期在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究及診治上取得新進(jìn)展。

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（編輯：陶希睿）