樊 青 顏 萍 李培杰

(濟(jì)南市婦幼保健院兒科，濟(jì)南250001)

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不同類型支原體肺炎外周血TIM和TLR基因表達(dá)的變化及其意義①

樊 青 顏 萍 李培杰

(濟(jì)南市婦幼保健院兒科，濟(jì)南250001)

目的：探討不同類型支原體肺炎患兒外周血Toll受體2、4和Tim、1、3家族基因的變化及其意義。方法：隨機(jī)選取自2013年3月～2014年3月在濟(jì)南市婦幼保健院兒科住院的支原體肺炎患兒共56例，將入選的56例根據(jù)X線影像學(xué)改變分為兩組：表現(xiàn)為沿支氣管分布的結(jié)節(jié)狀、點(diǎn)片狀密度增高影或伴網(wǎng)格狀、條索狀間質(zhì)改變者作為支氣管肺炎組(40例)，表現(xiàn)為節(jié)段性、大葉性實(shí)變者作為節(jié)段性肺炎組(16例)。同時(shí)，選取性別和年齡與支原體患兒組匹配的健康查體兒童30例作為對(duì)照組。收集外周靜脈全血。抽提總RNA，采用qRT-PCR檢測TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA和Tim-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量,比較各組之間TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA和Tim-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量的差異。結(jié)果：(1)支原體肺炎組及MP-支氣管肺炎組外周血細(xì)胞中TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-l mRNA相對(duì)表達(dá)值顯著高于健康對(duì)照組。(2)MP-節(jié)段性肺炎組TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量的顯著高于健康對(duì)照組。(3)MP-節(jié)段性肺炎組Tim-1mRNA和Tim-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量的顯著高于MP-支氣管肺炎組。結(jié)論：不同類型的支原體肺炎患兒外周血TLR-2、TLR-4和Tim-1基因均有過度表達(dá),Tim-1、Tim-3基因在肺部感染重癥患兒有過度表達(dá)，TLR2、4受體和Tim1、3家族基因參與不同類型的支原體肺炎的感染過程。

肺炎，支原體；支氣管肺炎；節(jié)段性肺炎；基因表達(dá)；qRT-PCR

肺炎支原體(Mycoplasma pneumonia，MP)感染引起的支原體肺炎是兒童常見的一種社區(qū)獲得性肺炎，有報(bào)道顯示國內(nèi)發(fā)病率19.6%～21.9%，流行年度最高可達(dá)33.1%[1]，大多數(shù)肺炎支原體的臨床表現(xiàn)為良性進(jìn)程，有良好的預(yù)后。但近年來發(fā)現(xiàn)，很多影像學(xué)表現(xiàn)為節(jié)段性、大葉性實(shí)變者肺炎的患兒臨床中毒癥狀重、病程遷延，可伴有多系統(tǒng)、多器官的損害，直接影響了疾病的預(yù)后[2]。

支原體入侵宿主細(xì)胞后，征服固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的多種宿主防御機(jī)制，建立長期感染，Toll樣受體(Toll-like Receptor,TLRs)是新近發(fā)現(xiàn)的一種天然免疫模式識(shí)別受體，在對(duì)病原微生物的識(shí)別和跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，Toll樣受體作為功能受體，既引起天然免疫又能進(jìn)一步啟動(dòng)獲得性免疫，在機(jī)體的抗感染免疫過程中具有重要意義[3]。輔助T細(xì)胞在支原體感染的細(xì)胞免疫中起主要作用,直接造成了呼吸系統(tǒng)的免疫損傷[4]。Tim基因家族是T細(xì)胞亞群依賴的免疫應(yīng)答中的新的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子，其家族成員各自表達(dá)于Th1和Th2細(xì)胞，調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，參與維持體內(nèi)Th1/Th2平衡。

本研究針對(duì)不同X線影像學(xué)表現(xiàn)類型的支原體肺炎，研究其外周血中TLR樣受體及Tim家族的變化，對(duì)于揭示支原體感染造成的免疫損傷具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 資料 支原體肺炎組：病例選自2013年1月至2014年6月在濟(jì)南市婦幼保健院兒科住院的支原體肺炎患兒共56例，其中男32例，女24例。平均年齡(3.72±0.89)歲，符合《實(shí)用兒科學(xué)》支原體肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[5],血清MP-IgM抗體滴度>20 bu/ml(陽性),排除其他細(xì)菌、病毒、衣原體感染;肺外并發(fā)癥診斷排除其他病因所致各系統(tǒng)損害。將入選的56例根據(jù)X線影像學(xué)改變分為兩組：表現(xiàn)為沿支氣管分布的結(jié)節(jié)狀、點(diǎn)片狀密度增高影或伴網(wǎng)格狀、條索狀間質(zhì)改變者作支氣管肺炎組(40例)，表現(xiàn)為節(jié)段性、大葉性實(shí)變者作為節(jié)段性肺炎組(16例)。

健康對(duì)照組：選取同期體檢的30例健康兒童為對(duì)照組，男18例，女12例，平均年齡(3.85±1.26)歲，均為我院兒科兒保門診經(jīng)健康體檢合格的正常兒童、無心、肝、肺、腎等重要臟器疾患，肝、腎功能試驗(yàn)正常，近期無任何感染病史。

1.2 方法

1.2.1 采用一次性抗凝采血管采集外周靜脈血4 ml，利用Pure血液總RNA提取試劑盒，于采集后2 h內(nèi)用Trizol法提取血細(xì)胞總RNA，操作嚴(yán)格按照說明書的步驟進(jìn)行。提取完畢后，用紫外分光光度計(jì)檢測總RNA濃度和純度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 采用qRT-PCR法來評(píng)估檢測患兒外周血中TLR2、4和Tim1、3基因的相對(duì)表達(dá)量，在這項(xiàng)研究中使用的引物見表1。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒的總體積為25 L[12.5 μl SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，1 μl引物(f)，1 μl引物(R)和2 μl cDNA]。混合是在lightcycler480 qRT-PCR系統(tǒng)反應(yīng)(Roche公司，德國),95℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 30 s；40周期；95℃ 15 s；60℃ 30 s；95℃ 40 s，用β-actin為內(nèi)參基因。所有的反應(yīng)重復(fù)3次。最后，利用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 不同類型支原體肺炎的一般特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)室檢查MP-支氣管肺炎組的平均年齡小于MP-節(jié)段性肺炎組；MP-節(jié)段性肺炎組總的熱程和住院時(shí)間較MP-支氣管肺炎組延長；MP-節(jié)段性肺炎組C-反應(yīng)蛋白、ESR顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具體見表2。

2.2MP-肺炎與健康對(duì)照組相比，MP-肺炎外周血細(xì)胞中，TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05),具體見表3。

2.3MP-節(jié)段性肺炎組與健康對(duì)照組相比，MP-節(jié)段性支原體肺炎外周血中，TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05),具體見表4。

表1 TLR-2、TLR-4、Tim-1和Tim-3的mRNA引物序列

Tab.1 mRNA primer sequence of TLR-2,TLR-4,Tim-1 and Tim-3

PrimersPrimersequenceTim1F5'-GAACATAGTCTACTGACGGCCAATAC-3'Tim1R5'-GAACCTCCTTTTTGAAGAAATACTTTT-3'Tim3F5'-TCCAAGGATGCTTACCACCAG-3'Tim3R5'-GCCAATGTGGATATTTGTGTT-3'β-actinF5'-GGCACCACACCTTCTACAATG-3'β-actinR5'-TAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3'TLR2F5'-TGATGCTGCCATTCTCATTC-3'TLR2R5'-CGCAGCTCTCAGATTTACCC-3'TLR4F5'-TTGAGCAGGTCTAGGGTGATTGAAC-3'TLR4R5'-ATGCGGACACACACACTTTCAAATA-3'

表2 MP-支氣管肺炎與MP-節(jié)段性肺炎的臨床特點(diǎn)對(duì)比

Tab.2 Clinical features comparison of MP-bronchopneu-monia and MP-segmental pneumonia

OutcomemeasuresMP-broncho-pneumonia(n=40)MP-segmentalpneumonia(n=16)tPAge(year)3.3±1.24.6±0.83.980.002Totalfeverprocess(day)4.5±1.56.7±2.24.3160.001HLOS(day)7.5±1.310±1.85.80.001WBC(×109)6.67±0.87.38±1.12.680.0096CRP(mg/L)7.6±2.312.5±2.76.850.001ESR(mm/h)21±3.526±2.25.290.001

表3 MP-肺炎與健康對(duì)照組外周血TLR-2、TLR-4和Tim-1、Tim-3的相對(duì)表達(dá)量的對(duì)比

Tab.3 Relative expression comparison of TLR-2,TLR-4,Tim-1 and Tim-3 mRNA levels in peripheral blood of MP-pneumonia group and healthy group

TestindexHealthygroup(n=30)MP-pneumoniagroup(n=56)tPTLR20.03846±0.00360.05122±0.0017273.6120.0005TLR40.01078±0.0018130.01774±0.0016782.4350.0172Tim10.0002334±0.000030470.0004287±0.00001696.0880.0001Tim30.004874±0.00047940.004785±0.00047941.9370.8467

表4 MP-節(jié)段性肺炎組與健康對(duì)照組外周血TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量的對(duì)比

Tab.4 Comparison of TLR-2,TLR-4,Tim-1 and Tim-3 relative mRNA expression levels in peripheral blood of MP-segmental pneumonia group and healthy group

TestindexHealthygroup(n=30)MP-segmentalpneumoniagroup(n=16)tPTLR20.03846±0.00360.05381±0.0036562.7320.009TLR40.01078±0.0018130.01792±0.0021272.4370.0189Tim10.0002334±0.000030470.0005303±0.000032726.1650.0001Tim30.004874±0.00047940.006191±0.000225510.350.0001

表5 MP-支氣管肺炎組與健康對(duì)照組外周血TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量的對(duì)比

Tab.5 Comparison of TLR-2,TLR-4,Tim-1 and Tim-3 relative mRNA expression levels in peripheral blood of MP-bronchopneumonia group and healthy group

TestindexHealthygroup(n=30)MP-bronchopneumoniagroup(n=40)tPTLR20.03846±0.00360.05018±0.0019333.060.0032TLR40.01078±0.0018130.01767±0.0020872.3950.0194Tim10.0002334±0.000030470.000388±0.000015844.8190.0001Tim30.004874±0.00047940.004224±0.00023321.3160.1927

2.4 MP-支氣管肺炎組與健康對(duì)照組相比，MP-支氣管肺炎組外周血中，TLR-2mRNA和Tim-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05),具體見表5。

2.5 MP-支氣管肺炎組與MP-節(jié)段性肺炎組相比，MP-節(jié)段性支原體肺炎外周血中，Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于MP-支氣管肺炎組(P<0.05),具體見表6。

表6 MP-節(jié)段性肺炎組和MP-支氣管肺炎組外周血TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量的對(duì)比

Tab.6 Comparison of TLR-2,TLR-4,Tim-1 and Tim-3 relative mRNA expression levels in peripheral blood of MP-bronchopneumonia group and MP-segmental pneumonia group

TestindexMP-bronchopneu-moniagroup(n=40)MP-segmentalpneumoniagroup(n=16)tPTLR20.05018±0.0019330.05381±0.0036560.94730.3477TLR40.01767±0.0020870.01792±0.0021270.94410.0700Tim10.000388±0.000015840.0005303±0.000032724.3870.0001Tim30.004224±0.00023320.006191±0.00022554.9590.0001

表7 MP-肺炎患兒基因相對(duì)表達(dá)量與MP滴度的相關(guān)分析

Tab.7 Correlation analysis between relative expression levels of genes and MP titers in MP-pneumonia children

GenetestvalueMPTitersRsPTLR20.12060.007TLR40.014550.3628Tim10.2220.0002Tim30.0349810.1562

2.6 MP-肺炎患兒外周血中，TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量與MP滴度的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，TLR-2mRNA和Tim-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量隨著MP感染滴度的增加而增加，結(jié)果見表7。

3 討論

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae，MP)是已知的介于細(xì)菌和病毒之間的能獨(dú)立生活的最小病原微生物，它黏附于黏膜上皮細(xì)胞上，釋放毒性代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致纖毛運(yùn)動(dòng)減弱、上皮細(xì)胞損傷，同時(shí)繼發(fā)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，進(jìn)一步損傷肺組織并導(dǎo)致肺外靶器官損傷。

在支原體肺炎病程初期，X線表現(xiàn)為肺紋理的增粗、增多，主要是單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的浸潤，使得支氣管與細(xì)支氣管發(fā)生充血與水腫，若病情未得到控制，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞將進(jìn)一步浸潤，其炎性滲出物不止局限于肺間質(zhì)，并向臨近組織蔓延。X線會(huì)出現(xiàn)點(diǎn)狀、斑狀、片狀甚至大片狀陰影[6]，MP肺炎病變以間質(zhì)性肺炎多見，肺部病變常累及一肺葉，僅少數(shù)成大葉性肺炎改變，而不同影像學(xué)表現(xiàn)的支原體肺炎臨床表現(xiàn)有很大差別。

由本組資料可見，相對(duì)于MP-支氣管肺炎組，MP-節(jié)段性肺炎組具有熱程長、平均住院日長、臨床表現(xiàn)嚴(yán)重等特點(diǎn)。目前認(rèn)為，支原體感染引起肺損傷的機(jī)制包括直接侵犯和免疫損傷，前者是病原侵犯、黏附、釋放毒素等直接損傷呼吸道黏膜，后者是因?yàn)橹гw感染后激發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，造成肺組織和其他靶器官的損傷[7]。支原體感染的免疫損傷過程包括，機(jī)體的免疫清除、免疫紊亂，病原體的免疫逃逸，這些免疫機(jī)制的異常都會(huì)促進(jìn)重癥支原體肺炎的發(fā)生[8]。

TLR是一類跨膜受體，因其胞外段結(jié)構(gòu)與一種果蠅蛋白Toll同源而得名，是一個(gè)重要的模式識(shí)別分子受體。在支原體的免疫清除過程中，通過Toll樣受體識(shí)別MP膜上的脂蛋白呈遞抗原并激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞，將其募集到感染部位并清除[9]。巨噬細(xì)胞作為TLR的主要表達(dá)者，在清除MP時(shí)發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞經(jīng)其表面TLR,主要是TLR2識(shí)別MP特異性抗原后，通過MyD88-NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)激活，將入侵的MP吞噬后在其溶酶體內(nèi)殺滅[10]。

本課題既往研究顯示，與健康對(duì)照組相比，MP肺炎患兒外周血中TLR-2mRNA、TLR-4mRNA的相對(duì)表達(dá)量有顯著差異，證實(shí)了TLR-2、TLR-4受體參與了支原體在機(jī)體感染作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明MP-節(jié)段性肺炎組的支原體滴度與MP-支氣管肺炎組相比，有顯著性差異，即隨著支原體滴度的升高，患兒的肺部炎癥更加明顯，臨床癥狀更嚴(yán)重。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，MP-肺炎患兒的TLR-2mRNA的定量與患兒MP的滴度成正相關(guān)，分析支原體感染時(shí)，隨著支原體滴度的增加，病情的進(jìn)一步加重，TLR-2在患兒體內(nèi)的濃度相應(yīng)增加，參與機(jī)體對(duì)支原體病原菌清除，提示TLR-2mRNA的定量與患兒的病情嚴(yán)重性密切相關(guān)。

在感染MP的呼吸系統(tǒng)內(nèi)，T細(xì)胞同時(shí)扮演了免疫保護(hù)和免疫治病的雙重角色，Cartner等[11]發(fā)現(xiàn)，缺失T或B細(xì)胞的SCID小鼠和免疫正常的小鼠感染相同數(shù)量的MP后，前者肺部的臨床癥狀明顯好于后者，但兩者肺部的MP數(shù)量，沒有不同，提示引起支原體肺炎肺部癥狀的主要原因不是病原體本身而是淋巴細(xì)胞。

Tim-1和Tim-3是近年發(fā)現(xiàn)的T 細(xì)胞免疫球蛋白域黏蛋白域(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein，Tim)基因家族中兩個(gè)主要的成員，Tim-1特異表達(dá)于Th2細(xì)胞表面，其與配體結(jié)合后可協(xié)同刺激Th2細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的分泌，說明Tim-1具有調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的功能[12]。Tim-3選擇性表達(dá)在分化的Th1細(xì)胞上，通過與其配體即半乳糖凝集素-9結(jié)合,為T細(xì)胞提供一種負(fù)性共刺激信號(hào)，下調(diào)Th1的反應(yīng)[13]。

Th1細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-β等促炎癥介質(zhì)為特征，可增強(qiáng)殺傷炎癥細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。Th2細(xì)胞可產(chǎn)生IL-4、5、6、10等細(xì)胞因子，以抗炎癥介質(zhì)為主，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。如果某些因素引起Th1/Th2失衡，則導(dǎo)致免疫功能紊亂，引起疾病的發(fā)生。

本課題既往研究顯示，與健康對(duì)照組相比，所有MP-肺炎患兒外周血中Tim-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量有顯著升高，提示Tim-1在支原體感染的急性期發(fā)病機(jī)制中起一定的作用，Tim-1作為表達(dá)在活化后的Th2細(xì)胞表面的特征性分子，表達(dá)量明顯增加,提示Tim-1在支原體感染的急性期，體內(nèi)細(xì)胞免疫Th1細(xì)胞應(yīng)答受到抑制，以Th2優(yōu)勢應(yīng)答為主。

與健康對(duì)照和MP-支氣管肺炎兩組相比，MP-節(jié)段性支原體肺炎組Tim-1mRNA和Tim-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，提示在支原體感染造成肺部感染明顯、臨床癥狀明顯的MP-節(jié)段性肺炎組，Tim-1mRNA和Tim-3均有顯著性升高，特別是針對(duì)支原體感染造成的支氣管肺炎組，Tim-3作為Th1型應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)因子，推測可能隨著病情的進(jìn)一步加重，機(jī)體的免疫功能紊亂更明顯，使得支原體病原菌感染的持續(xù)化、慢性化、嚴(yán)重化。綜上所述，TLR-2、TLR-4和Tim-1、Tim-3參與了不同類型的MP感染的過程，檢測外周血中TLR2、TLR4和Tim1、Tim3的定量有助于判斷患兒肺部感染程度和臨床病情嚴(yán)重性，對(duì)支原體感染的治療和預(yù)后有積極的作用。

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[收稿2015-04-05 修回2015-06-01]

(編輯 許四平)

Expression levels of Tim and TLR gene family and its clinical significance in children with different types of mycoplasma pneumonia

FAN Qing,YAN Ping,LI Pei-Jie.Jinan Municipal Maternity and Child Care Hospital,Ji′nan 250001,China

Objective:To explore expression levels of Tim and TLR gene family in children with different types of mycoplasma pneumonia and their clinical significance.Methods: 56 patients with mycoplasma pneumonia were randomly selected in Ji′nan Maternity and Child Care Hospital from March,2013 to March,2014.All the patients were divided into bronchopneumonia group (n=40) and segmental pneumonia group (n=16) according to their X-ray manifestations.Bronchopneumonia group was characterized as dot,nodular increased density shadow with or without reticular,stripe-like interstitial lesion.Segmental pneumonia was described as segmental or lobar consolidation of lung in X-ray.Meanwhile,30 healthy children were involved in control group with matched age and gender.Peripheral venous blood of all the children in every group was collected and total RNA was extracted.The mRNA of Toll-recepter 2，4 and Tim1，3 was quantified by quantitative real-time PCR (qRT-PCR),and compared between different groups.Results: The expression of mRNA of TLR-2，4 and Tim1 significantly increases in both bronchopneumonia group and segmental pneumonia group compared to healthy control.Meanwhile,the mRNA of TLR-2，4 and Tim-1，3 was significantly elevated among segmental pneumonia group compared to healthy control.In addition,the gene expression of Tim1，3 was higher in segmental pneumonia group than bronchopneumonia group.Conclusion: The TLR-2，4 and Tim1 gene are over expressed in both types of mycoplasma pneumonia and Tim-1，3 are highly expressed in children with severe infection in lung.The expression alteration of TLR-2,4 and Tim1,3 gene is involved in different types of mycoplasma pneumonia.

Mycoplasma pneumonia;Bronchopneumonia;Segmental pneumonia；Genie expression;qRT-PCR

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.021

樊 青(1971年-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事兒科呼吸學(xué)研究。

R725.6

A

1000-484X(2016)04-0546-05

①本文為山東省濟(jì)南市衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013-33)。