吳 桐 徐文峰 年四季 葉迎春 袁 青

(四川醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，瀘州646000)

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金黃色葡萄球菌α-溶血素的克隆及可溶性融合表達(dá)①

吳 桐 徐文峰 年四季 葉迎春 袁 青

(四川醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，瀘州646000)

目的：表達(dá)純化可溶性金黃色葡萄球菌α-溶血素(α-HL)作為抗原，用以后期制備全人源抗α-HL抗體，為金黃色葡萄球菌感染提供新的治療手段。方法：提取金黃色葡萄球菌總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，擴(kuò)增α-HL cDNA，將cDNA雙酶切后與載體pCold-TF連接，轉(zhuǎn)化E.coli TOPO 10，菌落PCR及測(cè)序驗(yàn)證插入基因的正確性。將測(cè)序正確的α-HL/pCold-TF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21進(jìn)行低溫誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證表達(dá)產(chǎn)物的正確性。結(jié)果：PCR擴(kuò)增得到的α-HL基因大小為900 bp左右；將重組質(zhì)粒α-HL/pCold-TF轉(zhuǎn)化E.coli BL21，經(jīng)15℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)24 h ，誘導(dǎo)得到可溶性的α-HL融合蛋白，融合蛋白大小為90 kD左右(載體上的TF 分子伴侶大小為45 kD左右)；經(jīng)Western blot 驗(yàn)證表達(dá)純化的蛋白為α-HL融合蛋白。將純化的α-HL蛋白注射BABL/c小鼠制備抗血清，結(jié)果顯示抗血清與金黃色葡萄球菌結(jié)合良好，效價(jià)大于10 000倍。結(jié)論：成功對(duì)α-HL進(jìn)行了基因克隆，并成功表達(dá)純化到可溶性的α-HL融合蛋白。

金黃色葡萄球菌；α-HL；可溶性表達(dá)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人類(lèi)感染性疾病的重要病原體，特別容易引發(fā)肺炎、皮膚膿腫和菌血癥，感染后具有很高的死亡率?？股厥侵委熃瘘S色葡萄球菌感染的主要手段，長(zhǎng)期以來(lái)是有效的。隨著近年世界范圍內(nèi)的抗生素濫用越來(lái)越嚴(yán)重，金黃色葡萄球菌出現(xiàn)了對(duì)幾乎所有抗生素耐藥的菌株--耐甲氧西林金葡菌MRSA。MRSA幾乎對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物耐藥，甚至累及到紅霉素、環(huán)丙沙星和慶大霉素。如果葡萄球菌屬一旦對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥，臨床將無(wú)藥可用。而抗生素研究在近年發(fā)展緩慢，幾乎沒(méi)有新的更有效的抗生素產(chǎn)品問(wèn)世。金黃色葡萄球菌感染特別是耐甲氧西林金葡菌MRSA的感染，已經(jīng)成為世界上三大感染治療難題之一。MRSA的感染治療難度越來(lái)越大，甚至已經(jīng)成為醫(yī)源性感染的主要死因。

金黃色葡萄球菌α-溶血素(α-HL)是一種外毒素，具有良好的抗原性，已經(jīng)被證明是金黃色葡萄球菌導(dǎo)致多種動(dòng)物感染性疾病的關(guān)鍵毒力因子，在金黃色葡萄球菌感染特別是醫(yī)源性感染中，起主要作用。針對(duì)金黃色葡萄球菌α-HL，近來(lái)的研究表明，免疫治療的方法是有效的。但人類(lèi)自身的抗體對(duì)抗α-HL的效果很微弱，而動(dòng)物源性的抗體在臨床上證明是很有局限性的，容易產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)[1-3]。因此，我們研究通過(guò)制備抗α-HL 的全人源單克隆抗體，以獲得更好的治療效果[1,4]。本研究首先需要表達(dá)純化出可溶性的金黃色葡萄球菌α-HL作為抗原[5-7]，為后期制備抗α-HL的全人源抗體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生物，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自omega 公司，p-Cold-TF載體，Ni-NTA 親和純化系統(tǒng)、蛋白預(yù)染Marker(BenchMarkTMpre-stained protein ladder)，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、Ex Taq 酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(1 000 bp DNA ladder)、低分子量蛋白Marker 購(gòu)自TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌總RNA提取和基因擴(kuò)增 利用煮沸法提取金黃色葡萄球菌總RNA。液體培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，離心收集細(xì)菌沉淀，加入溶葡萄球菌酶，37℃溫育10 min，再加入蛋白酶K，并繼續(xù)于37℃溫育10 min，然后煮沸10 min。迅速轉(zhuǎn)移至冰浴放置1 min，離心收集上清加入等體積的氯仿，離心收集水相加入等體積的異丙醇，大力振蕩后離心。沉淀用70%乙醇洗滌兩次，離心后在空氣中干燥，并溶解于25 μl RNase-free水中。

RT-PCR擴(kuò)增金黃色葡萄球菌α-HL cDNA。從NCBI 基因數(shù)據(jù)庫(kù)中下載金黃色葡萄球菌α-HL基因序列，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，采用巢氏PCR擴(kuò)增α-HL(表1)。取 α-HL cDNA 2 μl 作為模板，采用引物對(duì)α-HL F1-Forword/α-HL R1-Reverse進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增。取第一次PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，引物對(duì)為α-HL F2-XhoⅠ/α-HL R2-EcoRⅠ。PCR程序?yàn)椋?4℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，然后72℃ 10 min。

1.2.2 金黃色葡萄球菌α-HL的克隆 將金黃色葡萄球菌α-HL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA回收，用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和 EcoRⅠ雙酶切α-HL，回收DNA和載體質(zhì)粒pCold TF DNA。將酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接轉(zhuǎn)化E.coli TOPO 10，將轉(zhuǎn)化菌涂于含氨芐青霉素的LB(LBA)平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。鑒定的陽(yáng)性克隆子提取質(zhì)粒，送公司測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的α-HL/p-Cold TF陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21，涂LBA平板過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑取單菌落，PCR及測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒插入序列的正確性。

1.2.3 金黃色葡萄球菌α-HL的表達(dá)純化 接種轉(zhuǎn)化有α-HL/p-Cold TF陽(yáng)性重組質(zhì)粒的E.coli BL21于LBA培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4～0.5，立即將培養(yǎng)液移至15℃放置30 min，加入終濃度1 mmol/L 的IPTG，15℃振蕩培養(yǎng)24 h。離心取細(xì)菌沉淀，通過(guò)4種不同的裂解方法使得細(xì)菌裂解，再將裂解的沉淀和上清分別上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，鑒定融合蛋白的可溶性。4種不同的裂解方法分別為：① 取5 ml 表達(dá)細(xì)菌沉淀，加入500 μl天然蛋白Lysis buffer(配方參見(jiàn)Ni-NTA 親和純化系統(tǒng)說(shuō)明書(shū))重懸，反復(fù)凍融3～5次，離心分別取上清和沉淀備用；② 取5 ml 表達(dá)細(xì)菌沉淀，加入500 μl天然蛋白Lysis buffer重懸，加入溶菌酶，冰上搖動(dòng)30 min，再反復(fù)凍融3～5次，離心分別取上清和沉淀備用；③ 取5 ml 表達(dá)細(xì)菌沉淀，加入500 μl 1×PBS重懸,反復(fù)凍融3～5次，離心分別取上清和沉淀備用；④ 取5 ml 表達(dá)細(xì)菌沉淀，加入500 μl 1×PBS重懸,加入溶菌酶，冰上搖動(dòng)30 min，再反復(fù)凍融3～5次，離心分別取上清和沉淀備用。

按Invitrogen公司的Ni-NTA 親和純化系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)對(duì)表達(dá)的可溶性蛋白進(jìn)行天然純化，并進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot鑒定。鑒定表達(dá)、純化的蛋白采用抗His-tag單克隆抗體(GE Healthcare，來(lái)源于小鼠)和羊抗小鼠(IgG)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體(Promega,USA)進(jìn)行檢測(cè)，最后加入化學(xué)發(fā)光劑(Lu minata Crescendo Western HRP substrate，USA)顯色。

1.2.4 α-HL多克隆抗體的制備及效價(jià)測(cè)定 將純化的α-HL蛋白100 μg與弗氏完全佐劑混合，皮下注射BABL/c小鼠，間隔2周后，用50 μg α-HL蛋白與弗氏不完全佐劑混合后皮下注射BABL/c小鼠2次，每次中間間隔2周。末次注射后，心臟采血，離心取血清于4℃保存。

用包被液(0.1 mol/L NaHCO3/Na2CO3溶液)稀釋金黃色葡萄球菌為1×107CFU/ml，包被酶聯(lián)板4℃過(guò)夜，次日加入封閉液(1×PBST含5%脫脂奶粉)，37℃保濕溫育1 h。加入封閉液×100、×1 000、×10 000稀釋的α-HL抗血清，每孔100 μl，37℃封閉1 h；洗滌酶聯(lián)板后，加入羊抗鼠HRP(1∶5 000)抗體，37℃保濕溫育1 h；洗滌后加入TMB底物溶液避光顯色，30 min后加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀OD450讀數(shù)。

表1 用于擴(kuò)增金黃色葡萄球菌α-HL cDNA的引物對(duì)

Tab.1 Primer used for amplification of S.aureus α-HL cDNA

PrimerSequenceα-HLF1-Forword5'CACCATGCTATTGCTAGGTTCC3'α-HLR1-Reverse5'GGTACCTTTCCAATTTGTTGAAGTCCAATG3'α-HLF2-xhoⅠ5'CCGCTCGAGATGACACGTATAGTCAGCTCA3'α-HLR2-EcoRⅠ5'CCGGAATTCTTCTGAAGAACGATCTGTCCA3'

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌總RNA的提取與α-HL基因的擴(kuò)增 提取金黃色葡萄球菌總RNA時(shí)，采用了傳統(tǒng)的酚/氯仿抽提法、天根生物的總RNA提取試劑盒及本研究方法中使用的煮沸法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)前兩種方法提取的總RNA濃度和質(zhì)量都較低，不能滿足后續(xù)RT-PCR的要求，可能由于金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁厚而堅(jiān)固，導(dǎo)致破壁不完全。而煮沸法采用溶葡萄球菌酶使金黃色葡萄球菌破壁完全，釋放總RNA，從而得到質(zhì)量較高且完整的RNA，濃度為912.05 ng/μl ，采用0.8% 瓊脂糖電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總RNA的3條帶(28S、18S、5S)條帶清晰，說(shuō)明總RNA提取率高，并且降解少。

以總RNA為模板，Oliga dT15 為引物反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增α-HL基因片段時(shí)，采用了巢氏PCR，分兩次擴(kuò)增，其中第二次擴(kuò)增時(shí)在引物上加入了xhoⅠ和 EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，最終得到了大小為900 bp 左右的金黃色葡萄球菌α-HL基因片段(圖1)。

圖1 PCR擴(kuò)增α-HL cDNA Fig.1 Identification of amplified α-HL cDNA by PCRNote: M.DNA marker 1 000 bp；Line 3.α-HL cDNA.

2.2 金黃色葡萄球菌α-HL基因的克隆與表達(dá) 由于表達(dá)菌株E.coli BL21轉(zhuǎn)化效率低，所以將金黃色葡萄球菌α-HL和pCold-TF重組質(zhì)粒雙酶切并連接后，首先轉(zhuǎn)化E.coli TOPO 10菌株，PCR及測(cè)序驗(yàn)證插入序列正確后，將重組質(zhì)粒α-HL/p-Cold TF轉(zhuǎn)化E.coli BL21并進(jìn)行表達(dá)。pCold TF是插入蛋白可溶性標(biāo)簽的融合型冷休克表達(dá)載體，采用低溫誘導(dǎo)的方法，使大腸桿菌自身的蛋白質(zhì)合成受到抑制、目的蛋白質(zhì)獲得高效表達(dá)。pCold TF載體在His tag序列和多克隆位點(diǎn)之間插入了Trigger Factor(TF)基因，可與目的蛋白質(zhì)進(jìn)行融合表達(dá)，提高目的蛋白的可溶性。

在進(jìn)行金黃色葡萄球菌α-HL表達(dá)時(shí)，在15℃誘導(dǎo)表達(dá)了24 h，為了驗(yàn)證目的蛋白的可溶性，收集表達(dá)的細(xì)菌沉淀，分別用方法中所述4種方法對(duì)細(xì)菌沉淀進(jìn)行裂解，再離心分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示：4種方法中采用的Lysis buffer 和PBS中都不含有蛋白變性劑，為天然蛋白緩沖液，將表達(dá)的細(xì)菌沉淀用反復(fù)凍融或加入溶菌酶后反復(fù)凍融的方式使細(xì)菌裂解，離心后SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示4種方法都能夠有效的裂解表達(dá)細(xì)菌，從而使目的可溶性蛋白有效的釋放出來(lái)，所以細(xì)菌裂解上清中都有目的融合蛋白出現(xiàn)，大小為90 kD 左右(載體上的TF 分子伴侶大小為45 kD左右)，而裂解離心后的細(xì)菌碎片沉淀中并沒(méi)有出現(xiàn)目的蛋白。說(shuō)明表達(dá)的蛋白為可溶性蛋白，并且表達(dá)量高，達(dá)到了2 mg/100 ml 左右(圖2)。

2.3 金黃色葡萄球菌α-HL 的純化及鑒定 由于pCold-TF載體上帶有His-tag標(biāo)簽，對(duì)表達(dá)的可溶性蛋白Ni-NTA親和純化系統(tǒng)中天然蛋白純化條件進(jìn)行純化。純化后的蛋白用SDS-PAGE進(jìn)行了鑒定(圖3)，結(jié)果顯示在90 kD處出現(xiàn)了目的蛋白條帶。由于是將表達(dá)細(xì)菌進(jìn)行裂解，細(xì)菌的蛋白也同時(shí)釋放到緩沖液中。Ni-NTA親和純化系統(tǒng)在進(jìn)行純化時(shí)，對(duì)細(xì)菌蛋白也有一些非特異性的吸附，所以導(dǎo)致純化時(shí)出現(xiàn)了微弱的非特性條帶。為了驗(yàn)證在90 kD出現(xiàn)的條帶為α-HL，對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行了Western blot驗(yàn)證，結(jié)果顯示在90 kD處出現(xiàn)了單一條帶，說(shuō)明表達(dá)純化的可溶性蛋白為α-HL融合蛋白(圖4)。

圖2 SDS-PAGE電泳α-HL融合蛋白可溶性驗(yàn)證Fig.2 Analysis solubility of α-HL recombinant protein by SDS-PAGENote: M.Protein molecular weight marker；Line 1.Positive control；Line 2,4,6,8.Supernatant of lysised sample by method ①，②，③，④；Line 3，5，7，9.Precipitation of lysised sample from method ①，②，③，④.

圖3 SDS-PAGE分析純化的α-HL融合蛋白Fig.3 Analysis of purified α-HL protein by SDS PAGENote: M.Protein molecular weight marker；Line 1-3.Expressed protein of α-HL.

圖4 α-HL 純化蛋白Western blot 驗(yàn)證印跡Fig.4 Analysis of expressed α-HL protein by Wes-tern blot

圖5 α-HL多克隆抗體ELISA效價(jià)測(cè)定Fig.5 α-HL polyclonal antibody ELISA titer determination

2.4 抗金黃色葡萄球菌α-HL抗血清制備及效價(jià)測(cè)定 為了驗(yàn)證表達(dá)純化的α-HL融合蛋白具有生物學(xué)活性，將純化的金黃色葡萄球菌α-HL分3次皮下注射BABL/c小鼠，取血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)其抗血清效價(jià)。為了驗(yàn)證所制備的抗血清是針對(duì)金黃色葡萄球菌α-HL，在進(jìn)行ELISA檢測(cè)時(shí)，將金黃色葡萄球菌包被酶標(biāo)板，結(jié)果顯示制備的抗血清能與金黃色葡萄球菌良好結(jié)合，其抗血清效價(jià)>10 000倍(圖5)，說(shuō)明表達(dá)純化的α-HL融合蛋白是具有生物學(xué)活性的。

3 討論

金黃色葡萄球菌是一種人類(lèi)的主要病原菌，可造成危及生命的侵襲性感染，如肺炎、皮膚膿腫及菌血癥、心內(nèi)膜炎等。隨著全球范圍內(nèi)的抗生素濫用，出現(xiàn)了幾乎對(duì)所有抗生素(除萬(wàn)古霉素)耐藥的金葡菌MRSA。近年抗生素的研究滯后，使得金黃色葡萄球菌感染的治療越來(lái)越困難。研究發(fā)現(xiàn)，在健康人、金黃色葡萄球菌攜帶者和感染者的血清中，都檢測(cè)到有金葡菌的抗體，但此抗體的抗感染保護(hù)作用還存有很大爭(zhēng)議。

金黃色葡萄球菌α-HL是金黃色葡萄球菌的主要毒力因子，在感染中發(fā)揮主要作用。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)免疫治療的方法，以α-HL作為抗原，制備全人源的抗α-HL抗體，在小鼠肺炎模型中，可以顯著提高小鼠的存活率；在小鼠皮膚膿腫模型中，可以有效減小膿腫病灶并且使單位感染面積的細(xì)菌量顯著降低；在小鼠菌血癥模型中，小鼠的存活率也幾乎增大一倍[1]。因此，抗金黃色葡萄球菌α-HL全人源抗體藥物的開(kāi)發(fā)，具有極大臨床應(yīng)用潛力。本研究提取金黃色葡萄球菌總RNA，擴(kuò)增克隆α-HL cDNA，從而表達(dá)可溶性的α-HL。金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁厚而堅(jiān)固，裂解困難，RNA降解速度快，提取完整的總RNA不容易。通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)各種提取方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較，發(fā)現(xiàn)基于溶葡萄球菌酶的煮沸法是最好的提取方法，此法成功提取到高質(zhì)量的完整金葡菌總RNA。采用pCold-TF載體在E.coli BL21中對(duì)α-HL進(jìn)行可溶性表達(dá)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前研究最為深入，發(fā)展最迅速的原核表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌不僅在遺傳學(xué)背景、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理方面的研究非常清晰，而且擁有多種適應(yīng)不同表達(dá)的載體和宿主菌，但其缺點(diǎn)是表達(dá)的蛋白大部分為沒(méi)有生物學(xué)活性的包涵體。本研究采用pCold-TF表達(dá)載體在低溫條件下誘導(dǎo)表達(dá)的α-HL可溶性融合蛋白，將α-HL可溶性融合蛋白注射BABL/c小鼠，得到的抗血清可與金黃色葡萄球菌良好結(jié)合，說(shuō)明誘導(dǎo)表達(dá)的α-HL具有生物學(xué)活性[8]。采用pCold-TF表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的α-HL產(chǎn)量高，可達(dá)到2 mg/100 ml，可滿足后續(xù)全人源抗α-HL抗體的篩選。由于表達(dá)的α-HL為融合蛋白，帶有TF標(biāo)簽，在后續(xù)作為抗原進(jìn)行抗α-HL抗體的篩選時(shí)，為避免非特異性篩選，需用Factor Xa 將TF標(biāo)簽切除后再使用。

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[收稿2015-09-15 修回2015-11-24]

(編輯 倪 鵬)

Clone and soluble fusion expression of α-HL of Staphylococcus aureus

WU Tong,XU Wen-Feng,NIAN Si-Ji,YE Ying-Chun,YUAN Qing.The School of Basic Medical Sciences,Sichuan Medical University,Luzhou 646000，China

Objective:Expression and purification of the α-HL of Staphylococcus aureus as antigen for making full human anti-α-HL antibody later,providing of new treatment for Staphylococcus aureus infection.Methods: The total RNA of Staphylococcus aureus was extracted and the cDNA of α-HL was amplified by RT-PCR.The DNA of α-HL and pCold-TF plasmid was digested and ligated by T4 ligase and then transformed into E.coli TOPO 10.The recombinant plasmid α-HL/pCold-TF which verified by sequencing was transformed into E.coli BL21 for expression.The expression products was identified by SDS-PAGE and Western blot.Results: The size of amplified cDNA of α-HL was about 900 bp and the expressed soluble fusion protein of α-HL was about 90 kD(including the molecular chaperone in the vector) after inducing expression for 24 h at 15℃.The Western blot results showed that the expressed protein was the fusion protein of α-HL.The purified α-HL was injected into BABL/c mice for making antiserum.The results showed that the antiserum had good binding activity with Staphylococcus aureus and the titer was greater than 10 000 times.Conclusion: The α-HL of Staphylococcus aureus was successfully cloned and the soluble fusion protein of α-HL was successfully expressed.

Staphylococcus aureus；α-HL；Soluble expression

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.018

吳 桐(1982年-)，男，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事感染免疫學(xué)研究。

及指導(dǎo)教師：袁 青(1978年-)，女，博士，教授，主要從事重組抗體方面研究，E-mail:yuanqing_ok@hotmail.com。

R392.11

A

1000-484X(2016)04-0532-05

①本文為四川省科技廳項(xiàng)目(LY-96,013SZZ005)和瀘州市科技局項(xiàng)目(2013LZLY-K77)。