黃勛和，李麗芝，張金楓，何丹林，張細權(quán)，陳潔波，李威娜，杜炳旺，鐘福生*

(1. 嘉應學院生命科學學院，梅州 514015； 2. 華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣州 510642；3. 廣東海洋大學農(nóng)學院，湛江 524088)

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華南家雞MHC-B區(qū)域復合微衛(wèi)星位點LEI0258的遺傳多樣性與進化研究

黃勛和1，李麗芝1，張金楓1，何丹林2，張細權(quán)2，陳潔波1，李威娜1，杜炳旺3，鐘福生1*

(1. 嘉應學院生命科學學院，梅州 514015； 2. 華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣州 510642；3. 廣東海洋大學農(nóng)學院，湛江 524088)

旨在應用MHC-B區(qū)域復合微衛(wèi)星位點LEI0258研究華南家雞的遺傳多樣性與進化歷史。以華南地區(qū)和鄰省家雞及商品雞為試驗材料，對微衛(wèi)星位點LEI0258進行基因分型和測序，分析其遺傳多樣性和構(gòu)建中介網(wǎng)絡圖。結(jié)果表明，580份樣品共檢測到LEI0258的62個等位基因，長度范圍為182～501 bp，其中37個為首次發(fā)現(xiàn)。華南家雞LEI0258保持著較高的遺傳多樣性水平，觀察雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.813、0.960和0.957。中山沙欄雞、文昌雞和五華三黃雞的遺傳多樣性水平明顯高于廣西三黃雞。LEI0258的28個等位基因與27種已知MHC血清型相對應。基于LEI0258側(cè)翼區(qū)變異信息的中介網(wǎng)絡圖將62個等位基因分為8條進化枝，其中3條進化枝同樣存在于紅原雞中，提示華南家雞主要起源于紅原雞。部分等位基因存在于特定雞品種中，可作為品種鑒定的參考依據(jù)。結(jié)果提示，微衛(wèi)星位點LEI0258適用于地方雞群體遺傳多樣性、血清型鑒定、品種鑒定和進化研究。

主要組織相容性復合體；LEI0258；華南家雞；多態(tài)性；進化；血清型

地方家禽遺傳資源是生物多樣性的重要組成部分，是未來家禽品種改良和適應生產(chǎn)條件變化、保持生產(chǎn)長期持續(xù)發(fā)展的遺傳基礎[1]。研究家禽遺傳多樣性，綜合評估品種遺傳資源現(xiàn)狀與保護潛力，有助于揭示各品種間的歷史淵源及其親緣關(guān)系，對合理利用和保護地方品種、優(yōu)良基因庫具有重要的意義，是遺傳資源管理不可或缺的一個重要環(huán)節(jié)[2]。微衛(wèi)星(Microsatellite)又稱短串連重復(Short tandem repeats，STR)或簡單序列重復(Simple sequence repeats，SSR)，是評價遺傳多樣性與進化最常用的遺傳標記之一。曲魯江等利用27個微衛(wèi)星位點評估了中國78個地方雞品種的遺傳多樣性，為中國地方雞品種的利用和保護提供了重要的理論依據(jù)[3]。杜胭脂等利用27個微衛(wèi)星位點對山東汶上蘆花雞群體進行遺傳分析，結(jié)果顯示該群體遺傳多樣性偏低，建議采取適當?shù)谋Ｗo措施加以控制[4]。

微衛(wèi)星位點LEI0258是近期逐漸應用于雞遺傳多樣性與進化研究的分子標記[5-8]。與常規(guī)的選擇中性微衛(wèi)星標記不同，LEI0258定位于重要功能基因——雞16號染色體上的主要組織相容性復合體B區(qū)域(Major histocompatibility complex B region，MHC-B)[9]。MHC-B與宿主許多傳染性疾病(如馬可氏病)的抗性或易感性等有關(guān)[10-11]。傳統(tǒng)采用通過B區(qū)血清反應的方法對MHC進行血清型鑒定[12-13]。然而，由于該方法主要基于白來航雞等商業(yè)品種[14]，限制了在其他雞品種尤其是家雞上的應用，也不利于不同研究之間的比較[8]。微衛(wèi)星位點LEI0258與MHC血清型有很好的對應關(guān)系[15]，通過研究LEI0258可解決傳統(tǒng)血清型鑒定方法的局限性，因而獲得了廣泛的關(guān)注[5-8]。

華南地區(qū)(廣東省、香港特別行政區(qū)、澳門特別行政區(qū)、廣西壯族自治區(qū)、海南省和福建省中南部)有著豐富的地方雞遺傳資源，有14種地方雞品種入選中國畜禽遺傳資源志[1]。前期微衛(wèi)星標記研究表明華南地區(qū)地方雞保留著較高的遺傳多樣性水平[3,16-17]，但基于LEI0258的系統(tǒng)研究較少[7,18]。本研究以華南地區(qū)和鄰省家雞及商品雞為試驗材料，利用微衛(wèi)星位點LEI0258分析家雞的遺傳多樣性，界定LEI0258等位基因與MHC血清型的關(guān)系，探討利用LEI0258側(cè)翼變異信息作為品種鑒定依據(jù)的可行性，同時進一步了解LEI0258的進化動態(tài)，從而為華南家雞的基礎研究和保種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以10個華南地區(qū)雞種和2個鄰省家雞品種，以及2個商品雞種共580份樣品為試驗材料(表1)。五華三黃雞入選《中國禽類遺傳資源》[19]，其余11種家雞均入選《中國畜禽遺傳資源志·家禽志》[1]。嶺南黃雞為華南地區(qū)常見商品雞，隱性白洛克常用于新品系培育。五華三黃雞、陽山雞樣品采自其原產(chǎn)地，其余10個家雞品種采自保種場，商品雞采自養(yǎng)雞場。樣品類型包括血液和羽毛。DNA基因組采用試劑盒HiPure Tissue DNA Mini Kit(美基生物，廣州)提取，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴增與基因分型

微衛(wèi)星位點LEI0258使用引物LEI0258F(5′-CACGCAGCAGAACTTGGTAAGG-3′)和LEI0258R(5′-AGCTGTGCTCAGTCCTCAGTGC-3′)擴增[9]。正向引物5′端加上FAM熒光標記。PCR反應體系為20 μL:1×PCR buffer，200 μmol·L-1dNTP mixture，正、反向引物各200 nmol·L-1，1 UTaqDNA聚合酶(TaKaRa, 大連)，50 ng DNA模板。擴增條件：94 ℃預變性4 min；然后35個循環(huán)(94 ℃變性30 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在ABI 3730分析儀進行基因型判定(上海翼和應用生物技術(shù)有限公司)。

1.3 微衛(wèi)星測序

基于基因分型結(jié)果挑選特定等位基因進行測序。每個等位基因挑選1～3個樣品進行測序；如果一個等位基因分布于多個品種中，則挑選不同品種的樣品進行測序。需測序等位基因割膠純化后連接T載體(TaKaRa, 大連)，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，經(jīng)LEI0258引物PCR鑒定后送廣州艾基生物技術(shù)有限公司雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

等位基因數(shù)(NA)、觀察雜合度(Observed heterozygosity，HO)、期望雜合度(Expected heterozygosity，HE)和多態(tài)信息含量(Polymorphic information content，PIC)由軟件Cervus3.0.3[20]執(zhí)行。為減少因樣本量差異干擾等位基因多態(tài)性的判讀，采用稀疏的方法(Rarefaction)計算等位基因豐度[Ar(g)]和私有等位基因豐度[Ap(g)]，g代表在一個群體內(nèi)最少的樣本數(shù)，在軟件ADZE1.0[21]執(zhí)行。序列由軟件BioEdit7.2.5[22]編輯處理，并輔以人工校驗。在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)搜索本研究鑒定的LEI0258的等位基因是否與已發(fā)表的相同。序列比對在MEGA6.0[23]進行，使用軟件SplitsTree4.10構(gòu)建基于LEI0258側(cè)翼序列的中介網(wǎng)絡圖(Median-joining network)[24]。

2 結(jié) 果

2.1 LEI0258等位基因多態(tài)性

580份樣品經(jīng)基因分型共檢測到72個等位基因，長度為181～507 bp，其中等位基因275頻率最高(103，0.089)，其次是205(94，0.081)、310(75，0.065)和495(67，0.058)。大多數(shù)等位基因都分布于南方家雞中，而等位基因448只在商品雞中分布。如表1所示，微衛(wèi)星位點LEI0258在家雞顯示出較高的遺傳變異水平，大部分雞種的HO高于0.8，但

表1 雞群體微衛(wèi)星位點LEI0258的遺傳變異分析

Table 1 Genetic diversity of LEI0258 for 12 indigenous chicken breeds and 2 commercial chicken breeds

品種Breed個體數(shù)Individual等位基因多態(tài)性Allelediversity遺傳多態(tài)性GeneticdiversityNAAr(g)Ap(g)HEHOPIC南方家雞SouthernChinaindigenouschickens5317125.14514.0960.9600.8270.958 華南家雞SouthChinaindigenouschickens4326935.00113.0580.9600.8130.957 文昌雞Wenchang,WC342919.6481.7490.9610.8240.945 廣西三黃雞GuangxiYellow,GX321410.5740.1620.8690.5940.841 懷鄉(xiāng)雞Huaixiang,HX772715.7681.5450.9350.8440.924 杏花雞Xinghua,XH352115.2220.3290.9240.7430.905 中山沙欄雞Shalan,SL362819.9693.2710.9660.8060.951 清遠麻雞QingyuanPartridge,QY463418.3782.7420.9490.7830.935 陽山雞Yangshan,YS341914.9380.5980.9360.7350.917 惠陽胡須雞HuiyangBearded,HY352015.4520.6590.9340.9140.916 五華三黃雞WuhuaThree-yellow,WH583218.7744.1870.9570.8790.946 河田雞Hetian,HT452514.7882.9910.9210.8890.905 非華南家雞Non-SouthChinaindigenouschickens993730.0368.0870.9250.8890.917 寧都黃雞NingduYellow,ND492519.0277.7160.8910.8980.876 黃郎雞Huanglang,HL502922.21210.9010.9460.8800.933商品雞Commercialchickens492317.0405.9880.9010.7960.884 嶺南黃雞IIILingnanYellowIII,LN292112.6029.9810.9440.9310.924 隱性白洛克WhiteRecessiveRock,WR2064.7032.0820.6780.6000.603

NA.等位基因數(shù)：Ar(g) .等位基因豐度；Ap(g). 私有等位基因豐度；南方家雞對商品雞g為49，華南家雞對非華南家雞g為99，華南家雞內(nèi)g為32，非華南家雞內(nèi)g為49，商品雞內(nèi)g為20.HE.期望雜合度；HO.觀察雜合度；PIC. 多態(tài)信息含量

NA. Total number of alleles;Ar(g),Ap(g). Allelic and private allelic richness, respectively; With rarefaction for a corresponding sample size of 49 for Southern China indigenous chickensvs. commercial chickens, 99 forSouthChina indigenous chickensvs. non-SouthChina indigenous chickens, 32 within South China indigenous chickens, 49 within non-SouthChina indigenous chickens, 20 for within commercial chickens.HE. Expected heterozygosity;HO. Observed heterozygosity;PIC. Polymorphic information content

廣西三黃雞明顯低于其他地方雞種；所有家雞的PIC高于0.8。經(jīng)稀疏處理后，華南家雞的等位基因豐度高于非華南家雞，私有等位基因豐度高于非華南家雞。在華南家雞群體中，廣西三黃雞的等位基因豐度最低，中山沙欄雞和文昌雞的最高；但五華三黃雞的私有等位基因豐度最高，中山沙欄雞次之，廣西三黃雞最低。在非華南家雞中，黃郎雞的遺傳多樣性水平要高于寧都黃雞?？傮w而言，商品雞的遺傳多樣性要明顯低于家雞，特別是高度商品化的隱性白洛克。

2.2 LEI0258核苷酸多態(tài)性

挑選243個片段進行DNA測序，獲得了62個等位基因，片段長度為182～501 bp，其中37個等位基因為首次發(fā)現(xiàn)(表2)。這些新等位基因序列已提交到NCBI基因庫，基因登錄號為KX365351～KX365387。基于毛細管電泳分型的等位基因182、193、194、205、206和217與測序結(jié)果大小相一致，其他的均小于測序結(jié)果。LEI0258有兩個典型的重復單元R13(CTATGTCTTCTTT)和R12(CTTTCCTTCTTT)，重復次數(shù)分別為1～17和2～28，呈現(xiàn)此消彼長的關(guān)系，兩者的不同組合構(gòu)成了不同的等位基因。重復區(qū)上游有77 bp(包括引物序列)，下游76 bp。上游發(fā)現(xiàn)8個變異位點，以轉(zhuǎn)換為主，-29～-30 bp出現(xiàn)“TT”缺失的現(xiàn)象。下游發(fā)現(xiàn)8個變異位點，以顛換為主。部分等位基因出現(xiàn)下游11～18“ATTTTGAG”的缺失現(xiàn)象，但僅限于小于241 bp的等位基因。11～18 bp位置的多態(tài)現(xiàn)象與O.Chazara等[8]和B.Han等[7]的報道相同，但與J.E.Fulton等[15]報道的“ATTTGAGG”有所差異。

2.3 LEI0258側(cè)翼區(qū)序列分析

去掉重復區(qū)序列后，基于LEI0258側(cè)翼區(qū)的變異信息構(gòu)建中介網(wǎng)絡圖(圖1)。62個等位基因分為8條進化枝(A～H)，每條進化枝含1～21個等位基因，E、G和H分別只有1個等位基因，而F則有21個。R13重復次數(shù)大于1的等位基因僅限于進化枝C中。在紅原雞中同樣發(fā)現(xiàn)進化枝A、B和G的等位基因。LEI0258的部分等位基因只出現(xiàn)在單個雞品種中，如308(懷鄉(xiāng)雞)、367(清遠麻雞)、453(中山沙欄雞)、477(五華三黃雞)等；有些只出現(xiàn)在少數(shù)雞品種中，如231(陽山雞、河田雞)、357(懷鄉(xiāng)雞、寧都黃雞)、379(懷鄉(xiāng)雞、清遠麻雞)等；有些是廣泛分布，如193、205、249、306、309、369、501等；而443則只分布在商品雞中。

圖1 基于微衛(wèi)星位點LEI0258側(cè)翼區(qū)變異信息的中介網(wǎng)絡圖Fig.1 Median-joining network of 62 alleles defined within the flanking sequences of LEI0258

27種MHC血清型與28個LEI0258的等位基因相對應，分布于A、B、C、D和F 5條進化枝中，血清型B27在進化枝A出現(xiàn)一次。

3 討 論

3.1 LEI0258多態(tài)性

本研究獲得了雞LEI0258微衛(wèi)星位點LEI0258的62個等位基因，其中37個未在其他群體中發(fā)現(xiàn)[6-8,15]?？傮w而言，華南家雞保持著較高的遺傳多樣性水平，高于許多地方雞群體如會寧雞、靜寧雞、絲羽烏骨雞和商品雞[8,25]。不同地方品種的遺傳多樣性有所差異，如廣西三黃雞顯著低于其他地方品種，而中山沙欄雞、文昌雞和五華三黃雞最高。這可能與不同品種的選育歷史和保育現(xiàn)狀有關(guān)，如廣西三黃雞經(jīng)歷了長期的選育[26]，遺傳多樣性較低[27]；而五華三黃雞未經(jīng)系統(tǒng)選育[28-29]，因而遺傳多樣性也較高[30]。此外，商品雞的遺傳多樣性明顯低于地方家雞，這是由于商品雞往往經(jīng)歷了短期高強度的人工選育和較低的有效群體數(shù)量的緣故[2]，因而在地方雞品種保種選育過程中，應注意隨機交配和保存較大的群體數(shù)量。因此，將微衛(wèi)星位點LEI0258作為研究雞群體遺傳多樣性的候選分子標記是可行的。

3.2 LEI0258與血清型

雞的抗病能力與MHC血清型類型的豐富程度正相關(guān)[8,18，31]。本研究確定了LEI0258的28個等位基因的血清型，分別對應于MHC的27種血清型，未發(fā)現(xiàn)品種特異的血清型。這些血清型大部分來源于白來航雞等商品雞，并已在其他雞群體中得到了驗證[7,15,31]。其他34個等位基因的血清型還有待于確認，將來需開展家雞的MHC血清型鑒定工作和與抗病能力等的對應關(guān)系研究，從而為家雞的抗病研究提供理論依據(jù)。

3.3 LEI0258與品種鑒定

B.Han等研究發(fā)現(xiàn)LEI0258稀有等位基因可作為鑒定雞品種和監(jiān)測雞群體保護動態(tài)的依據(jù)[7]。本研究新發(fā)現(xiàn)的37個等位基因是特定雞品種特有的，如308(懷鄉(xiāng)雞)、367(清遠麻雞)、231(陽山雞、河田雞)、357(懷鄉(xiāng)雞、寧都黃雞)等，說明LEI0258具有作為雞品種鑒定的候選分子標記的可能性。但由于受限于研究樣本，LEI0258私有等位基因作為品種鑒定的依據(jù)是否可行還需進一步探討。同時，隨著經(jīng)貿(mào)的發(fā)展，不同雞品種的交流日益頻繁，并且不斷有新培育品系上市，如嶺南黃雞、新浦東雞、京海黃雞等，品種的遺傳特性正在逐漸減小，品種鑒定工作難度加大。因此，品種鑒定除了依靠微衛(wèi)星位點LEI0258外，還需要聯(lián)合外形特征和其他分子標記，如COI基因[32]、細胞色素b基因[33]等。

3.4 LEI0258與進化

與經(jīng)典的微衛(wèi)星位點不同，LEI0258由兩個分別為13個堿基和12個堿基的重復單元組成，重復次數(shù)多達31次[8,15]。同時側(cè)翼區(qū)存在大量的插入缺失和堿基突變，顯示出極高的多態(tài)性[5-8,15,25]。目前NCBI數(shù)據(jù)庫上LEI0258等位基因有80個，加上本研究新發(fā)現(xiàn)的37個，遠高于一般的微衛(wèi)星位點[5-8,15]。相比于微衛(wèi)星重復區(qū)，側(cè)翼區(qū)要保守的多，因而側(cè)翼區(qū)的變異信息可作為劃分等位基因的依據(jù)。但需要注意的是，基于側(cè)翼區(qū)變異信息構(gòu)建的中介網(wǎng)絡圖可能更多反映的是等位基因之間的關(guān)系，而非系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系[8]。同時，LEI0258位于MHC-B編碼區(qū)，受到選擇的壓力，因而LEI0258也可能處于選擇和動態(tài)進化中[34]。

中介網(wǎng)絡圖將本研究鑒定的62個等位基因分為8條進化枝，其中紅原雞同樣存在進化枝A、B和G的等位基因，同時與灰原雞和黑尾原雞具有一些相同的等位基因，提示南方家雞主要起源于紅原雞[35-36]，但也有其他原雞的遺傳貢獻[37]。

4 結(jié) 論

華南家雞在微衛(wèi)星位點LEI0258上顯示出較高的遺傳多樣性水平，與群體的遺傳資源現(xiàn)狀相符，說明LEI0258可作為評估雞群體遺傳多樣性的分子標記。鑒于LEI0258與MHC血清型關(guān)聯(lián)的特性，通過鑒定LEI0258等位基因，可顯著降低血清型分型成本和提高研究效率。LEI0258私有等位基因可作為雞品種鑒定的參考分子標記，但需聯(lián)合其他技術(shù)手段。另外，從LEI0258側(cè)翼區(qū)的變異信息可從側(cè)面驗證家雞的起源馴化?？傊?，微衛(wèi)星位點LEI0258是研究地方雞群體遺傳多樣性與進化的有力工具，將來需進一步探討該位點的形成機制和進化動態(tài)。

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(編輯 郭云雁)

Evaluation of Diversity and Evolution of the Microsatellite LEI0258 in ChickenMHC-BRegion from South China

HUANG Xun-he1，LI Li-zhi1，ZHANG Jin-feng1，HE Dan-lin2，ZHANG Xi-quan2，CHEN Jie-bo1，LI Wei-na1，DU Bing-wang3，ZHONG Fu-sheng1*

(1.SchoolofLifeSciences,JiayingUniversity,Meizhou514015,China; 2.CollegeofAnimalSciences,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China; 3.CollegeofAgricultural,GuangdongOceanUniversity,Zhanjiang524088,China)

The aim of the study was to investigate polymorphism and evolution in South China chickens by the tandem repeat LEI0258 located within the B region of the chicken major histocompatibility complex (MHC-B region). Genotypes and sequences of LEI0258 were obtained from 12 Southern China chicken breeds and 2 commercial chicken breeds, and then these data were used to analyze genetic diversity and construct median-joining network. A total of 62 alleles were defined by DNA sequencing ranged from 182 to 501 bp in 580 samples, 37 of which was novel for these chicken breeds. The LEI0258 showed high levels of polymorphism in South China chickens, with 0.813, 0.960 and 0.957 for observed heterozygosity, expected heterozygosity and polymorphic information content, respectively. The Shalan, Wenchang and Wuhua Three-yellow chicken breeds had higher levels of genetic diversity than Guangxi Yellow chicken. Twenty-eight alleles of LEI0258 were corresponding to 27 available serotypes of MHC. The 62 alleles of LEI0258 were classified into 8 clusters in median-joining network, based on the SNPs and indels found within the flanking sequences, and 3 of which was found in red junglefowl, indicating that South China chicken mainly originated from red junglefowl. Some alleles existed in a certain chicken breed, which could be as a candidate marker for breed identification. The results suggest that LEI0258 can be used as a molecular marker for elucidate genetic diversity, serology and breed identification, evolution in indigenous chicken breeds.

major histocompatibility complex; LEI0258; South China indigenous chickens; polymorphism; evolution; serotype

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.11.004

2016-04-05

廣東省自然科學基金項目(2014A030307018)；嘉應學院“創(chuàng)新強校工程”項目(CQX019)；廣東省公益研究與能力建設項目(2015A020208020；2016A030303068)

黃勛和(1982-)，男，廣東河源人，講師，博士，主要從事中國家雞遺傳多樣性與進化研究，E-mail：hxh826@jyu.edu.cn

*通信作者：鐘福生，教授，E-mail：zfs@jyu.edu.cn

S831.2

A

0366-6964(2016)11-2175-09