謹(jǐn) 瑾，張祿滑，文心田，李 英，代 科，周 鵬,2，趙玉佳，曹三杰，黃小波，伍 銳，趙 勤，文翼平*

(1．四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 豬病研究中心，成都 611130；2．四川省攀枝花市農(nóng)牧局，攀枝花 617000)

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副豬嗜血桿菌potD基因缺失株的構(gòu)建及其部分生物學(xué)特性

謹(jǐn) 瑾1，張祿滑1，文心田1，李 英1，代 科1，周 鵬1,2，趙玉佳1，曹三杰1，黃小波1，伍 銳1，趙 勤1，文翼平1*

(1．四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 豬病研究中心，成都 611130；2．四川省攀枝花市農(nóng)牧局，攀枝花 617000)

potD基因編碼的蛋白質(zhì)作為轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，負(fù)責(zé)多胺的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)，為細(xì)胞的正常生長(zhǎng)提供必需因子，已在多種病原菌中鑒定為毒力相關(guān)因子，但在副豬嗜血桿菌中的作用還不清楚。利用自然轉(zhuǎn)化法構(gòu)建potD缺失株SC1401ΔpotD::kan，再比較親本株和缺失株的生長(zhǎng)特性、自凝集活性、生物被膜形成能力、抗血清殺菌能力以及對(duì)小鼠的致病力。結(jié)果顯示potD基因的缺失不影響副豬嗜血桿菌的生長(zhǎng)、自凝集活性和生物被膜形成能力，但導(dǎo)致該菌的抗血清殺菌能力和對(duì)小鼠的致病力顯著降低。以上結(jié)果表明potD基因可能與副豬嗜血桿菌的毒力相關(guān)。

副豬嗜血桿菌；potD；毒力；自然轉(zhuǎn)化；缺失株

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)屬于巴氏桿菌科(Pasteurellaceae)，是Gl?sser’s病的病原，給我國(guó)乃至世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前，已報(bào)道該菌有15種血清型，不同血清型之間、甚至同一血清型的不同菌株之間，往往呈現(xiàn)出較大的毒力差異[2]。因此，區(qū)分毒力和非毒力菌株，并鑒定新的毒力因子對(duì)于副豬嗜血桿菌病的準(zhǔn)確診斷和有效控制起著積極的作用。

多胺(如腐胺、亞精胺等)是細(xì)胞正常生長(zhǎng)的必需因子，細(xì)菌主要通過轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)來獲取該物質(zhì)。目前研究較為清楚的是PotABCD轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中PotD作為底物結(jié)合蛋白，負(fù)責(zé)多胺的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)[3]。在小鼠感染模型中，肺炎鏈球菌potD基因的缺失導(dǎo)致該菌毒力顯著降低[4]。在大腸桿菌中，potD基因編碼的蛋白質(zhì)具有促進(jìn)生物被膜形成的功能[5]。在嗜肺軍團(tuán)菌中，potD基因的缺失導(dǎo)致該菌對(duì)Na+高度敏感，并且對(duì)宿主細(xì)胞的黏附性降低[6]。但是，potD基因在HPS致病過程中的作用還不清楚。

本試驗(yàn)通過自然轉(zhuǎn)化法，構(gòu)建HPS SC1401菌株的potD基因缺失株，并對(duì)其生長(zhǎng)特性、自凝集狀況、生物被膜形成能力、抗血清殺菌能力以及對(duì)小鼠的毒力進(jìn)行研究，以確定potD基因在HPS致病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑

副豬嗜血桿菌SC1401野毒株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心分離、鑒定并保存；質(zhì)粒pKD4購(gòu)自耶魯大學(xué)菌種保藏中心；胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)購(gòu)自美國(guó)BD公司；小牛血清購(gòu)自Gibco公司。兔抗PotD血清、Hucker結(jié)晶紫溶液、新鮮豬血清均為作者實(shí)驗(yàn)室制備或保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank (CP001321.1) 公布的HPS SH0165菌株基因組中potD序列，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)基因缺失及鑒定引物(表1)。potD-L1/L2用于擴(kuò)增上游同源臂，potD-R1/R2用于擴(kuò)增下游同源臂，Kan-L/R用于從質(zhì)粒pKD4擴(kuò)增卡那抗性基因，potD-L/R用于potD基因的檢測(cè)。引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

表1 本研究所用的引物序列

Table 1 Primers used in this study

引物Primer引物序列(5'→3')Sequence長(zhǎng)度/bpLengthpotD-L1potD-L2ACCGCTTGTTAGCTTTGGCACAACGAGTGACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAATGTATTCTCCTAAAAGA1028potD-R1potD-R2ACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCTTCCATAGACATCGCTTAAAACCGCTTGTGTGTGCCAAAAGCCTCAATA1028Kan-LKan-RGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCGGTCGGTCATTTCGAACCCC935potD-LpotD-RCATCTTTATACTTGGACAGACTTCGCAGCTTTTAACTCTT960

用于融合PCR擴(kuò)增的25 bp重疊區(qū)域用下劃線標(biāo)識(shí)，HPS的USS序列用粗體字標(biāo)識(shí)

The 25 bp extensions required for In-Fusion PCR are underlined. The USS ofH.parasuisis indicated in bold text

1.3 potD基因缺失融合片段的構(gòu)建

提取菌株SC1401基因組，分別擴(kuò)增potD基因上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因，產(chǎn)物膠回收后，利用引物對(duì)potD-L1/potD-R2通過overlap-PCR將potD基因上、下游同源臂和卡那抗性基因融合，得到Up-Kan-Down片段，用于后續(xù)缺失株的構(gòu)建。

1.4 potD缺失株的構(gòu)建、篩選及鑒定

potD缺失株的構(gòu)建參照已優(yōu)化的自然轉(zhuǎn)化方法[7]。從TSA平板挑取自然感受態(tài)菌株SC1401，重懸于TSB，調(diào)整菌液濃度為5×1010·mL-1。將20 μL菌液和1 μg Up-Kan-Down片段混勻后，點(diǎn)樣于TSA平板，37 ℃孵育5 h。之后將細(xì)菌重懸于TSB中，適當(dāng)稀釋后涂布于含50 μg·mL-1卡那霉素的TSA平板，37 ℃培養(yǎng)2～3 d。在抗性平板上生長(zhǎng)菌落通過PCR進(jìn)行鑒定，PCR鑒定陽性菌再利用兔抗PotD血清做進(jìn)一步的Western blot鑒定，最終獲得缺失株SC1401ΔpotD::kan。

1.5 potD缺失株生長(zhǎng)曲線的繪制

分別挑取親本株和缺失株單菌落于5 mL TSB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜。第2天，以1 ∶100倍稀釋到新鮮TSB培養(yǎng)基中，在37 ℃ 200 r·min-1繼續(xù)培養(yǎng)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。測(cè)定菌液OD600 nm值，將結(jié)果繪制成生長(zhǎng)曲線。

1.6 細(xì)菌自凝集試驗(yàn)

根據(jù)已報(bào)道的自凝集試驗(yàn)方法[8]，從TSA平板挑取單菌落接種于10 mL TSB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)16 h。離心收集菌體并重懸于新鮮TSB培養(yǎng)液至OD600 nm為大約0.6，室溫靜置，每30 min測(cè)定一次懸浮液的吸光度，測(cè)定4 h。

1.7 生物被膜形成試驗(yàn)

取1 mL TSB培養(yǎng)液加入試管中，接種細(xì)菌后于37 ℃培養(yǎng)16 h，轉(zhuǎn)速為150 r·min-1。之后吸出菌液，加入1.5 mL Hucker結(jié)晶紫溶液，室溫染色5 min。吸出染液，并用水洗去多余染料。干燥后，用1 mL 33%的醋酸溶解，測(cè)定OD630 nm。以無菌TSB培養(yǎng)液試管的OD630 nm值為陰性對(duì)照，以2倍陰性對(duì)照OD值為截?cái)嘀蹬袛嗌锉荒さ男纬?。每個(gè)樣本至少進(jìn)行3次重復(fù)。

1.8 抗血清殺菌試驗(yàn)

根據(jù)已報(bào)道的抗血清殺菌試驗(yàn)方法[9]，取100 μL細(xì)菌菌液(約1×108CFU·mL-1)，分別和100 μL新鮮豬血清(采集健康豬全血，4 ℃靜置過夜，吸取析出的血清，4 000 r·min-1離心10 min以除去殘留的紅細(xì)胞，無菌條件分裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆?或56 ℃滅活(56 ℃，30 min，并隨時(shí)搖晃均勻)的豬血清混合，在37 ℃下振蕩培養(yǎng)1 h，之后10倍倍比稀釋涂于TSA平板，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。細(xì)菌存活率為新鮮血清中細(xì)菌存活數(shù)除以滅活血清中細(xì)菌存活數(shù)。每個(gè)樣本至少進(jìn)行3次重復(fù)。

1.9 小鼠毒力試驗(yàn)

6～8周齡雌性BALB/c小白鼠購(gòu)買于成都達(dá)碩公司，所有小鼠均提供充足的食物和水。將小白鼠隨機(jī)分成3組，每組10只。1、2組分別腹腔注射親本株和缺失株，劑量為1.4×109CFU·只-1。第3組為對(duì)照組，注射PBS。觀察7 d內(nèi)小鼠死亡情況。

1.10 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad PRISM 5.0軟件分析，當(dāng)兩個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行比較時(shí)使用t檢驗(yàn)分析，當(dāng)三個(gè)或更多試驗(yàn)組進(jìn)行比較時(shí)使用ANOVA分析。P<0.05時(shí)判定為顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 potD基因上下同源臂、抗性基因的PCR擴(kuò)增與融合

用potD-L1/L2與potD-R1/R2兩對(duì)引物擴(kuò)增副豬嗜血桿菌SC1401菌株的相應(yīng)目的條帶，大小均為1 028 bp；用Kan-L/R從質(zhì)粒pKD4上擴(kuò)增卡那霉素抗性基因，大小為935 bp；通過overlap-PCR獲得potD基因上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因融合片段，即Up-Kan-Down，大小為2 941 bp(圖1)。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.卡那霉素抗性基因片段；2.上游同源臂臂；3.下游同源臂；4.Up-Kan-Down片段M. DNA marker；1. Kan fragment；2. Upstream homologous arm；3. Downstream homologous arm； 4. Up-Kan-Down fragment圖1 potD 同源臂的擴(kuò)增與融合Fig.1 The amplification and overlap extension of homologous arm by PCR

2.2 缺失株SC1401ΔpotD::kan的鑒定

當(dāng)使用引物potD-L/R檢測(cè)時(shí)，親本株產(chǎn)生條帶，大小為960 bp，缺失株不產(chǎn)生條帶，當(dāng)使用引物Kan-L/R檢測(cè)時(shí)，親本株不產(chǎn)生條帶，缺失株產(chǎn)生條帶，大小為935 bp(圖2A)。PCR鑒定正確后，再利用兔抗PotD血清進(jìn)一步做Western blot鑒定，結(jié)果顯示，親本株菌體蛋白質(zhì)可產(chǎn)生條帶，缺失株無條帶(圖2B)。

2.3 缺失株SC1401ΔpotD::kan的生長(zhǎng)特性

結(jié)果表明，在37 ℃條件下，親本株SC1401和缺失株SC1401ΔpotD::kan的生長(zhǎng)狀況差異不顯著(P>0.05)，即potD基因?qū)υ摼纳L(zhǎng)無明顯調(diào)控作用(圖3)。

2.4 親本株和缺失株自凝集活性和生物被膜形成能力比較

自凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示，親本株和缺失株自凝集現(xiàn)象均不明顯，且彼此間差異不顯著(P>0.05)(圖4A)。生物被膜形成試驗(yàn)的結(jié)果顯示，親本株和缺失株均為強(qiáng)生物被膜形成菌株(其OD630 nm值均大于陰性對(duì)照OD630 nm值2倍以上)，但二者生物被膜形成能力無顯著差異(P>0.05)(圖4B)。

A．PCR鑒定：M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3，引物potD-L/R鑒定；4～6.引物Kan-L/R鑒定；1、4.親本菌；2、5.突變株；3、6.陰性對(duì)照。B.免疫印跡鑒定：1.親本菌；2.突變株A. Identification by PCR: M. DNA marker; 1-3. Identification with primers potD-L/R; 4-6. Identification with primers Kan-L/R; 1, 4. SC1401; 2, 5. SC1401 ΔpotD::kan; 3, 6. Negative control; B. Identification by Western blot: 1. SC1401; 2. SC1401 ΔpotD::kan圖2 potD缺失株的鑒定Fig.2 Identification of the mutant strain SC1401 ΔpotD::kan

該試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，每次重復(fù)設(shè)3個(gè)平行組，生長(zhǎng)曲線代表其中一次重復(fù)試驗(yàn)The experiments were performed three times independently in triplicates. The representative growth curve from one of three independent experiments is shown圖3 SC1401和SC1401 ΔpotD::kan生長(zhǎng)曲線Fig.3 The growth curves of SC1401 and SC1401 ΔpotD::kan

2.5 親本株和缺失株抗血清殺菌能力比較

結(jié)果顯示，在50%血清中，親本株SC1401具有較高水平的抗血清殺菌能力，而缺失株SC1401ΔpotD::kan抗血清殺菌能力顯著降低(P<0.05)(圖5)。結(jié)果表明potD基因的缺失降低了HPS抗血清殺菌能力。

2.6 親本株和缺失株對(duì)小鼠毒力的比較

小鼠毒力試驗(yàn)顯示，親本株攻毒后1 d，死亡率已達(dá)到70%，第2天全部死亡，而缺失株攻毒后7 d，死亡率僅為30%，表明potD基因的缺失導(dǎo)致HPS對(duì)小鼠的致病力減弱(圖6)。

試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，每次重復(fù)設(shè)3個(gè)平行組。該結(jié)果代表其中一次重復(fù)(A)。誤差線代表3次重復(fù)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差(B)The experiments were performed three times independently in triplicates. The representative result from one of three independent experiments is shown (A). Error bars represent the standard deviations of three independent experiments (B)圖4 SC1401和SC1401 ΔpotD::kan自凝集活性及生物被膜的形成Fig.4 The autoagglutination and biofilm formation of SC1401 and SC1401 ΔpotD::kan

試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，每次重復(fù)設(shè)3個(gè)平行組，誤差線代表3次重復(fù)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差The experiments were performed three times independently in triplicates. Error bars represent the standard deviations of three independent experiments圖5 SC1401和SC1401 ΔpotD::kan在50%豬血清中的存活率Fig.5 Survival of SC1401 and SC1401 ΔpotD::kan treated with 50% porcine serum

采用log-rank檢驗(yàn)比較親本株SC1401和缺失株SC1401 ΔpotD::kan對(duì)小鼠的毒力，差異顯著(P<0.05)P<0.05 when comparing the mouse survival rate infected by SC1401 versus SC1401 ΔpotD::kan using the log-rank test圖6 SC1401和SC1401 ΔpotD::kan對(duì)小鼠毒力的比較Fig.6 Survival rates of mice inoculated with either SC1401 or SC1401 ΔpotD::kan

3 討 論

21世紀(jì)以來，利用同源重組的方法構(gòu)建基因缺失株的應(yīng)用越來越普遍，以同源重組為基礎(chǔ)構(gòu)建基因缺失株有幾種不同的方法，應(yīng)用最多的就是同源重組質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化和接合轉(zhuǎn)移[10]。自然轉(zhuǎn)化(natural transformation)是指在自然條件下，細(xì)菌能夠主動(dòng)攝取外源DNA 并將其整合進(jìn)自己的染色體中穩(wěn)定遺傳的過程[11-12]。自1928年首次發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化以來，細(xì)菌自然遺傳轉(zhuǎn)化現(xiàn)象已在多種細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)[13-14]。巴斯德菌屬的很多細(xì)菌都被證實(shí)具有自然轉(zhuǎn)化能力，副豬嗜血桿菌作為巴斯德菌屬的一員也不例外[7]。在自然生長(zhǎng)環(huán)境中，細(xì)菌通過自然轉(zhuǎn)化獲得新的遺傳性狀，如耐藥性、致病性。2005年，A. Bigas等建立了副豬嗜血桿菌自然轉(zhuǎn)化的試驗(yàn)方法作為HPS一種基因操作系統(tǒng)用以研究毒力相關(guān)基因的功能[15]。自此，自然轉(zhuǎn)化在副豬嗜血桿菌上的應(yīng)用越來越廣泛，也使副豬嗜血桿菌基因功能的研究變得越來越便利。

為研究potD基因在HPS中的作用，作者首先采用自然轉(zhuǎn)化法敲除potD基因。目前，自然轉(zhuǎn)化法作為一種有效的基因缺失方法在HPS中得到普遍采用。該方法首先將目的基因左、右同源臂和抗性基因進(jìn)行融合，再與自殺性質(zhì)粒連接，重組質(zhì)粒再進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，達(dá)到基因缺失的目的[16-17]。連接自殺質(zhì)粒的主要目的在于保護(hù)同源臂免受宿主酶系統(tǒng)剪切。因此，為簡(jiǎn)化步驟，作者延長(zhǎng)同源臂長(zhǎng)度至1 000 bp，但不連接自殺質(zhì)粒，直接用融合片段進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，最終成功獲得了缺失株。該試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了之前的猜想。

親本株和potD缺失株的生長(zhǎng)狀況無顯著變化，表明potD基因的缺失對(duì)HPS的生長(zhǎng)未造成影響，這和之前的報(bào)道一致[4]。生物被膜是病原微生物產(chǎn)生耐藥性、免疫逃逸和持續(xù)感染的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)potD基因的缺失對(duì)HPS生物被膜的形成未產(chǎn)生影響，這與之前的研究結(jié)果有所不同[5]。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在HPS基因組中，還存在另一個(gè)可能具有與potD類似功能的基因，該基因所編碼蛋白功能的發(fā)揮補(bǔ)充了potD基因缺失所帶來的影響?？寡鍤⒕饔米鳛椴≡囊环N免疫逃逸機(jī)制，是病原菌借以抵抗宿主殺傷，并引起全身性感染的有力工具。本研究顯示potD基因的缺失引起HPS抗血清殺菌能力顯著降低，并導(dǎo)致HPS對(duì)小鼠致病力減弱，但該影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

PotD基因的缺失不影響HPS的生長(zhǎng)狀況、自凝集活性和生物被膜形成能力，但導(dǎo)致該菌的抗血清殺菌能力和對(duì)小鼠的致病力降低。PotD基因可能與HPS的毒力相關(guān)。

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(編輯 白永平)

Construction and Characterization of aHaemophilusparasuispotDMutant Strain

JIN Jin1, ZHANG Lu-hua1, WEN Xin-tian1,LI Ying1, DAI Ke1, ZHOU Peng1,2, ZHAO Yu-jia1,CAO San-jie1, HUANG Xiao-bo1, WU Rui1, ZHAO Qin1, WEN Yi-ping1*

(1.ResearchCenterofSwineDisease,CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China; 2.PanzhihuaBureauofAgricultureandAnimalHusbandry,Panzhihua617000,China)

As a transporter, protein encoded bypotDis involved in the binding and transportation of polyamine, which is necessary for the growth of cells. In some pathogens, the protein is identified as a virulence-associated factor, but of which the function is still unclear inHaemophilusparasuis. ApotDmutant strain SC1401ΔpotD::kanwas constructed by the natural transformation method. The growth curve, the ability of autoagglutination and biofilm formation, serum resistance ability and the virulence to mice of the parental strain SC1401 andpotDmutant strain were measured. No significant difference was observed between the parental and mutant strains in the growth curve and the ability of autoagglutination and biofilm formation. However thepotDmutant strain showed an obvious decrease in serum resistance ability and the virulence to mice. The findings above suggested thatpotDgene may be associated with virulence inH.parasuis.

Haemophilusparasuis;potD; virulence; natural transformation; mutant

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.11.015

2016-06-27

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303034)

謹(jǐn) 瑾(1993-)，女，山西運(yùn)城人，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病的研究工作，E-mail：JIN109JIN@163.com；張祿滑(1986-)，男，四川內(nèi)江人，博士，主要從事動(dòng)物傳染病的研究工作，E-mail：zhangluhua520@126.com。二人同為第一作者

*通信作者：文翼平，博士，E-mail：yueliang5189@163.com

S852.613

A

0366-6964(2016)11-2274-06