金亞倩，劉文忠,趙俊星，任有蛇，張春香，張文佳，項(xiàng)斌偉，馬雪豪，張建新*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801； 2.山西省右玉縣畜牧局，右玉 037200)

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釀酒葡萄皮渣對(duì)單欄飼養(yǎng)方式下公綿羊繁殖性能及睪丸抗氧化性的影響

金亞倩1，劉文忠1,趙俊星1，任有蛇1，張春香1，張文佳2，項(xiàng)斌偉2，馬雪豪1，張建新1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801； 2.山西省右玉縣畜牧局，右玉 037200)

旨在研究日糧中添加一定量的釀酒葡萄皮渣對(duì)綿羊繁殖性能及睪丸抗氧化性能的影響。試驗(yàn)選取30只5月齡，體重(25±1)kg的杜泊×小尾寒羊雜交公羊，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)平均分為5組。1組自由活動(dòng)，其余4組單欄飼養(yǎng)，建立應(yīng)激模型。自由活動(dòng)綿羊飼喂未添加葡萄皮渣日糧，單欄飼養(yǎng)綿羊分別飼喂不同葡萄皮渣添加水平(0%、5%、10%、20%)日糧。試驗(yàn)期80 d。試驗(yàn)結(jié)束后，屠宰取樣，測(cè)定睪丸系數(shù)并作附睪精子分析，測(cè)定睪丸組織抗氧化水平，對(duì)睪丸組織中Cu-ZnSOD、CAT、GPx4及Nrf2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行研究。結(jié)果表明，與自由活動(dòng)組相比，單欄組綿羊睪丸組織中MDA及ROS水平升高(P<0.01)，睪丸重量顯著降低(P<0.05)，睪丸系數(shù)也表現(xiàn)出下降趨勢(shì)(P=0.06)，附睪精子密度及頂體完整率顯著降低(P<0.05)，精子活動(dòng)率極顯著降低(P<0.01)，精子畸形率極顯著升高(P<0.01)，表明單欄飼養(yǎng)方式對(duì)綿羊造成氧化應(yīng)激，并在一定程度上影響綿羊繁殖性能。適量添加釀酒葡萄皮渣后，綿羊附睪精子密度和精子活動(dòng)率均顯著升高(P<0.05)，精子畸形率顯著降低(P<0.05)，睪丸組織MDA含量顯著下降(P<0.01)，SOD、CAT及GSH-Px活性均顯著提高(P<0.01，P<0.05，P<0.01)；睪丸組織中Cu-ZnSODmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，Cu-ZnSOD、CAT、GPx4蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)。綜上表明，釀酒葡萄皮渣可以提高單欄飼養(yǎng)方式下綿羊睪丸組織抗氧化性，進(jìn)而改善綿羊繁殖性能。

單欄飼養(yǎng)；釀酒葡萄皮渣；公綿羊；睪丸；繁殖性能；抗氧化性

中國養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展迅速，在為農(nóng)民帶來增收的同時(shí)，也對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了巨大壓力。因此，在北方地區(qū)，尤其是在牧區(qū)，養(yǎng)羊模式已經(jīng)從傳統(tǒng)的放牧飼養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)橐陨犸暈橹鞯募s化飼養(yǎng)模式[1]。為了減少占地面積，降低飼養(yǎng)成本，舍飼狀態(tài)下羊群密度也在增加，羊只活動(dòng)范圍越來越小，這種變化對(duì)羊造成一定應(yīng)激，影響其生產(chǎn)性能與繁殖性能[2]。

釀酒葡萄皮渣(Wine grape pomace，WGP)是葡萄酒廠的下腳料，中國每年會(huì)產(chǎn)生80萬t以上的WGP，其中極少部分被用作肥料，絕大部分被直接當(dāng)垃圾倒掉，造成了環(huán)境污染與資源浪費(fèi)[3]。WGP中含有較高的粗蛋白和粗脂肪，是一種很好的飼料，更重要的是其含有大量的葡多酚，能夠有效清除機(jī)體自由基，減少氧化應(yīng)激[4-6]，有利于動(dòng)物的生產(chǎn)與健康[7-9]。

雄性動(dòng)物睪丸組織中含大量高不飽和脂肪酸[10]，且在精子發(fā)生過程中會(huì)產(chǎn)生大量活性氧[11]，使其更易遭受氧化應(yīng)激。當(dāng)睪丸組織受到氧化損傷時(shí)，精子發(fā)生障礙，精液品質(zhì)下降[10]。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇[12]、原花青素[13]等天然抗氧化劑可以減少大鼠睪丸組織損傷，提高組織抗氧化水平，改善繁殖性能。本研究鑒于WGP的抗氧化功能，以杜泊×小尾寒羊雜一代公羔為研究對(duì)象，通過單欄飼養(yǎng)方式來建立應(yīng)激模型，旨在研究WGP對(duì)單欄飼養(yǎng)方式下綿羊繁殖性能以及睪丸抗氧化性能的影響，為合理利用廢渣、減少資源浪費(fèi)，同時(shí)開發(fā)功能性飼料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與主要儀器

1.1.1 試驗(yàn)日糧 所用WGP購自山西省太谷縣怡園干紅葡萄酒廠，經(jīng)自然晾曬后貯存?zhèn)溆谩GP中所含常規(guī)營養(yǎng)成分及總多酚含量均在試驗(yàn)開始前測(cè)定(表1)。

表1 釀酒葡萄皮渣營養(yǎng)成分表(風(fēng)干基礎(chǔ))

Table 1 Nutrient composition of wine grape pomace (air-dry matter basis)%

基礎(chǔ)日糧參照NRC(2007)綿羊營養(yǎng)需要中體重25 kg，日增重200 g公羔營養(yǎng)需要設(shè)計(jì)配方，其他3種日糧分別添加5%、10%、20%WGP，調(diào)整玉米、豆粕及粗飼料的比例，使這3種日糧能量、蛋白含量與基礎(chǔ)日糧一致。試驗(yàn)日糧均制成全混合顆粒飼料。4種試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

1.1.2 主要試劑 附睪稀釋液參照文獻(xiàn)[14]配制，配方見表3。

表2 試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)成分

Table 2 Composition and nutrient level of diets (air-dry matter basis)%

原料IngredientⅠⅡⅢⅣ玉米Corn29.0027.0024.9520.90豆粕Soybeanmeal9.008.608.207.40麩皮Wheatbran4.004.004.004.00胡麻餅Oilcakeofflaxseed5.005.005.005.00預(yù)混料Mineral/vitaminpremix5.005.005.005.00釀酒葡萄皮渣Winegrapepomace0.005.0010.0020.00莜麥秸Nakedoatsstraw35.0034.6534.2533.50土豆菀Potatorattan13.0010.758.604.20合計(jì)Total100.00100.00100.00100.00營養(yǎng)水平Nutrientlevel干物質(zhì)Drymatter88.4388.5788.5189.01消化能/(MJ·kg-1)Digestibleenergy10.6010.5310.4710.33粗蛋白Crudeprotein11.7311.9012.2112.43中性洗滌纖維Neutraldetergentfiber42.8543.2043.3844.06鈣Calcium0.400.400.390.40磷Phosphorus0.250.260.260.26

飼料中微量元素添加量(mg·kg-1)：Cu 14， Fe 50， Mn 40， Se 0.3， I 0.5， Co 0.2;飼料中維生素添加量(IU·kg-1)：VA 20 000， VD 4 000， VE 400。除DE外，飼料中其他各營養(yǎng)成分均為實(shí)測(cè)值

Additive mineral premix(mg·kg-1)：Cu 14, Fe 50, Mn 40, Se 0.3, I 0.5, Co 0.2; Additive vitamin premix(IU·kg-1):VA 20 000, VD 4 000, VE 400. Beside DE, the composition of diet was measured by analyzing really

表3 附睪稀釋液配方

Table 3 Ingredients of the diluent of epididymis

成分Ingredients生產(chǎn)廠家Manufacturer編號(hào)No.含量/(mg·100mL-1)ContentNaCl上海生工生物工程有限公司7647-14-5800.0KCl上海生工生物工程有限公司7447-40-720.0MgSO4·7H2O天津市興復(fù)科技發(fā)展有限公司10034-99-853.3NaH2PO4·2H2O天津市興復(fù)科技發(fā)展有限公司13472-35-06.5NaHCO3天津興沃化工科技有限公司144-55-8100.0葡萄糖Glucose上海生工生物工程有限公司7447-40-7100.0CaCl2·2H2O天津市興復(fù)科技發(fā)展有限公司10035-04-826.5

總可抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化物酶(CAT)、丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)測(cè)定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自TaKaRa 公司；Goat-Cu/ZnSOD多克隆一抗(sc-8637)、Goat-Catalase多克隆一抗(sc-34281)、Rabbit-GPx4多克隆一抗(sc50497)購自Santa Cruz Biotechnology公司，Rabbit-Nrf2多克隆一抗(LS-C31637)購自LifeSpan BioSciences公司，β-Tubulin Antibody購自Cell Signaling Technology公司，Donkey Anti-goat IgG-HRP(sc-2020)二抗和Donkey Anti-rabbit IgG-HRP(sc-2313)二抗購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.1.3 主要儀器 顯微鏡(Olympus，BH2型)、酶標(biāo)儀(BioTek Synergy H1/H1MFD)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Mx3000，Stratagene，美國)、Western bolt電泳儀(Bio-Rad Mini-PROTEAN，CAT1658001)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用30只5月齡，體重25 kg左右的杜泊×小尾寒羊雜一代公羔，試驗(yàn)前經(jīng)過嚴(yán)格檢疫。試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將30只試驗(yàn)羊隨機(jī)分為5組，每組6只：A、B、C、D為單欄飼養(yǎng)，活動(dòng)范圍為0.8 m2，E組6只羊混合飼養(yǎng)，且能自由活動(dòng)，每只羊平均活動(dòng)范圍為2.00 m2。A、E組飼喂日糧I(WGP含量為0)；B組飼喂日糧II(WGP含量為5%)；C組飼喂日糧III(WGP含量為10%)；D組飼喂日糧IV(WGP含量為20%)。其中，A組(對(duì)照組)與E組對(duì)比用于建立應(yīng)激模型。

1.3 動(dòng)物飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2015年5-8月在山西省右玉縣宏宇牧業(yè)有限公司種羊養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)期90 d，其中預(yù)飼期10 d，正式期80 d。試驗(yàn)前對(duì)試驗(yàn)羊舍進(jìn)行清掃消毒，并對(duì)試驗(yàn)羊進(jìn)行免疫注射羊痘、口蹄疫和小反芻獸疫疫苗。在預(yù)飼期進(jìn)行試驗(yàn)羊的分組、編號(hào)及驅(qū)蟲工作，使試驗(yàn)羊適應(yīng)單欄飼養(yǎng)管理方式，并將B、C、D組的日糧由基礎(chǔ)日糧逐漸過渡到其相應(yīng)的試驗(yàn)日糧。

正式期，試驗(yàn)羊每日分兩次飼喂，分別為8:00和18:00，各組羊飼喂其相應(yīng)的日糧，所有羊自由采食，自由飲水，并記錄每只羊每天的采食量。

1.4 樣品采集

在試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天下午16:00，對(duì)所有試驗(yàn)羊禁食、禁水16 h，并在次日上午8:00進(jìn)行屠宰。屠宰后，將一側(cè)附睪組織放入40 mL 附睪稀釋液中，迅速將其剪碎，靜置15 min以使附睪中的精子充分逸出，然后用兩層擦鏡紙濾去組織殘?jiān)瞥删討乙阂杂米骶臃治?冰上操作)；取一側(cè)睪丸組織剪成小塊，液氮速凍，-80 ℃保存，用于測(cè)定組織抗氧化指標(biāo)以及提取總RNA與總蛋白。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 睪丸重量系數(shù)及睪丸體積計(jì)算 屠宰后迅速取兩側(cè)睪丸，去除周圍結(jié)締組織，稱取兩側(cè)睪丸總重量，計(jì)算睪丸系數(shù)，公式：睪丸系數(shù)(%)=(睪丸重量/體重)×100%；測(cè)量睪丸長、寬、厚，計(jì)算睪丸體積，體積(cm3)=長×寬×厚。

1.5.2 精子分析 精子密度：用移液槍吸取0.1 mL精子懸液，用附睪稀釋液將其稀釋20倍，然后取20 μL滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，作好記錄。

精子活動(dòng)率：取精子懸液10 μL滴于載玻片上，加上蓋玻片，低倍鏡下觀察5個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)精子，記錄活動(dòng)精子百分率。

精子畸形率：將精子懸浮液制作抹片，以中性福爾馬林固定，風(fēng)干后姬姆薩染液染色1 h后清水沖洗，顯微鏡觀察。精子畸形率(%)=(畸形精子數(shù)/精子總數(shù))×100%。

頂體完整率：樣品處理同精子畸形率，頂體完整率(%)=(頂體完整精子數(shù)/精子總數(shù))×100%。

1.5.3 睪丸組織抗氧化指標(biāo)測(cè)定 樣品預(yù)處理：取在 -80 ℃ 保存的睪丸樣品，在液氮中充分研磨至粉末，稱取組織粉末1 g，按1∶9的比例加入冰冷生理鹽水，用組織勻漿儀勻漿5～10 min，制成10%的組織勻漿。將制好的勻漿4 ℃，3 500 r·min-1離心10 min，取上清進(jìn)行下一步檢測(cè)。

睪丸組織上清T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA、ROS水平等指標(biāo)測(cè)定按照南京建成公司提供的試劑盒說明書操作。

1.5.4 mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 按照Trizol法提取睪丸組織總RNA，檢測(cè)濃度及完整性后，以RNA單鏈為模板，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA。引物(表4)參照GenBank上已登錄的綿羊Cu-ZnSOD、CAT、GPx4及Nrf2基因序列，以RPL13為內(nèi)參基因，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)5對(duì)特異性引物，然后將設(shè)計(jì)好的引物與NCBI基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行引物比對(duì)，對(duì)其進(jìn)行特異性檢測(cè)，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，結(jié)果根據(jù)2-△△CT法計(jì)算。

表4 各基因引物序列

Table 4 Primer sequence

基因登錄號(hào)引物序列(5'-3')產(chǎn)物/bpGenenameAccessionNo.PrimersequenceProductCu-ZnSODNM_001145185.1F:GGAGACCTGGGCAATGTGAAR:CCTCCAGCGTTTCCAGTCTT182CatalaseXM_004016396.3F:GAGCCCACCTGCAAAGTTCTR:CTCCTACTGGATTACCGGCG148GPx4XM_015096017.1F:TCGCTGCTGGCTATAACGTCR:GACCATACCGCTTCACCACA189Nrf2XM_015098735.1F:TGTGGAGGAGTTCAACGAGCR:CGCCGCCATCTTGTTCTTG88RPL13XM_015100414.1F:GCAAAAAGGGCCAAGGAAGCR:CAAAGGTCAGACACACCCCA155

1.5.5 Western blot分析 利用蛋白裂解液提取睪丸組織總蛋白，SDS-PAGE電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后加入相應(yīng)一抗，4 ℃過夜，漂洗后孵育相應(yīng)二抗，室溫2 h，漂洗，用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行曝光。將曝光結(jié)果用Image Lab軟件分析，得到目的蛋白與內(nèi)參β-Tubulin的蛋白含量，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白含量/β-Tubulin蛋白含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用Excel 2013初步整理和計(jì)算，用于建立應(yīng)激模型的數(shù)據(jù)(A組與E組)采用SPSS 22.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析；單欄飼養(yǎng)的4組數(shù)據(jù)(A、B、C、D組)采用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析，并用Dunnett法將各處理組與對(duì)照組進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 飼養(yǎng)方式對(duì)綿羊繁殖性能的影響

由表5可以看出，自由活動(dòng)組綿羊睪丸重量顯著高于單欄組(P<0.05)，睪丸系數(shù)也有升高趨勢(shì)，但未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)；與自由活動(dòng)組相比，單欄組綿羊睪丸長度、寬度及體積均顯著降低(P<0.05)，厚度無顯著性差異(P>0.05)；自由活動(dòng)組綿羊附睪精子密度和頂體完整率顯著高于單欄組(P<0.05)，精子活動(dòng)率極顯著地高于單欄組(P<0.01)，精子畸形率極顯著地低于單欄組(P<0.01)。

表5 飼養(yǎng)方式對(duì)公綿羊繁殖性能的影響

Table 5 Effect of feeding model on reproductive performance of ram

指標(biāo)Item飼養(yǎng)方式Feedingmodel單欄Separated自由活動(dòng)FreeSEMP睪丸重量/gWeightoftestis316.00430.00*18.030.024睪丸系數(shù)/%Coefficientoftestis0.931.090.040.062睪丸長/cmLengthoftestis10.2311.30*0.370.045睪丸寬/cmWidthoftestis5.776.17*0.120.033睪丸厚/cmThicknessoftestis4.504.570.160.690睪丸體積/cm3Volumeoftestis265.58318.24*16.340.030精子密度/(×107·mL-1)Spermconcentration17.6344.63*7.480.023精子活動(dòng)率/%Spermmotility64.6886.53**4.030.006精子畸形率/%Spermdeformity21.2112.04**1.710.006頂體完整率/%Acrosomalintegrity52.8863.10*2.580.020

同行標(biāo)有*表示與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有**表示與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，不標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05)。下表同

In the same raw, values with * mean significant difference with control group atP<0.05, **mean significant difference with control group atP<0.01, no * means no significant difference with control group (P>0.05). The same as below

2.2 飼養(yǎng)方式對(duì)綿羊睪丸組織氧化水平的影響

本研究中單欄組綿羊睪丸組織T-AOC與自由活動(dòng)組相比有升高趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)(圖1A)。MDA和ROS都是機(jī)體氧化應(yīng)激產(chǎn)生的有害物質(zhì)，本研究中綿羊睪丸組織MDA及ROS水平在單欄飼養(yǎng)后極顯著升高(P<0.01)(圖1B、C)。

**. P<0.01圖1 飼養(yǎng)方式對(duì)綿羊睪丸組織T-AOC(A)、MDA(B)及ROS(C)含量的影響Fig.1 Effect of feeding model on testicular T-AOC (A), MDA (B) and ROS (C) level of ram

2.3 日糧中添加釀酒葡萄皮渣對(duì)綿羊睪丸發(fā)育及附睪精子分析結(jié)果的影響

由表6可以看出，添加WGP 3個(gè)處理組的睪丸均較對(duì)照組重，但差異不顯著(P>0.05)；睪丸系數(shù)基本無變化(P>0.05)，可能是由于睪丸重量增加不及體重增加幅度大所導(dǎo)致；睪丸長度在添加WGP后有增加趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組相比，3個(gè)添加組的睪丸寬度、厚度及體積均未出現(xiàn)顯著變化(P>0.05)。10%和20%WGP添加組與對(duì)照組相比，附睪精子密度明顯增大(P<0.01)，5%添加組精子密度也較對(duì)照組大，差異顯著(P<0.05)；添加WGP可以提高綿羊精子活動(dòng)率，降低精子畸形率，其中5%和10%添加組的精子活動(dòng)率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，10%添加組的精子畸形率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，20%添加組與對(duì)照組相比未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)；添加釀酒葡萄皮渣后，頂體完整率有升高趨勢(shì)，但未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)。研究表明，釀酒葡萄皮渣可以改善單欄飼養(yǎng)方式下綿羊的繁殖性能。

2.4 日糧中添加釀酒葡萄皮渣對(duì)綿羊睪丸組織抗氧化性的影響

由表7可以看出，綿羊睪丸組織的T-AOC未受到WGP添加水平的影響(P>0.05)。睪丸組織中的MDA含量在添加WGP后有所降低，3個(gè)添加組均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。CAT、GSH-Px及SOD是機(jī)體內(nèi)存在的3種主要抗氧化酶，尤其是GSH-Px及SOD在動(dòng)物睪丸組織中含量較高，其活性可以有效反映睪丸組織的抗氧化能力。本研究中3種抗氧化酶活性在添加WGP后都出現(xiàn)了不同程度的升高，其中5%和20%添加組CAT活性極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，10%添加組CAT活性也高于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)；3個(gè)添加組的GSH-Px活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，SOD活性均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

表6 WGP添加水平對(duì)公綿羊繁殖性能的影響

Table 6 Effect of wine grape pomace on reproductive performance of ram

指標(biāo)ItemWGP添加水平/%Levelofgrapepomace051020SEMP睪丸重量/gWeightoftestis316.00340.50336.50352.5020.790.457睪丸系數(shù)/%Coefficientoftestis0.931.010.830.920.110.467睪丸長/cmLengthoftestis10.2311.5711.0311.270.770.390睪丸寬/cmWidthoftestis5.776.605.835.370.640.330睪丸厚/cmThicknessoftestis4.504.574.234.270.180.250睪丸體積/cm3Volumeoftestis265.58351.02270.05257.7641.550.170精子密度/(×107·mL-1)Spermconcentration17.6325.50*38.25**34.50**4.130.004精子活動(dòng)率/%Spermmotility64.6878.88*76.07*71.833.630.020精子畸形率/%Spermdeformity21.2119.9813.84*17.641.750.013頂體完整率/%Acrosomalintegrity52.8854.6458.5556.733.130.357

表7 WGP添加水平對(duì)綿羊睪丸組織抗氧化性能的影響

Table 7 Effect of wine grape pomace on testicular anti-oxidative status of ram

指標(biāo)ItemWGP添加水平/%Levelofwinegrapepomace051020SEMPT-AOC/(U·mg-1)2.152.091.541.510.330.170MDA/(nmol·mg-1)1.210.76**0.65**0.60**0.100.001CAT/(U·mg-1)4.294.76**4.554.75**0.100.005GSH-Px/(U·mg-171.5696.46*121.75*102.00*11.110.034SOD/(U·mg-1)5.887.00**8.04**6.86**0.160.001

2.5 不同WGP添加水平下綿羊睪丸組織中Cu-ZnSOD、CAT、GPx4和Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量

Nrf2是機(jī)體抗氧化信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵因子，Cu-ZnSOD、CAT、GPx4是其下游靶基因，調(diào)控抗氧化酶的表達(dá)，與機(jī)體抗氧化水平密切相關(guān)。本研究用內(nèi)參RPL13 mRNA對(duì)睪丸組織中Cu-ZnSOD、CAT、GPx4和Nrf2 mRNA表達(dá)量進(jìn)行校正，其熒光定量分析結(jié)果見圖2。由圖2A可以看出，10%和20%WGP添加組睪丸組織Cu-ZnSODmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，5%添加組與對(duì)照組相比基本無差異(P>0.05)；由圖2B～D可見，不同WGP添加水平下，睪丸組織CAT、GPx4和Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)。

*.P<0.05。A.Cu-ZnSOD；B.GPx4；C.CAT；D.Nrf2圖2 不同WGP添加水平下綿羊睪丸組織Cu-ZnSOD、CAT、GPx4和Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative Cu-ZnSOD，GPx4，CAT and Nrf2 mRNA expression level in ram testis from groups with different WGP level

2.6 不同WGP添加水平下綿羊睪丸組織中Cu-ZnSOD、CAT、GPx4和Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量

Western blotting對(duì)不同WGP添加水平綿羊睪丸抗氧化蛋白相對(duì)定量結(jié)果如圖3。Cu-ZnSOD、CAT、GPx4、Nrf2和Tubulin蛋白分子量分別為23、64、21、60和55 ku。根據(jù)圖3A相對(duì)灰度值分析結(jié)果顯示，WGP添加組Cu-ZnSOD蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組，其中10%添加組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；由圖3B可以看出，5%添加組GPx4蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，10%添加組極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；由圖3C可見，5%添加組CAT蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比極顯著升高(P<0.01)，20%添加組較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，而10%添加組與對(duì)照組相比有升高趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)；由圖3D可見，Nrf2蛋白在各組之間的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

*.P<0.05；**.P<0.01.A.Cu-ZnSOD；B.GPx4；C.CAT；D.Nrf2圖3 不同WGP添加水平下綿羊睪丸組織中Cu-ZnSOD、CAT、GPx4和Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative Cu-ZnSOD, GPx4, CAT and Nrf2 protein contents in ram testis from groups with different WGP level

3 討 論

3.1 飼養(yǎng)方式對(duì)綿羊繁殖性能及氧化應(yīng)激的影響

動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境、日糧條件、運(yùn)輸?shù)榷紩?huì)對(duì)動(dòng)物造成一定程度的應(yīng)激，影響其正常生長與健康。研究表明，高密度飼養(yǎng)極顯著降低了肉仔雞采食水平與日增重，影響生產(chǎn)性能[15]。在日糧中添加高不飽和脂肪酸會(huì)引起大鼠血清抗氧化酶活性下降，MDA和NO升高，肝細(xì)胞DNA發(fā)生損傷，使機(jī)體多處組織遭受氧化損傷[14]。運(yùn)輸應(yīng)激不僅會(huì)引起動(dòng)物免疫機(jī)能發(fā)生變化，還會(huì)降低肉品質(zhì)[16-17]。另外，束縛應(yīng)激也會(huì)造成氧化損傷[18]，對(duì)于雄性動(dòng)物而言，尤其影響其精子發(fā)生，致使睪酮分泌異常，降低動(dòng)物繁殖性能[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，束縛應(yīng)激會(huì)使雄性動(dòng)物生殖細(xì)胞退化，顯著降低動(dòng)物睪丸重量和精液品質(zhì)[21]。據(jù)P.H.Priya報(bào)道，束縛應(yīng)激會(huì)進(jìn)一步加劇酒精對(duì)大鼠繁殖性能造成的損傷[22]。G.Bitgul等發(fā)現(xiàn)長期束縛會(huì)使大鼠發(fā)生氧化應(yīng)激，細(xì)胞凋亡，引起睪丸組織受損[12]。

本試驗(yàn)通過模擬束縛應(yīng)激模型，研究單欄飼養(yǎng)方式對(duì)綿羊造成的應(yīng)激損傷。研究結(jié)果表明，無論從睪丸重量還是從睪丸體積來看，單欄組均顯著低于自由活動(dòng)組，睪丸系數(shù)也有降低趨勢(shì)，這說明單欄飼養(yǎng)從一定程度上限制綿羊睪丸的正常發(fā)育。從附睪精子分析結(jié)果表明，自由活動(dòng)組精子數(shù)量是單欄組的2.5倍，精子活力也極顯著高于單欄組，說明單欄飼養(yǎng)會(huì)降低綿羊精液品質(zhì)，影響綿羊繁殖性能。T-AOC能夠有效反映機(jī)體防御體系抗氧化能力的強(qiáng)弱，與機(jī)體健康水平存在著密切聯(lián)系；MDA是機(jī)體發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物之一；ROS是參與機(jī)體氧化還原反應(yīng)的含氧自由基以及能夠生成自由基的過氧化物的總稱，過多會(huì)使組織發(fā)生氧化損傷。本研究通過對(duì)睪丸組織中T-AOC、MDA及ROS的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，單欄飼養(yǎng)會(huì)增加綿羊睪丸中的MDA和ROS含量，但是T-AOC無顯著性變化。這一結(jié)果說明單欄飼養(yǎng)方式會(huì)造成綿羊機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，但是其本身的抗氧化能力并沒有升高，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加劇，有害產(chǎn)物MDA增加。大鼠在遭受有毒物質(zhì)(如重金屬或殺蟲劑等)作用后，血清及睪丸組織中的MDA都出現(xiàn)不同程度升高，抗氧化酶活性顯著下降，并伴隨精液品質(zhì)下降[23-25]。由此推測(cè)，本研究綿羊睪丸組織遭受氧化損傷可能是導(dǎo)致其附睪精子密度及活力下降的原因之一。

3.2 釀酒葡萄皮渣對(duì)綿羊繁殖性能的影響

器官重量與系數(shù)在一定程度上可以反映其功能強(qiáng)弱，使人們了解動(dòng)物的某種機(jī)能狀況和健康水平，在理論研究及生產(chǎn)實(shí)踐中都有重要的指導(dǎo)意義[26]。在本研究中，各WGP添加組之間睪丸重量與系數(shù)無顯著性差異，說明WGP并沒有從睪丸重量方面改善綿羊繁殖性能。附睪是精子成熟與貯存的重要場(chǎng)所，附睪精子密度與活力能夠有效反映動(dòng)物精液品質(zhì)的高低[27]。本試驗(yàn)在添加WGP后，綿羊附睪精子數(shù)量均顯著增加，精子活力也顯著提高，但添加量達(dá)到20%時(shí)反而開始下降，說明適量添加WGP有利于提高綿羊精液品質(zhì)。白藜蘆醇是WGP中的一種重要活性物質(zhì)，可以緩解睪丸扭轉(zhuǎn)引起的生殖細(xì)胞凋亡[28]。本研究中綿羊附睪精子密度與活力的改善可能與WGP中的白藜蘆醇具有重要關(guān)系。另外，有研究發(fā)現(xiàn)桑葉提取物能夠提高小鼠睪丸組織T-AOC，有效改善水浸及束縛應(yīng)激造成的睪丸功能紊亂[29]。Y. A. Heba等發(fā)現(xiàn)，綠茶提取物是一種有效的抗氧化劑,可以減緩丙烯酰胺對(duì)小鼠睪丸造成的損傷[30]。因此，在本研究中，WGP添加組附睪精子密度與活力的提高可能與組織本身氧化應(yīng)激水平與抗氧化能力有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。

3.3 釀酒葡萄皮渣對(duì)綿羊睪丸組織抗氧化性的影響

葡多酚以其超強(qiáng)的抗氧化性，早已被人們熟知，而WGP作為酒廠廢渣卻被大家所忽視。目前，關(guān)于葡萄渣的研究還多集中于葡萄皮(籽)提取物上。研究表明，葡萄原花青素可以保護(hù)紅細(xì)胞膜免受脂質(zhì)過氧化，防止溶血現(xiàn)象[31]。F. Natella等發(fā)現(xiàn)，葡萄籽提取物可以提高人體飯后血漿抗氧化能力[32]。組織總抗氧化能力是反應(yīng)組織抗氧化水平最直觀的指標(biāo)；抗氧化酶活性對(duì)減輕組織氧化應(yīng)激，抵抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)具有重要意義，也是反映組織抗氧化能力的一個(gè)重要指標(biāo)。MDA作為氧化應(yīng)激反應(yīng)的終產(chǎn)物之一，其含量能夠有效反映組織遭受氧化應(yīng)激的程度。在本試驗(yàn)中，睪丸組織MDA含量隨著WGP添加量的加大而逐漸減少，且3個(gè)添加組均顯著低于對(duì)照組；SOD、CAT及GSH-Px活性在添加WGP后均顯著升高，說明WGP可以通過提高組織抗氧化酶的活性來消除體內(nèi)自由基，阻礙脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生。白藜蘆醇也可以提高睪丸組織中GSH-Px活性，降低MDA含量[12]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。睪丸組織抗氧化水平變化趨勢(shì)與本研究附睪精子分析結(jié)果相吻合，說明睪丸組織抗氧化水平的提高可能是精液品質(zhì)提高的因素之一。秦小偉等也研究發(fā)現(xiàn)，精漿Cu-ZnSOD活性與精子活力和精子密度呈正相關(guān)[33]。

生物機(jī)體代謝速率一方面與酶的活性有關(guān)，另一方面還與其數(shù)量有關(guān)。當(dāng)代謝旺盛時(shí)，機(jī)體除了提高酶活性外，還會(huì)增加酶的數(shù)量來滿足代謝需要[34]。在本試驗(yàn)中，睪丸組織MDA含量在添加WGP后顯著降低，除了與酶活性有關(guān)外，是否還和其數(shù)量有一定關(guān)系，筆者作了進(jìn)一步研究。從mRNA水平來看，10%和20%添加量提高了Cu-ZnSOD表達(dá)量，對(duì)CAT及GPx4的表達(dá)并無影響；但從蛋白水平來看，添加WGP后，3種抗氧化酶的蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組。這說明WGP沒有從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控抗氧化酶的表達(dá)，而是加強(qiáng)了翻譯過程，從而增加機(jī)體抗氧化酶的量。核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是機(jī)體的一個(gè)重要調(diào)控因子，參與多條信號(hào)通路，其中Nrf2-Keap1-ARE信號(hào)通路是機(jī)體最主要的抗氧化信號(hào)通路[35-36]，該通路能夠調(diào)控基底可誘導(dǎo)性解毒酶、抗氧化酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其他一些抗應(yīng)激酶類及蛋白質(zhì)的表達(dá)，與抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤及細(xì)胞保護(hù)密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞受到氧化性刺激時(shí)，Nrf2被激活，調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)。研究表明，葡萄原花青素可以誘導(dǎo)Nrf2及抗氧化反應(yīng)元件(ARE)蛋白表達(dá)增加，通過p38-PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)[37]，而白藜蘆醇則通過激活Nrf2進(jìn)而激活Nrf2/ARE抗氧化信號(hào)通路[38]。在本研究中，Nrf2無論是在轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平都未出現(xiàn)顯著差異，說明WGP沒有改變Nrf2的量，可能是通過磷酸化激活后調(diào)控靶基因表達(dá)的。

在生物機(jī)體代謝中，酶的活性一定時(shí)，酶數(shù)量越多，代謝速率會(huì)越高。然而，酶數(shù)量與活力之間是否存在著某種關(guān)系，目前尚無定論。研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼料中添加女貞子原粉有效提高了雞肉抗氧化酶活性和總抗氧化水平，同時(shí)檢測(cè)到GPx4基因的相對(duì)表達(dá)量顯著提高[39]。但M. Koziorowska-Gilun等報(bào)道，在性腺器官中Cu-ZnSOD活性與其表達(dá)量并不是呈正相關(guān)[40]。在本研究中，隨著WGP添加水平的變化，Western blot檢測(cè)到的抗氧化酶信號(hào)強(qiáng)度與其活性表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，表明二者之間可能存在某種關(guān)系。是否同植物機(jī)體類似[41]，組織中抗氧化酶的代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)了酶表達(dá)的增高，還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

4.1 與自由活動(dòng)組相比，單欄組綿羊睪丸組織中MDA及ROS水平升高(P<0.01)，表明單欄飼養(yǎng)對(duì)綿羊造成了氧化應(yīng)激，即模型建立成功。

4.2 單欄飼養(yǎng)方式下，綿羊睪丸重量顯著降低(P<0.05)，睪丸系數(shù)也表現(xiàn)出下降趨勢(shì)(P=0.06)，附睪精子密度顯著降低(P<0.05)，精子活力極顯著降低(P<0.01)，表明單欄飼養(yǎng)方式會(huì)在一定程度上影響綿羊繁殖性能；添加WGP后，綿羊附睪精子密度和精子活力均顯著升高(P<0.05)，表明日糧中適量添加WGP有利于提高綿羊的繁殖性能。

4.3 添加WGP后，綿羊睪丸組織MDA含量顯著下降(P<0.01)，SOD、CAT及GSH-Px活性均顯著提高(P<0.01，P<0.01，P<0.05)；適量添加WGP后，睪丸組織Cu-ZnSODmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，Cu-ZnSOD、CAT、GPx4蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)。

綜上表明，WGP可以提高單欄飼養(yǎng)方式下綿羊睪丸組織抗氧化性，進(jìn)而改善綿羊繁殖性能。

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(編輯 程金華)

Effect of Dietary Wine Grape Pomace on Reproductive Performance,Antioxidant Ability of Testis in Ram

JIN Ya-qian1, LIU Wen-zhong1, ZHAO Jun-xing1, REN You-she1, ZHANG Chun-xiang1,ZHANG Wen-jia2, XIANG Bin-wei2, MA Xue-hao1, ZHANG Jian-xin1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.AnimalHusbandryBureauofYouyuCounty,Youyu037200,China)

This experiment was conducted to investigate the effect of wine grape pomace supplementation to base diet on reproductive performance and antioxidant ability of testis in ram. A total of thirty 5-month-old with average weight of (25±1) kg Dorper (♂) × Small Tail Han sheep (♀) F1 male lambs were randomly selected and divided into 5 groups equally. To establish a stress model, lambs in one of groups were raised freely, while the other 4 groups were confined in stall. Lambs raised freely were fed with a base diet without grape pomace, and other lambs were fed with diets supplemented with grape pomace at 0%, 5%, 10%, 20%, respectively. The experiment lasted for 80 d. At the end of experiment, all lambs were slaughtered and sampled. Testis coefficient, epididymal sperm indicators, antioxidant levels of testis were analyzed, and moreover, expression ofCu/ZnSOD,CAT,GPx4,Nrf2 mRNA and protein in testis were detected. The results showed that, compared with free group, MDA and ROS level of testis significantly increased (P<0.01), testis weight of lambs significantly decreased (P<0.05), and the organ coefficient of testis had a trend to be lower (P=0.06) in confined group with 0% wine grape pomace; epididymal sperm density, acrosomal integrity and motility were lower (P<0.05 andP<0.01, respectively), while epididymal sperm deformity higher (P<0.01), in confined group with 0% wine grape pomace than those in free group. These results showed that ram raised in confined condition could cause oxidative stress and affect the reproductive performance. However, compared with confined group with 0% wine grape pomace, epididymal sperm density and motility were higher, while deformity lower, in wine grape pomace-added groups (P<0.05). MDA level of testis significantly decreased (P<0.01), but SOD, CAT and GSH-Px activity significantly increased (P<0.01,P<0.05 andP<0.01) in wine grape pomace-added groups. Furthermore, the mRNA expression ofCu-ZnSODand protein expression of Cu-ZnSOD, GPx4 and CAT in testis significantly increased (P<0.05) in wine grape pomace-added groups. The results indicate that wine grape pomace can enhance antioxidant capacity in testis and improve the reproductive performance of separated-raising lambs.

separated raising; wine grape pomace; ram; testis; reproductive performance; antioxidant ability

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.11.010

2016-05-12

國家現(xiàn)代肉羊技術(shù)體系專項(xiàng)(CARS-39)

金亞倩(1990-)，女，山西曲沃人，碩士，主要從事動(dòng)物繁殖生物技術(shù)研究，E-mail：jinyq2009@163.com

*通信作者：張建新，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事飼料資源開發(fā)與利用研究，E-mail：ypzjx@126.com

S826.2

A

0366-6964(2016)11-2228-12