艾東旭,徐宏偉，李 瑋,張 晶,宋顯明,李蓮瑞

(1. 塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300; 2. 新疆兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300; 3.塔里木大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300)

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新疆多浪羊IFN-γ基因地高辛探針的標(biāo)記與敏感性檢測

艾東旭1,徐宏偉1，李 瑋1,張 晶1,宋顯明1,李蓮瑞2,3

(1. 塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300; 2. 新疆兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300; 3.塔里木大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300)

為獲得多浪羊IFN-γ地高辛探針，并對其標(biāo)記效率進(jìn)行檢測。將多浪羊pMD-18T-IFN-γ克隆菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)切膠回收及目的基因濃縮后獲得目的基因IFN-γ，然后用地高辛標(biāo)記和檢測試劑盒對IFN-γ基因進(jìn)行標(biāo)記，獲得IFN-γ地高辛探針。IFN-γ的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8 g/L瓊脂糖電泳分離后轉(zhuǎn)移至Hybond N+膜，膜上顯影后進(jìn)行敏感性檢測并計算探針質(zhì)量濃度，結(jié)果顯示，IFN-γ地高辛探針在雜交液中的質(zhì)量濃度為30 μg/L。Southern雜交顯示，Hybond N+膜上有IFN-γ基因的雙鏈DNA，且濃縮后的DNA(2.5 μg)標(biāo)記的特異性探針質(zhì)量濃度較高，可以在Hybond N+膜上呈現(xiàn)出清晰的雜交條帶，證明獲得的探針質(zhì)量濃度符合要求。

多浪羊；IFN-γ基因；地高辛；探針標(biāo)記；檢測

多浪羊主要分布在新疆喀什的麥蓋提、岳普湖、巴楚、莎車等縣，因其中心產(chǎn)區(qū)在麥蓋提縣，故又稱麥蓋提羊。其具有個體大、耐干旱、耐低營養(yǎng)水平以及抗逆、抗病、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)良性狀，且肉質(zhì)鮮嫩多汁、肉色澤純正，營養(yǎng)價值高，是一個優(yōu)良肉脂兼用型綿羊品種[1]。

干擾素(inerferon，IFN)是發(fā)現(xiàn)最早，也是第一個被克隆化并用于臨床疾病治療的細(xì)胞因子，因其基因和蛋白的結(jié)構(gòu)、功能特性不同，被分為3類：Ⅰ型干擾素包括IFN-α(包括多個亞型)、IFN-β等；Ⅱ型干擾素為干擾素-γ(IFN-γ)；Ⅲ型是基因結(jié)構(gòu)含有內(nèi)含子的IFN-λ。IFN-γ是水溶性二聚體細(xì)胞因子，是Ⅱ型干擾素的唯一成員，主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌產(chǎn)生[2]，在免疫反應(yīng)的后期發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用[3]，是多浪羊體內(nèi)一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，對病毒等有害物質(zhì)的感染有抵抗作用，具有抗腫瘤[4]、抗病毒、抗寄生蟲等生物學(xué)功能。

由于細(xì)菌、病毒等有害物質(zhì)的侵襲，導(dǎo)致動物機(jī)體免疫功能受到抑制[5]。IFN-γ在疾病診斷、治療和疫苗免疫效果[6]檢測等方面有重要作用，因此，本研究采用地高辛試劑盒標(biāo)記IFN-γ基因探針，對IFN-γ基因地高辛探針進(jìn)行標(biāo)記并對其敏感性進(jìn)行檢測，以期為后續(xù)研究新疆多浪羊分子免疫奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

多浪羊pMD-18T-IFN-γ[7]克隆菌由新疆兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點實驗室保存；T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；地高辛試劑盒、Hybond N+膜均購自羅氏公司；DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司；其他試劑均由國產(chǎn)分析純配制。

1.2 方 法

1.2.1IFN-γ基因的制備與擴(kuò)增 制備：取100 μL pMD-18-T-IFN-γ[7]克隆菌接種至LB broth液體培養(yǎng)基(Amp+)，氣浴，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)8 h。擴(kuò)增：將各組份溶液加至PCR管，反應(yīng)體系見表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，50.5 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s， 30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存，備用。

表1 PCR反應(yīng)體系

1.2.2IFN-γ基因切膠回收 將PCR產(chǎn)物經(jīng)8 g/L 瓊脂糖凝膠電泳分離后，紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠于1.5 mL離心管。計算凝膠質(zhì)量(提前記錄1.5 mL離心管質(zhì)量)，將該質(zhì)量作為1個凝膠體積(按照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說明書，100 mg記為100 μL)。再按照切膠回收試劑盒的操作步驟進(jìn)行目的DNA的洗脫。

1.2.3IFN-γ目的基因濃縮 在PCR回收產(chǎn)物中加入3 μL 3.0 mol/L乙酸鈉充分混勻，再加入總體積(3.0 mol/L乙酸鈉和PCR回收產(chǎn)物體積之和)2.5倍的無水乙醇，充分混勻，-20 ℃沉淀過夜。

4 ℃、12 000 r/min離心30 min，棄上清留沉淀；取600μL 經(jīng)-20 ℃預(yù)冷的φ=70% 乙醇洗滌沉淀，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，棄上清留沉淀；重復(fù)洗滌3次后置于無菌操作臺干燥10 min，加入16 μL PCR H2O溶解沉淀，充分溶解后取1 μL測定核酸質(zhì)量濃度。

1.2.4IFN-γDNA質(zhì)量濃度測定 按下“7/dsDNA”鍵，將50 μL 1×TE加至比色皿，按下“blank”鍵調(diào)零，作為空白對照；用蒸餾水多次沖洗比色皿；加入1 μL濃縮后的IFN-γ基因和39 μL 1×TE緩沖液，充分混勻，按下“sample”鍵，記錄讀數(shù)。

1.2.5 地高辛標(biāo)記IFN-γ探針 取10 μL經(jīng)核酸蛋白儀測定的IFN-γ(0.25 g/L)，加入5 μL PCR H2O，混勻，沸水浴變性10 min，迅速冰浴冷卻5 min；冰浴中加入2 μL六聚核苷酸混合物、2 μL dNTP混合物、1 μL Klenow酶，混勻，離心數(shù)秒，37 ℃孵育20 h，65 ℃保持10 min終止反應(yīng)。

根據(jù)地高辛試劑盒說明書計算孵育20 h后地高辛標(biāo)記的DNA產(chǎn)量，根據(jù)表2可以計算模板DNA產(chǎn)量，原則上模板DNA量為10～3 000 ng 均可以被標(biāo)記。

表2 適宜條件下地高辛標(biāo)記DNA的產(chǎn)量

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中均以1 000 ng DNA為模板。1 h內(nèi)，大約有15%的核苷酸參與到0.8 μg新合成的地高辛標(biāo)記DNA；20 h后約消耗38%的核苷酸。

使用DIG-High-Prime溶液，增加不同模板DNA的量進(jìn)行反應(yīng)，并檢測反應(yīng)1 h和反應(yīng)20 h時的差異。地高辛標(biāo)記DNA的產(chǎn)量由放射線示蹤器進(jìn)行測定，并通過斑點雜交進(jìn)行證實 (10個獨立標(biāo)記實驗的平均值)。

1.2.6IFN-γ標(biāo)記DNA質(zhì)量濃度的確定 地高辛標(biāo)記DNA質(zhì)量濃度直接影響試驗結(jié)果，通常情況下，標(biāo)記的探針和地高辛標(biāo)記的對照DNA質(zhì)量濃度均應(yīng)為1 mg/L。標(biāo)記的探針和地高辛標(biāo)記的對照DNA按照表3進(jìn)行一系列的梯度稀釋。

1.2.7IFN-γ探針的southern雜交 紫外燈下觀察電泳結(jié)果，記錄 DNA Marker位置，然后將無用部分及凝膠左上角切掉，作為指示凝膠方位標(biāo)記。蒸餾水淋洗凝膠，置于0.2 mol/L HCl溶液中搖動漂洗5 min。蒸餾水淋洗凝膠，浸于變性液(0.4 mol/L NaOH，0.6 mol/L NaCl)中室溫?fù)u動變性30 min。蒸餾水淋洗凝膠，浸于中和液[0.5 mol/L Tris-Cl(pH 7.4)，1.5 mol/L NaCl]中室溫?fù)u動中和30 min。將一玻璃板置于盛有10×SSC緩沖液(含3.0 mol/L NaCl和0.3 mol/L檸檬酸鈉，pH 7.0)的淺盤，上鋪一張Whatman 3 mm濾紙，濾紙邊緣浸于緩沖液，趕凈氣泡；凝膠背面朝上放于濾紙上，用保鮮膜做一個窗口，封住凝膠的四周，防止吸印短路；另取一張Whatman 3 mm濾紙，將其與尼龍膜用蒸餾水浸潤后置于10×SSC緩沖液，5 min后取出輕放于凝膠上；尼龍膜上再鋪一張Whatman 3 mm濾紙，并將吸水紙置于濾紙上，上方再壓一玻璃板及500 g左右物體，轉(zhuǎn)膜8 h，期間更換吸水紙14～16次。轉(zhuǎn)好的膜干燥30 min，于交聯(lián)儀中120 mJ保持30 s。

表3 探針的梯度稀釋

1.2.8 預(yù)雜交與雜交 預(yù)雜交：用ddH2O將Hybond N+尼龍膜預(yù)濕，再用5×SSC緩沖液預(yù)濕。將Hybond N+尼龍膜(轉(zhuǎn)膜面向液面)置于雜交管，加入68 ℃預(yù)熱的預(yù)雜交液10 mL，置于雜交爐中68 ℃預(yù)雜交至少2 h，回收預(yù)雜交液。

雜交：取地高辛(DIG)標(biāo)記的IFN-γ探針20 mL，沸水浴5 min，迅速冰浴冷卻，離心數(shù)秒后加至經(jīng)68 ℃預(yù)熱的標(biāo)準(zhǔn)雜交液(于50 mL離心管)，充分混勻后置于雜交爐，68 ℃雜交16 h。

洗膜：取Hybond N+尼龍膜，先用50 mL 2×SSC緩沖液、0.1 g/L SDS高鹽洗液(室溫)洗滌15 min，傾去洗液后再重復(fù)洗1次；然后用50 mL 0.1×SSC緩沖液、0.1 g/L SDS低鹽洗液在雜交爐中68 ℃洗滌15 min，傾去洗液后再重復(fù)洗1次。

1.2.9 免疫檢測 封閉：將Hybond N+尼龍膜從雜交管中取出，置于直徑150 mm平皿，用100 mL馬來酸洗液(含φ=3%吐溫-20)于室溫下洗膜5 min，將膜放入10 g/mL封閉液，置于水平搖床勻速晃動60 min(0.5 h換面1次)。

顯色：取100 g/L封閉液(含φ=0.1% Anti-DIG-AP復(fù)合物5 μL)50 mL，室溫孵育60 min(0.5 h換面1次)；再用100 mL馬來酸緩沖液室溫下洗膜2次，每次15 min；隨后將Hybond N+尼龍膜放入檢測緩沖液(AP Buffer)平衡5 min，然后置入新配制的顯色液中，室溫避光顯色16～24 h；取出Hybond N+尼龍膜用ddH2O沖洗2遍終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1IFN-γ基因的PCR擴(kuò)增、切膠回收及濃縮對比

IFN-γPCR產(chǎn)物經(jīng)8 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離后，在574 bp處可見目的條帶(圖1)。

圖1 IFN-γ基因PCR產(chǎn)物

將目的條帶切膠回收，經(jīng)8 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離后與DNA Marker DL2000比較，發(fā)現(xiàn)目的條帶大小(574 bp)與預(yù)期相吻合(圖2)；IFN-γ目的基因經(jīng)濃縮后，經(jīng)8 g/L瓊脂糖凝膠電泳后與DNA Marker DL2000比較，發(fā)現(xiàn)目的條帶大小(574 bp)與預(yù)期相吻合(圖3)，并且濃縮后的目的條帶比切膠回收的條帶清晰，DNA質(zhì)量濃度較高，便于后續(xù)的探針標(biāo)記。

圖2 IFN-γ基因切膠回收結(jié)果

圖3 IFN-γ基因濃縮

2.2 核酸質(zhì)量濃度測定

經(jīng)核酸蛋白儀測定，1 μL濃縮的IFN-γ基因與39 μL 1×TE緩沖液混勻后產(chǎn)物的質(zhì)量濃度為0.006 25 g/L，推測原IFN-γ的質(zhì)量濃度為0.25 g/L。

2.3IFN-γ地高辛探針標(biāo)記效率檢測結(jié)果分析

探針標(biāo)記效率檢測旨在確定最適探針質(zhì)量濃度及檢測探針的敏感性；探針質(zhì)量濃度過高(或過低)，會導(dǎo)致標(biāo)記效率過高(或過低)，不利于控制雜交時標(biāo)記探針的加入量。將地高辛Southern雜交試劑盒提供的地高辛標(biāo)記的對照DNA進(jìn)行稀釋，使其質(zhì)量濃度分別為10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0 μg/L。采用稀釋地高辛標(biāo)記的對照DNA的方法稀釋標(biāo)記探針，并將標(biāo)記的探針與對照組進(jìn)行對應(yīng)點比對(圖4)，結(jié)果顯示，地高辛標(biāo)記的對照DNA 5號條帶與IFN-γ地高辛探針的4號條帶相似，說明兩者信號強(qiáng)度接近，推測IFN-γ地高辛探針的質(zhì)量濃度約為0.3 μg/L。將IFN-γ地高辛探針質(zhì)量濃度乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，計算得出IFN-γ地高辛探針質(zhì)量濃度為15 mg/L。當(dāng)雜交液體積為10 mL時，需加入20 μLIFN-γ地高辛標(biāo)記探針。即IFN-γ地高辛探針在10 mL雜交液中的質(zhì)量濃度為30 μg/L，可以達(dá)到試驗所需質(zhì)量濃度。

圖4 IFN-γ地高辛探針標(biāo)記效率檢測

2.4 Southern雜交

將地高辛標(biāo)記的IFN-γ基因與Hybond N+膜上的DNA進(jìn)行特異性雜交。經(jīng)洗膜、封閉顯色后，在Hybond N+膜上出現(xiàn)清晰的雜交條帶(圖5)，說明，地高辛標(biāo)記的IFN-γ基因與Hybond N+膜上的DNA特異性結(jié)合，雜交成功。適宜探針質(zhì)量濃度較難掌握，若探針質(zhì)量濃度過高或者封閉時間過短，在Hybond N+膜上容易產(chǎn)生背影，而質(zhì)量濃度過低則容易導(dǎo)致信號減弱，因此，可根據(jù)顯影后的雜交效果對探針質(zhì)量濃度進(jìn)行微調(diào)，若背影值較高，可將雜交液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，信號比較低時，可再加入少量探針。雜交過程中，應(yīng)盡量控制雜交液體積，使其剛覆沒尼龍膜，因為雜交液體積過多會造成不必要的浪費(fèi)，而過少則會影響雜交效果。

圖5 IFN-γ地高辛探針Southern雜交

3 討 論

3.1 地高辛技術(shù)

地高辛標(biāo)記探針原位雜交技術(shù)是以地高辛配基為標(biāo)記物，通過非放射性檢測系統(tǒng)(如酶促或熒光等)，檢測組織、細(xì)胞及染色體上特異性DNA或RNA序列的一種技術(shù)[8]，是一種直接、簡便的研究基因定位與表達(dá)的方法[9]。地高辛標(biāo)記探針技術(shù)可用于鑒別特異基因的表達(dá)部位、分析基因轉(zhuǎn)錄的含量變化、確定有無病毒感染以及染色體圖譜分析等，在篩選重組克隆、基因多態(tài)性檢測等方面應(yīng)用廣泛[10]。孫小慧等[11]認(rèn)為，地高辛標(biāo)記DNA探針雜交方法適用于人狂犬病疫苗Vero細(xì)胞DNA殘留量的測定。

3.2 地高辛技術(shù)的優(yōu)點

地高辛標(biāo)記探針，克服同位素探針受半衰期限制、曝光時間長、背景結(jié)構(gòu)欠清晰、污物處理困難等缺點，也避免內(nèi)源性生物素對研究結(jié)果的干擾，具有操作方便、檢測時間短[11]、結(jié)構(gòu)清晰、不受抗原抗體干擾的限制、探針靈敏度高[12]、結(jié)果便于肉眼分辨、無半衰期、雜交液可重復(fù)使用3～5次、保存1 a仍有活性、不會對環(huán)境和人造成危害等優(yōu)點，是目前常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)[13]。

3.3 地高辛技術(shù)的應(yīng)用

本研究結(jié)合杜衛(wèi)東等[8]、孫小慧等[11]、黃相紅等[13]的研究結(jié)果，成功構(gòu)建細(xì)胞因子IFN-γ地高辛探針，并對其標(biāo)記效率進(jìn)行檢測，為多浪羊免疫學(xué)研究另辟新徑。本研究發(fā)現(xiàn)，通過標(biāo)記效率檢測時，雜交時間必須嚴(yán)格控制在16 h內(nèi)；顯色時間在14 h可出現(xiàn)雜交斑點；轉(zhuǎn)膜必須充分，從而保證DNA已轉(zhuǎn)至膜上；雜交混合物中探針質(zhì)量濃度過高或封閉時間不足容易產(chǎn)生背景，而質(zhì)量濃度過低則易使信號變?nèi)酰幌茨r，如果洗膜不充分會導(dǎo)致背景太深，洗膜過度又可能導(dǎo)致假陰性。

4 結(jié) 論

IFN-γ地高辛探針標(biāo)記表明，探針質(zhì)量濃度對研究結(jié)果影響明顯。本研究標(biāo)記的IFN-γ地高辛探針在10 mL雜交液中的質(zhì)量濃度為30 μg/L，可達(dá)到試驗所需質(zhì)量濃度。

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(責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Digoxin Probe Labeling and Sensitivity Detection ofIFN-γGene in Xinjiang Duolang Sheep

AI Dongxu1,XU Hongwei1,LI Wei1,ZHANG Jing1,SONG Xianming1and LI Lianrui2,3

(1.College of Life Science,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China; 2.Key Laboratory of Tarim Husbandry Science and Technology,Xinjiang Production & Construction Group,Alar Xinjiang 843300,China;3.College of Animal Science,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China)

In order to obtain Duolang sheepIFN-γdigoxin probe,and detecting its labeling efficiency,the pMD-18T-IFN-γ colonies of Duolang sheep was amplified by PCR. After cutting and recovering the gel and concentrating of target gene,the final desiredIFN-γwas obtained,and then theIFN-γgene was labeled by digoxin and detection kit and theIFN-γdigoxin probe was obtained. TheIFN-γPCR product was isolated by 8 g/L agarose gel electrophoresis,and then transferred to Hybond N+membrane,after the membrane developing perform,sensitivity was detected and the probe mass concentration was calculated. The results showed that the mass concentration probe was 30 μg/L in the hybridization solution. The southern hybridization indicated that there is the double-stranded DNAIFN-γgene of Hybond N+membrane,and higher concentration of labeled specific probe was detected from mass concentrated DNA (2.5 μg),there was a clear hybridizing band in Hybond N+membrane,which proved that the probe mass concentration was up to standard mass concentrations.

Duolang sheep;IFN-γgene; Digoxin; Labeled DNA probe; Detection

AI Dongxu,male,master student. Research area: the pathogen and immunology of animal. E-mail: xuxude0718@163.com

LI Lianrui,female,doctoral student,master supervisor. Research area: the pathogen and immunology of animal. E-mail: lilianrui51@163.com

2016-01-22

2016-03-30

國家自然科學(xué)基金(30960277)；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)應(yīng)用基礎(chǔ)研究(2007JC07)；塔里木大學(xué)校長基金(TDZKCX201401)。

艾東旭，男，在讀碩士，研究方向為畜禽病原及免疫學(xué)。E-mail:xuxude0718@163.com

李蓮瑞，女，博士研究生，碩士生導(dǎo)師，研究方向為畜禽病原及免疫學(xué)。E-mail:lilianrui51@163.com

日期：2016-10-20

S826

A

1004-1389(2016)10-1436-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161020.1653.002.html

Received 2016-01-22 Returned 2016-03-30

Foundation item The National Natural Science Foundation of China (No.30960277);the Applied Basic Research Projects of Xinjiang Production and Construction Corps (No.2007JC07);the Headmaster Fund of Tarim University.