張 晶，黃士文，徐紹清，田 方，倪 穗*

(1.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.慈溪市橫河鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)辦公室，浙江 慈溪315318；3.慈溪市農(nóng)業(yè)局，浙江 慈溪 315318；3.寧波市缸鴨狗健康食品與生物技術(shù)研究所，浙江 寧波 315205)

?

辣蓼總黃酮超聲波輔助提取條件優(yōu)化研究

張 晶1，黃士文2，徐紹清3，田 方4，倪 穗1*

(1.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.慈溪市橫河鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)辦公室，浙江 慈溪315318；3.慈溪市農(nóng)業(yè)局，浙江 慈溪 315318；3.寧波市缸鴨狗健康食品與生物技術(shù)研究所，浙江 寧波 315205)

目的：優(yōu)化超聲波輔助法提取辣蓼黃酮類化合物的工藝條件。方法：實(shí)驗(yàn)從超聲溫度、料液比、乙醇濃度和超聲時(shí)間四個(gè)方面對(duì)黃酮類化合物的提取效果進(jìn)行了探討，通過單因素試驗(yàn)確定提取黃酮類化合物的較優(yōu)水平，再結(jié)合正交試驗(yàn)確定辣蓼全草中黃酮類化合物的最優(yōu)提取工藝。結(jié)果和結(jié)論：經(jīng)研究所得工藝的最佳參數(shù)為：乙醇濃度60%，料液比1∶45，超聲溫度50 ℃，提取時(shí)間50 min。在此工藝條件下得到黃酮類化合物含量為55.8 mg/g。由此證明辣蓼中黃酮類化合物能夠利用超聲波輔助法來方便有效地提取。

辣蓼；黃酮類化合物；超聲波；提取工藝

辣蓼，又名水蓼(PolygonumhydropoperL.)，是蓼科(Polygonum)蓼屬(PolygonumL.)一年生草本植物，直立或下部伏地，有須根，葉呈卵圓形或披針形，互生[1]。辣蓼主要分布在東南亞地區(qū)，生長在水邊潮濕的地方[2]，在我國各地均有分布，而浙江全省分布的較為廣泛，野生資源豐富。辣蓼全草味辛，中國及東南亞等許多國家已把辣蓼列入到食品添加劑中，它可以用來增加食物的風(fēng)味。辣蓼還是我國傳統(tǒng)的藥材，許多古醫(yī)書中對(duì)其藥理功能都有過記載，具有化濕、行滯、祛風(fēng)、消腫的功效[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，辣蓼有抑菌、消炎、抗病毒、抗氧化、抑腫瘤、鎮(zhèn)痛止血等功效，黃酮類化合物是其主要的生物活性成分[4-6]。黃酮類化合物有強(qiáng)抗氧化活性，清除人體內(nèi)部自由基，被廣為研究和應(yīng)用[7]。Haragehi[8]等研究發(fā)現(xiàn)辣蓼葉的水溶性組分中具有黃酮苷和黃酮苷元類物質(zhì)，主要成分為異槲皮苷，槲皮素，7,4-二甲基榭皮素，和3-甲基槲皮素；Zhao[9]等從辣蓼葉中分離鑒定出10中黃酮類化合物，其中6種為黃酮醇類化合物，4種為黃酮苷類化合物，經(jīng)電子自旋共振譜技術(shù)(ESR)和UV-Vis 分析法鑒定出這10種物質(zhì)含有較強(qiáng)的抗氧化結(jié)構(gòu)，經(jīng)抗氧化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2''-O-(3,4,5-三羥基苯酚) 槲皮苷抗氧化能力最強(qiáng)。Chan[10]等對(duì)東南亞藥用植物抑菌活性和抗氧化活性進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，辣蓼的水煮液具有強(qiáng)抗氧化性。林燕文[11]對(duì)2種蓼科植物進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，探究發(fā)現(xiàn)辣蓼水煮液對(duì)革蘭氏陽性菌(枯草芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌)、革蘭氏陰性菌(大腸埃希菌)均有不同的抑制效果，對(duì)黑曲霉、青霉、釀酒酵母這些真菌沒有抑制效果。

近年來關(guān)于辣蓼中黃酮的提取研究漸有報(bào)道，主要提取方法有回流浸提法、超聲波和微波提取法[12-15]。傳統(tǒng)的回流提取法耗時(shí)長，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，超聲波技術(shù)提取天然產(chǎn)物中的黃酮類化合物是目前應(yīng)用最為廣泛的一種新方法，超聲波提取辣蓼中黃酮的研究報(bào)道較少。本研究旨在應(yīng)用超聲波輔助法對(duì)辣蓼黃酮的提取進(jìn)行工藝優(yōu)化，對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)辣蓼中黃酮類化合物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

辣蓼：于2014年10月采自浙江寧波慈溪市楊梅村，洗凈，自然晾干，粉碎，過40目篩，保存于-20℃中。

試劑：蘆丁(Rutinu) 購買于上海源葉生物科技有限公；亞硝酸鈉(NaNO2)，硝酸鋁[Al(NO3)3]，氫氧化鈉(NaOH)，乙醇等均為分析純。

儀器：高速中藥粉碎機(jī)；超聲波清洗儀：寧波新芝 SB-5200；紫外分光光度計(jì)：北京普析tu-1810；分析天平：梅特勒多利多AM104，臺(tái)式離心機(jī)：湘儀 L600。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁為標(biāo)樣采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測(cè)定黃酮化合物[15-17]。精密稱取稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，精確到0.000 1g，加入一定量的乙醇溶液，置于水浴鍋中微熱使其溶解，冷卻后用60%的乙醇水溶液定容至50 mL，搖勻，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2 mg/mL)，備用。

準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL容量瓶中，在避光條件下，加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min后加入10% 的Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min， 最后加入4.0 mL 1 mol/L 的NaOH 溶液，用60%的乙醇溶液補(bǔ)齊至刻線，搖勻。于避光處靜置15 min，在510nm下測(cè)定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

采用超聲波輔助法對(duì)辣蓼中黃酮類化合物進(jìn)行提取，研究不同超聲溫度、料液比、乙醇濃度、超聲時(shí)間4個(gè)因素對(duì)黃酮類化合物提取效果的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)所用的四個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以確定超聲波輔助法的最佳工藝條件。

1.2.4 乙醇浸提法

在最佳超聲條件下，不采用超聲波輔助技術(shù)，用乙醇直接浸提。以確定超聲波輔助法的優(yōu)勢(shì)。

1.2.5 超聲波法提取辣蓼中總黃酮及含量測(cè)定

1) 工藝流程

辣蓼粉末→按照一定的料液比加溶劑浸潤→在一定條件下超聲處理→離心過濾→定容→樣品測(cè)定

2) 辣蓼黃酮的提取與測(cè)定方法

準(zhǔn)確稱取3.0 g辣蓼粉末，于150 mL錐形瓶中，按照一定的料液比加入乙醇溶液，在一定條件下進(jìn)行超聲波輔助提取，提取液經(jīng)離心過濾，將濾液轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中，定容，靜置得待測(cè)液。準(zhǔn)確吸取1.0 mL待測(cè)液于10 mL容量瓶中，按照1.2.1繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線過程中，化學(xué)試劑的加入方法，在510 nm處定其吸光度，每組重復(fù)3次提取實(shí)驗(yàn)。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得提取液中黃酮類化合物含量。

黃酮計(jì)算公式：黃酮類化合物含量(mg/g)=nCV/(m×1000)

式中：C—從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的蘆丁的濃度(mg/L)；

n—提取液的稀釋倍數(shù)；

V—提取液體積(mL)；

m—樣品質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，由圖1可以看出R2達(dá)到0.999 5，說明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果精確度高，在實(shí)驗(yàn)室條件下得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線是準(zhǔn)確可信的。

圖1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)黃酮提取的影響

按照1.2.5的試驗(yàn)方法，選擇不同的料液比(1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50)，在超聲溫度為30 ℃，乙醇濃度為60%，超聲30 min的條件下，對(duì)比黃酮類化合物提取效果，以選取合適的料液比。

圖2 料液比對(duì)提取黃酮提取的影響

如圖2所示，隨著料液比的增大，黃酮提取率增加，當(dāng)料液比為1∶50時(shí)，辣蓼中黃酮提取最充分。從圖2可見，在料液比1∶30～1∶50范圍內(nèi)，黃酮的提取量增加緩慢，但料液比過大，增大溶劑用量的同時(shí)，在生產(chǎn)上還會(huì)影響黃酮提取液的濃縮。因此，采用1∶40的料液比比較合理。

2.2.2 乙醇濃度對(duì)黃酮提取的影響

按照1.2.5的試驗(yàn)方法，選擇不同的乙醇濃度(20%，40%，60%，80%，100%)在料液比為1∶20，超聲溫度為30 ℃，超聲30 min的條件下，對(duì)比黃酮類化合物提取效果，以選取合適的乙醇濃度。

由圖3可知，隨著乙醇濃度的升高，辣蓼黃酮的提取量增加，但當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%后，其提取量不增反降?？赡苁请S著乙醇濃度增加，提取液中一些色素等醇溶性成分增多，干擾黃酮類物質(zhì)的檢測(cè)，或與乙醇反應(yīng)應(yīng)，從而導(dǎo)致黃酮類化合物提取效果下降[18-19]。故，60%的乙醇作為溶劑最為合適。

圖3 乙醇濃度對(duì)提取黃酮提取的影響

2.2.3 超聲溫度對(duì)黃酮提取的影響

按照1.2.5的試驗(yàn)方法，選擇不同的超聲溫度(20 ℃，30 ℃，40 ℃，50℃，60 ℃)，在料液比為1∶20，乙醇濃度為60%，超聲30 min的條件下，對(duì)比黃酮類化合物提取效果，選取合適的溫度。

圖4 超聲溫度對(duì)提取黃酮提取的影響

由圖4可見，提取溫度的升高，導(dǎo)致黃酮提取量先增加后減少，在50 ℃時(shí)黃酮類物質(zhì)量最高，超過50 ℃時(shí)，黃酮類物質(zhì)含量反而降低，這可能是由于，溫度過高會(huì)破壞一些黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，并且溫度升高，一些醇溶性雜質(zhì)成分增加，從而影響黃酮類物質(zhì)的提取[19]。所以提取溫度在50 ℃為最適。

2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取的影響

按照1.2.5的試驗(yàn)方法，選擇不同的超聲時(shí)間(20 ℃，30 ℃，40 ℃，50 ℃，60 ℃)，在料液比為1∶20，乙醇濃度為60%，超聲溫度為30 ℃的條件下，對(duì)比黃酮類化合物提取效果，以選取合適的超聲時(shí)間。

由圖5可知，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，提取越久，辣蓼黃酮類物質(zhì)的量越多。但超過50 min后，黃酮類物質(zhì)的提取量有所下降?？赡苁且恍S酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，時(shí)間久被破壞，加之有溶出雜質(zhì)，對(duì)黃酮類物質(zhì)的量有影響[19-20]。因此，最佳提取時(shí)間應(yīng)為50 min。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)提取黃酮提取的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)乙醇濃度、料液比、超聲溫度和時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。正交因素水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析表

由表2可知，選擇各因子在同一水平下的平均試驗(yàn)指標(biāo)之和k最高的為最優(yōu)水平，得出超聲波對(duì)提取辣蓼中黃酮類化合物效果的影響從大小依次為：C>A>D>B。最佳條件是：乙醇濃度60%，料液比1∶45，超聲溫度50 ℃，提取時(shí)間50 min。即提取工藝組合A2B3C2D2。

由方差分析表3可知，3個(gè)因素，即超聲溫度乙醇濃度和超聲時(shí)間達(dá)到極顯著水平(P<0.001)料液比對(duì)水平不顯著(P=0.182)，說明超聲溫度，乙醇濃度和超聲時(shí)間3個(gè)因素對(duì)辣蓼黃酮類化合物的提取有顯著影響，料液比對(duì)黃銅類化合物的影響不顯著，因此在考慮經(jīng)濟(jì)的條件下，可以選擇1∶35的料液比。由表4可知在超聲溫度、乙醇濃度、超聲時(shí)間各水平之間存在顯著差異，在料液比因素中，B2和B3之間差異不顯著。

表3 方差分析表

表4 正交試驗(yàn)Duncanny's多重比較

注：大寫字母不同表示水平之間存在顯著差異，相同則表示水平之間差異不顯著。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

由上述正交試驗(yàn)結(jié)果可知， A2B3C2D2組合為最優(yōu)，按照最優(yōu)組合，進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)。

表5 辣蓼中黃酮提取試結(jié)果驗(yàn)證

由表5可知，在A2B3C2D2組合的條件下，黃酮含量平均為55.8 mg/g。

2.5 乙醇浸提試驗(yàn)

在上述正交試驗(yàn)得出最佳A2B3C2D2組合下，不采用超聲波輔助，直接進(jìn)行浸提，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

表6 乙醇浸提法黃酮含量

由表6可知在常規(guī)的乙醇浸提條件下，黃酮類化合物的含量為28.4 mg/g。

3 討 論

(1)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的結(jié)果表明，超聲波輔助法對(duì)提取辣蓼黃酮類化合物影響大小為：乙醇濃度>超聲溫度> 料液比>超聲時(shí)間。提取的最佳超聲條件是：乙醇濃度為60%，料液比為1∶45，提取時(shí)間為50 min，超聲溫度為50℃。在此工藝條件下可提取得到黃酮類化合物的含量為55.8 mg/g。

(2)超聲波輔助法得到的黃酮類化合物的含量，是相同條件下乙醇浸提法含量的2倍。比王振堂等[12]用乙醇回流法得到46.4 mg/g蓼實(shí)總黃酮和楊家凱等[20]采用高速勻漿法得47.5 mg/g辣蓼總黃酮要高。這與蔡玲等[15]利用超聲波法得到水蓼中的總黃酮的量為38.2 mg/g,并高于傳統(tǒng)回流法的提取率。并且本試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)優(yōu)化了超聲波輔助提取辣蓼黃酮類化合物的工藝條件。

采用超聲波輔助法可以有效提取辣蓼中黃酮類化合物，并且具有高效、環(huán)保、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)，可以用于后續(xù)辣蓼中黃酮類化合物的應(yīng)用及研究中。

[1] 《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編：上冊(cè)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1976:896-897.

[2] KOK P T, HSAUN K, AVADHANI, P N. A Guide to Common Vegetables[M]//Singapore Science Center, 1991:124.

[3] 曾維愛,譚濟(jì)才,譚琳,等.辣蓼的應(yīng)用及其功效[J].中國農(nóng)學(xué)報(bào),2006,22(8):369-372.

[4] 許瑞波,周洪英,陳林，等. 地瓜葉總黃酮的超聲輔助提取及生物活性研究[J].食品科學(xué),2013,41(3):141-146.

[5] 鞏忠福,楊國林,嚴(yán)作廷,等．蓼屬植物的化學(xué)成分與藥理學(xué)活性研究進(jìn)展[J].中草藥,2002,33(1):82-84.

[6] 沈冰冰,王敏,羅娟,等.蓼屬藥用植物的化學(xué)成分及其藥理活性研究進(jìn)展[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2015,35(7):63-70.

[7] BORS W, HELLER W, MICHEL C, et al. Flavonoids and polyphenols: chemistry and biology[M]∥Cadenas E, Paker L. Handbook of Antioxidants; New York:Marcel Dekker Inc, 1996:409-466.

[8] HARAGUCHI H, HASHIMOTO K, YAGI A. Antioxidative substances in leavesof Polygonum hydropiper[J]. Agri Food Chemistry, 1992,40:1349 -1351．

[9] ZHAO F P, DIETER S, ALFRED B, et al. Antioxidant flavonoids from leaves of Polygonum hydropiper L[J]. Phytochemistry, 2003,62 :219-228.

[10] LAI W C H, CHEAH E L C, SAW C L L, et al. Antimicrobial and antioxidant activities of Cortex Magnoliae Officinalis and some other medicinal plants commonly used in South-East Asia[J]. Chinese Medicine, 2008, 3:15.

[11] 林燕文. 2種蓼科植物體外抑菌試驗(yàn)研究[J].微生物學(xué)雜志, 2011,31(3):102-105.

[12] 王振堂,肖連生,唐瑞仁,等. 蓼實(shí)中總黃酮最佳提取工藝的研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2005,16(4):328-329.

[13] 張國英, 曾韜. 辣蓼主要化學(xué)成分的研究[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2005,25(3):22-24.

[14] 蔡玲,陳曉青,余俊,等. 微波法提取水蓼中總黃酮的工藝研究[J].廣州化學(xué),2007,32(4):26-29.

[15] 蔡玲,李愛陽. 超聲法提取水蓼中總黃酮的工藝研究[J]. 中成藥,2008,30(10):5-7(附).

[16] 柴建新，萬茵，付桂明，等. 杜仲葉總黃酮含量測(cè)定方法優(yōu)化[J]. 中 國 食 品 學(xué) 報(bào),2013，13(4):225-230.

[17] 謝建華,胡小華,李志明,等. 超聲波提取蘆筍皮中黃酮類化合物及其抗氧化活性的研究[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,37(1):92-98.

[18] 謝建華.蘆筍皮中黃酮類化合物的提取工藝及抗氧化性能的研究[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2009:25-26.

[19] 林珊,林梅芳,吳嬌瑜，等.竹筍殼黃酮類化合物的提取及抗氧化活性的研究[J].應(yīng)用化工,2012,41(3):465-468.

[20] 楊家楷, 楊新周, 李學(xué)嬌. 高速勻漿法提取辣蓼莖中總黃酮[J]. 云南化工，2014,41(6):23-25.

Ultrasonic Technology for Extracting Flavonoids fromPolygonumhydropoper

Zhang Jing1, Huang Shiwen, Xu Shaoqing3, Tian Fang4, Ni Sui1*

(1. School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. Cixi Agricultural office of Henghe, Cixi 315318, China; 3. Cixi Forestry Technology Extension Centre of Zhejiang, Cixi 315300,China; 4. Research Institute of Gang Yagou Healthy Food and Biotechnology, Ningbo 315205, China)

Flavonoids are one of the main active ingredients inPolygonumhydropoper. The ultrasonic extraction technology was studied to extract the flavonoid compounds from whole plant ofPolygonumhydropoper. The influence of extract time, solid-to-liquid ratio, ethanol concentration, and temperature were analyzed. The optimum levels were analyzed through single-factor test and orthogonal experiment. The optimum extraction technology was as follows: ethanol concentration 60%, solid-to-liquid ratio 1∶45, temperature 50 ℃, extraction time 50 min. Under these technological conditions, the content of the extraction was 55.8 mg/g. Ultrasonic extraction technology could facilitate the efficient extraction of total flavonoids fromPolygonumhydropoper.

Polygonumhydropoper; flavonoid compounds; ultrasonic; extraction technology

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.05.006

2016-03-28

寧波市科技富民項(xiàng)目(2015C10023)；慈溪市農(nóng)業(yè)局農(nóng)業(yè)科技項(xiàng)目(CN201417)。

張晶(1990—)，女，碩士研究生，研究方向:植物天然成分分析。E-mail:13857478403@163.com

R284.2

A

1006-9690(2016)05-0025-05

*通訊作者：倪穗，教授，研究方向:植物生物技術(shù)。