程雪蓮，王倩*，祁慶生，2

（1.山東大學(xué)國家糖工程技術(shù)研究中心，山東濟南250100；2.山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點實驗室，山東濟南250100）

pH及溶氧對重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的影響

程雪蓮1，王倩1*，祁慶生1，2

（1.山東大學(xué)國家糖工程技術(shù)研究中心，山東濟南250100；2.山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點實驗室，山東濟南250100）

以重組大腸桿菌DALA為實驗菌株，研究了該菌株在機械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐發(fā)酵過程中pH以及溶解氧對5-氨基乙酰丙酸（ALA）積累的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前期（0～27 h）pH保持為6.5；穩(wěn)定期后期（28～48 h），pH為6.0時有利于5-ALA的積累。其次，通過控制轉(zhuǎn)速與通氣量調(diào)節(jié)發(fā)酵液中的溶氧，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前期轉(zhuǎn)速為500 r/min，通氣量為2 vvm；穩(wěn)定期后期，轉(zhuǎn)速降低至250 r/min，通氣量減少為1 vvm，有利于重組菌DALA發(fā)酵生產(chǎn)5-ALA，在此條件下發(fā)酵5-ALA的產(chǎn)量可達到3.46 g/L。

重組大腸桿菌；5-氨基乙酰丙酸；溶解氧

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）是生物體內(nèi)的一種非蛋白質(zhì)氨基酸，其分子式為C5O3NH9，水溶液中易兩兩結(jié)合發(fā)生縮合反應(yīng)。ALA是吡咯化合物生物合成的重要中間產(chǎn)物，如維生素B12、血紅素及植物細胞中葉綠素的合成均需要ALA作為前體物質(zhì)。早期美國食品和藥物管理局已經(jīng)批準其可作為一種光動力學(xué)藥物，應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1]。此外ALA在農(nóng)業(yè)上可以作為一種有效的綠色農(nóng)藥-除草劑，還可以提高植物的抗逆性，提高農(nóng)作物產(chǎn)量[2]。

目前ALA的制備方法有化學(xué)法和生物發(fā)酵法[3]?；瘜W(xué)法生產(chǎn)ALA轉(zhuǎn)化率低、副產(chǎn)物毒性大、易污染環(huán)境。近年來科學(xué)工作者們致力于研究采用微生物生產(chǎn)ALA[4-5]。在自然界生物體內(nèi)，共有兩條ALA生成途徑。一條途徑為C4途徑[6-7]（或Shemin pathway），主要存在于細菌中的α變形菌門中。琥珀酰輔酶A和甘氨酸經(jīng)ALA合成酶催化反應(yīng)生成ALA。另一條途徑為C5途徑[8]（或Beale pathway），主要存在于植物、藻類、非α變形菌門的細菌以及古菌中，谷氨酸和相應(yīng)的轉(zhuǎn)移核糖核酸（transfer ribonucleic acid，tRNA）經(jīng)谷氨酰tRNA合成酶（glutamyl-tRNA synthetase GluRS），gltX基因編碼催化生成谷氨酰tRNA，谷氨酰tRNA在谷氨酰tRNA還原酶（glutamyl-tRNAreductaseHemA，基因hemA編碼）的催化下還原為谷氨酰-1-半醛（glutamate-1-semialdehyde GSA）。之后GSA被谷氨酰-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶（glutamate-1-semialdehyde2,1-aminomutaseHemL），由hemL基因編碼催化，轉(zhuǎn)化為ALA。

關(guān)于C5途徑產(chǎn)ALA的研究比較少，2011年，KANG Z等[9]將來自亞利桑那沙門氏菌（S.arizona）的hemA基因進行突變，使hemA基因可以更好地在宿主菌大腸桿菌DH5α中表達。將hemA基因與hemL基因共表達于大腸桿菌DH5α，同時在宿主體內(nèi)表達了RhtA轉(zhuǎn)運蛋白，得到重組大腸桿菌DALA。同年，KANG Z等[10]再次以大腸桿菌為宿主菌，同時表達C4途徑與C5途徑（見圖1），成功地構(gòu)建了兩條途徑同時合成ALA。2013年，LI F等[11]利用sRNA RyhB對大腸桿菌的血紅素合成途徑進行調(diào)控，提高了ALA的積累。

本實驗在之前實驗的基礎(chǔ)上對重組大腸桿菌DALA進行發(fā)酵優(yōu)化，進一步提高ALA產(chǎn)量。發(fā)酵過程中溫度、pH、溶解氧會影響菌體的生長狀況、各種關(guān)鍵酶的活性、產(chǎn)物的穩(wěn)定性、副產(chǎn)物生物積累等。合適的溫度、pH、溶解氧條件利于目標產(chǎn)物的積累[12-14]。在微生物體中，ALA是血紅素代謝途徑的中間產(chǎn)物，血紅素的發(fā)酵條件對其有一定的參考價值。血紅素的代謝與溶氧密切相關(guān)，而ALA在偏堿性環(huán)境中易發(fā)生兩兩聚合反應(yīng)，在酸性環(huán)境中比較穩(wěn)定。因此，本實驗的目的是通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐中發(fā)酵液pH以及控制轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)發(fā)酵液中溶解氧優(yōu)化發(fā)酵重組大腸桿菌DALA，探索合適的ALA生產(chǎn)條件。

圖1 5-氨基乙酰丙酸的C5生物合成途徑Fig.1 C5 biosynthetic pathway of 5-aminolevulinic acid

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

重組大腸桿菌DALA：由本實驗室構(gòu)建。

1.1.2 培養(yǎng)基與相關(guān)試劑

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L。

ALA發(fā)酵種子培養(yǎng)基：（NH4）2SO416.0 g/L、KH2PO43.0 g/L、Na2HPO4·12H2O 16.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、MnSO4·H2O 0.01 g/L、酵母粉5.0 g/L、葡萄糖20 g/L。

ALA發(fā)酵培養(yǎng)基：（NH4）2SO416.0 g/L、KH2PO43.0 g/L、Na2HPO4·12H2O 16.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、酵母粉2.0 g/L、MnSO4·H2O 0.01 g/L、葡萄糖20 g/L。

50%葡萄糖溶液配制：550 gD-葡萄糖，加雙蒸水定容至1 L。

抗生素溶液工作質(zhì)量濃度：氨芐青霉素100 μg/mL、壯觀霉素25 μg/mL。

誘導(dǎo)劑異丙基硫代-β-D半乳糖（isopropylβ-d-thiogalactoside，IPTG）工作液濃度：0.2 mmol/L。

高效液相色譜緩沖液：5 mmol/L H2SO4∶98%H2SO4272 μL，加入1 L雙蒸水中，并用0.22 μm水相濾膜過濾。

改良的Ehrlich's reagents[12]（50 mL）：稱取1 g對-二甲基苯甲醛溶解于30mL冰醋酸中，然后加入8mL高氯酸（70%），最后用冰醋酸定容至50 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

乙酸鈉緩沖液：稱取82 g無水乙酸鈉至57 mL的冰醋酸中，加水定容至1 L。

1.2 儀器與設(shè)備

Eppendorfmini離心機：德國Eppendorf公司；YXQ-LS-S II型全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司；HZQ-Q型全溫振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；發(fā)酵罐：美國NBS公司；CLASS-VP10A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、UV-1800型分光光度計：日本島津公司；SBA-40C生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)方法

一級種子培養(yǎng)：取出-80℃冰箱中保藏的DALA菌種接種于含有50 mL LB液體培養(yǎng)基的300 mL錐形瓶中，37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。

二級種子培養(yǎng)：取6 mL一級種子培養(yǎng)液于含有200 mL ALA發(fā)酵種子培養(yǎng)基的1 L錐形瓶中，37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)8 h。4 h時用5 mol/L NaOH調(diào)pH，使pH在6.5～7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)：按照2%的接種量分別取已培養(yǎng)好的二級種子菌液接種于裝有700mLALA發(fā)酵培養(yǎng)基的1L發(fā)酵罐中，同時加入0.2 mmol/L IPTG。初始葡萄糖含量均為20 g/L，發(fā)酵期間向罐中補加50%的葡萄糖母液，使發(fā)酵液中糖質(zhì)量濃度維持在10～20 g/L。發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵過程中用5 mol/L NaOH和3 mol/L H2SO4調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH。通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速與通氣量控制發(fā)酵液中溶解氧，進而探索合適的溶氧條件使ALA發(fā)酵得到較高產(chǎn)量。培養(yǎng)期間每4 h取1 mL菌液至1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心4 min，取上清至另一干凈的1.5 mL離心管中，菌體用于測定OD值，上清用于產(chǎn)物ALA、發(fā)酵液中葡萄糖含量的測定以及其他副產(chǎn)物乙酸、乳酸、谷氨酸的測定。

1.3.2 分析測定方法

ALA濃度的測定：發(fā)酵液中ALA濃度的測定按照參考文獻[15]制定的分光光度分析法，取離心保存的發(fā)酵液上清稀釋合適的倍數(shù)，取400 μL稀釋好的上清液至1.5 mL的離心管中，再依次加入200 μL乙酸鈉緩沖液和100 μL乙酰丙酮，在振蕩器上混勻，沸水浴中反應(yīng)15 min。取出反應(yīng)體系靜置自然冷卻至室溫，加入700 μL改良的Ehrlich's reagent并來回顛倒混勻，反應(yīng)20 min，使用分光光度計在波長554 nm處測吸光度值，根據(jù)ALA/OD554nm標準曲線計算ALA的濃度。

葡萄糖濃度的測定：發(fā)酵液中葡萄糖濃度使用SBA-40C生物傳感分析儀測定。

發(fā)酵液中菌體OD的測定：根據(jù)菌體濃度稀釋合適的倍數(shù)，使用分光光度計在波長600 nm處測OD600nm。

谷氨酸濃度的測定：使用SBA-40C生物傳感分析儀測定。

乙酸、乳酸濃度的測定：使用HPLC檢測。發(fā)酵液上清通過0.22 μm水相濾膜過濾除菌。HPLC采用陽離子交換柱（HPX-87，BioRadLabs），示差檢測器ShimadzuRID-10A，流動相使用5 mmol/L的硫酸水溶液，流速0.6 mL/min。柱溫箱的溫度為65℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)ALA重組大腸桿菌DALA發(fā)酵pH優(yōu)化

由于ALA在偏酸性的環(huán)境中穩(wěn)定性較高，故先對重組大腸桿菌DALA發(fā)酵過程中的pH進行優(yōu)化。在溶氧均為前期轉(zhuǎn)速500 r/min，通氣量2 vvm；后期轉(zhuǎn)速200 r/min，通氣量1 vvm的條件下，考察重組大腸桿菌DALA在（a）發(fā)酵前期pH6.0；穩(wěn)定期后期pH5.5；（b）發(fā)酵前期pH6.5；穩(wěn)定期后期pH6.0時的發(fā)酵結(jié)果。結(jié)果如圖2所示。

圖2 重組大腸桿菌DALA在不同pH條件下的發(fā)酵結(jié)果Fig.2 Fermentation results of recombinantE.coliDALA in different pH conditions

由圖2可知，在不同pH條件下，發(fā)酵罐菌體生長趨勢一致，副產(chǎn)物的積累量相近，而發(fā)酵前期pH為6.5，穩(wěn)定期后期pH為6.0條件下發(fā)酵罐中積累ALA產(chǎn)量較高。在此條件下，ALA的量可達到3.39 g/L。因此，采用發(fā)酵前期pH6.5，穩(wěn)定期后期pH6.0的方式控制發(fā)酵pH值。

2.2 產(chǎn)ALA重組大腸桿菌DALA發(fā)酵溶氧優(yōu)化

ALA的發(fā)酵受溶氧條件影響較大，故對重組菌DALA發(fā)酵過程中的溶氧進行了優(yōu)化，在pH均為發(fā)酵前期pH6.5，穩(wěn)定期后期pH6.0的條件下，分別調(diào)整（a）發(fā)酵前期轉(zhuǎn)速400 r/min，通氣量2 vvm；穩(wěn)定期后期轉(zhuǎn)速200 r/min，通氣量1 vvm；（b）發(fā)酵前期轉(zhuǎn)速500 r/min，通氣量2 vvm；穩(wěn)定期后期轉(zhuǎn)速250 r/min，通氣量1 vvm。通過控制轉(zhuǎn)速調(diào)控發(fā)酵過程中的溶氧，考察在不同溶氧條件下的發(fā)酵結(jié)果。結(jié)果見圖3。

圖3 重組大腸桿菌DALA在不同溶氧條件下的發(fā)酵結(jié)果。Fig.3 RecombinantE.coliDALA fermentation results under different conditions of dissolved oxygen

由圖3可知，發(fā)酵罐菌體生長趨勢一致，副產(chǎn)物的積累量相近，發(fā)酵前期轉(zhuǎn)速為500 r/min，通氣量為2 vvm；穩(wěn)定期后期轉(zhuǎn)速為250 r/min，通氣量為1 vvm，有利于ALA的積累。ALA的產(chǎn)量最終可達3.46 g/L。因此，發(fā)酵前期轉(zhuǎn)速為500 r/min，通氣量為2 vvm；穩(wěn)定期后期轉(zhuǎn)速為250 r/min，通氣量為1 vvm的方式控制發(fā)酵溶氧。

綜上所述，首先對發(fā)酵液的pH進行優(yōu)化，發(fā)酵前期發(fā)酵液pH維持6.5，一方面不影響菌體的正常生長繁殖與生理代謝；另一方面，pH值為6.5時，ALA在水溶液中還可以穩(wěn)定存在。穩(wěn)定期后期，菌體的活性開始下降，且發(fā)酵液中已經(jīng)積累大量的ALA，繼續(xù)降低發(fā)酵液的pH至6.0，此時菌體繼續(xù)積累ALA，同時發(fā)酵液pH降低為6.0時加強了發(fā)酵液中ALA的穩(wěn)定性。有利于重組大腸桿菌DALA積累ALA。其次，對發(fā)酵液的溶氧進行了優(yōu)化。ALA是血紅素合成的前體物質(zhì)，血紅素是生物呼吸電子傳遞鏈蛋白的重要組成部分，參與細胞中許多重要的生理代謝活動[16]。ALA的產(chǎn)生和菌體的呼吸狀態(tài)密切相關(guān)，重組菌DALA在較高的溶解氧條件下有氧呼吸加強，生理代謝加快，一定程度上增加了ALA積累。但發(fā)酵液中一直保持較高的溶氧狀態(tài)，易使菌體中積累大量的血紅素，不利于ALA的持續(xù)性積累。因此發(fā)酵前期采用好氧發(fā)酵，使菌體快速繁殖，同時菌體呼吸較強，可以快速積累ALA。發(fā)酵后期菌體生長達到穩(wěn)定，這時降低發(fā)酵罐的通氣量和轉(zhuǎn)速，改為微好氧發(fā)酵，既可以保證ALA的繼續(xù)積累，減少ALA走向下游生成終產(chǎn)物血紅素，同時又避免葡萄糖代謝流向副產(chǎn)物而造成碳源的浪費，節(jié)約資源。

由于該重組菌DALA發(fā)酵后期仍會積累副產(chǎn)物乳酸、乙酸，可能的原因是發(fā)酵后期轉(zhuǎn)為微好氧發(fā)酵，三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）途徑減弱，而乙酸、乳酸等產(chǎn)物途徑?jīng)]有被敲除，積累一定量的副產(chǎn)物不利于細胞的生理代謝，因而需要作進一步的基因改造，減少副產(chǎn)物的積累，使更多的葡萄糖用于ALA的生產(chǎn)。

本次發(fā)酵中前體物谷氨酸基本不積累，原因可能是谷氨酰tRNA還原酶和谷氨酰-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶可以有效地催化谷氨酸生成ALA，同時質(zhì)粒上過表達rhtA基因產(chǎn)生大量的RhtA轉(zhuǎn)運蛋白，RhtA轉(zhuǎn)運蛋白是一種特異性不強的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白，可以將細菌胞內(nèi)積累的大量ALA運輸?shù)郊毎?，進而解除ALA對自身積累的抑制，有利于ALA的生產(chǎn)。ALA的有效生產(chǎn)造成前體物谷氨酸不足，因而在發(fā)酵液中基本檢測不到谷氨酸的積累。

3 結(jié)論

本實驗主要對重組菌DALA發(fā)酵生產(chǎn)ALA過程中pH以及溶氧進行了優(yōu)化，初步確定合適的發(fā)酵條件為：發(fā)酵前期（0～27h）pH保持在6.5，轉(zhuǎn)速為500 r/min，通氣量為2 vvm；穩(wěn)定期后期（28～48 h）pH為6.0，轉(zhuǎn)速降低至250 r/min，同時通氣量減少為1 vvm，在該條件下有利于ALA的積累，產(chǎn)量可達到3.46 g/L。ALA化學(xué)性質(zhì)的不穩(wěn)定性，在水溶液中易發(fā)生兩兩縮合反應(yīng)，隨著溶液中pH的升高，ALA的穩(wěn)定性降低，且這一性質(zhì)隨著發(fā)酵液中ALA的濃度增加而越來越明顯。同時，利用大腸桿菌重組菌DALA發(fā)酵生產(chǎn)ALA時，ALA的積累受發(fā)酵液中溶氧的影響較大。太低的溶氧條件會造成菌體呼吸困難，不利于ALA的積累。而過高的溶氧又會促進ALA走向下游生成終產(chǎn)物血紅素，血紅素的生成一方面消耗ALA，另一方面反饋抑制ALA的合成。本實驗獲得的研究結(jié)果可以為將來的發(fā)酵放大實驗提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

[1]SAKAMOTO F H,LOPES J D,ANDERSON R R.Photodynamic therapy for acne vulgaris:a critical review from basics to clinical practice:part I.Acne vulgaris:when and why consider photodynamic therapy[J].J Am Acad Dermatol,2010,63(2):183-196.

[2]SASAKI K,WATANABLE M,TANAKA T.Biosynthesis,biotechnological production and applications of 5-aminolevulinic acid[J].Appl Microbiol Biotechnol,2002,58(1):23-28.

[3]付士凱，李偉華，時建剛.5-氨基乙酰丙酸的應(yīng)用及合成方法[J].山東化工，2003，32（3）：24-26.

[4]FU W,LIN J,CEN P.Expression of a hemA gene fromAgrobacterium radiobacterin a rare condon optimizingEscherichia colifor improving 5-aminolevulinate production[J].Appl Biochem Biotechnol,2010,160 (2):456-466.

[5]XIE L,HALL D,EITEMAN M A,et al.Optimization of recombinant aminolevulinate synthase production inEsherichia coliusing factorial design[J].Appl Microbiol Biotechnol,2003,63(3):267-273.

[6]VAN DER WERF M J,ZEIKUS J G.5-Aminolevulinate production by Escherichia colicontaining theRhodobacter sphaeroides hemAgene[J]. Appl Environ Microbiol,1996,62(10):3560-3566.

[7]LEE D H,JUN W J,SHIN D H,et al.Effect of culture conditions on production of 5-aminolevulinic acid by recombinantEscherichia coli[J]. Biosci Biotechnol Biochem,2005,69(3):470-476.

[8]BEALE S I.Biosynthesis of the tetrapyrrol pigment precursor,delta-aminolevulinic acid,from glutamate[J].J Plant Physiol,1990,93(4):1273-1278.

[9]KANG Z,WANG Q,QI Q,et al.EngineeringEscherichia colifor efficient production of 5-aminolevulinic acid from glucose[J].Metab Eng, 2011,13(5):492-498.

[10]KANG Z,WANG Q,QI Q,et al.Metabolic engineering to improve 5-aminolevulinic acid production[J].Bioeng Bug,2011,2(6):342-345.

[11]LI F,WANG Y,QI Q,et al.Constitutive expression of RyhB regulates the heme biosynthesis pathway and increases the 5-aminolevulinic acid accumulation inEscherichia coli[J].FEMS Microbiol Lett,2014,350 (2):209-215.

[12]朱欽豪，邊亞西，吳昊，等.淡紫灰鏈霉菌H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑發(fā)酵條件優(yōu)化[J].中國釀造，2016，35（2）：18-23.

[13]張松，李嘯，石小丹，等.產(chǎn)酮基還原酶基因工程菌培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速條件的優(yōu)化[J].中國釀造，2016，35（2）：79-83.

[14]劉寬博，熊利霞，劉慧，等.抗單增李斯特菌枯草芽孢桿菌C3增菌培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].中國釀造，2016，35（2）：48-52.

[15]MANZERALLD,GRANICKS.Theoccurrenceanddeterminationof deita-amino-levulinic acid and porphobilinogen in urine[J].J Biol Chem, 1956,219(1):435-446.

[16]MENSE S M,ZHANG L.Heme:a versatile signaling molecule controlling the activities of diverse regulators ranging from transcription factors to MAP kinases[J].Cell Res,2006,16(8):681-692.

Effect of pH and dissolved oxygen on the fermentation production of 5-aminolevulinic acid by recombinantEscherichia coli

CHENG Xuelian1,WANG Qian1*,QI Qingsheng1,2
(1.National Glycoengineering Center,Shandong University,Jinan 250100,China; 2.State Key Laboratory of Microbial Technology,Shandong University,Jinan 250100,China)

Using the recombinantEscherichia coliDALA as experimental strains,the effects of pH and dissolved oxygen on the 5-aminolevulinic acid (5-ALA)during fermentation in mechanical stirred fermentation tank were researched.The results showed that the pH was 6.5 in the early period of fermentation(0-27 h),and in the late period of stable stage(28-48 h),the pH was 6.5,which was conducive to the accumulation of 5-ALA.Besides, by controlling the rotate speed and the aeration to adjust dissolved oxygen in the fermentation liquid,it showed that in the early period of fermentation,the rotate speed was 500 r/min and aeration was 2 vvm.In the late period of stable stage,the rotate speed and aeration were reduced to 250 r/min and 1 vvm,respectively,which was conducive to the fermentation production of 5-ALA by recombinantE.coli.Under the conditions,the yield of 5-ALA was up to 3.46 g/L.

recombinantEscherichia coli;5-aminolevulinic acid;dissolved oxygen

Q939.99

0254-5071（2016）11-0145-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.030

2016-04-19

國家自然科學(xué)基金（31370085）；國家863計劃項目子課題（2012AA022104）；山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項（201422CX02602）

程雪蓮（1990-），女，碩士，研究方向為微生物生物合成代謝調(diào)控。

*通訊作者：王倩（1983-），女，講師，博士，研究方向為微生物生物合成代謝調(diào)控。