趙慶慶，宋文靜

（天津醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，天津300070）

論著

NF-κB和eIF4E在子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變和子宮內(nèi)膜樣癌中的表達(dá)及意義

趙慶慶，宋文靜

（天津醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，天津300070）

目的：探討核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）和eIF4E在子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變（EIN）和子宮內(nèi)膜樣癌（EC）中的表達(dá)規(guī)律及意義。方法：免疫組織化學(xué)SP法檢測NF-κB和eIF4E在增殖期子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜增生、EIN及EC中的表達(dá)，應(yīng)用Mann-Whitney U檢驗(yàn)及Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：（1）NF-κB在4組中呈遞增性表達(dá)，EIN組與EC組間無顯著差異性（P＞0.05），與其余兩組組間表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（2）eIF4E在EC中的表達(dá)明顯高于增殖期子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜增生及EIN，且EIN組與各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（3）NF-κB和eIF4E在EIN及相關(guān)病變中的表達(dá)有顯著相關(guān)性（r=0.949，P＜0.05）。結(jié)論：NF-κB和eIF4E在EIN及EC中高表達(dá)，在EIN發(fā)展為EC的過程中逐漸被激活，進(jìn)而加速轉(zhuǎn)錄、翻譯，增大EIN進(jìn)展為子宮內(nèi)膜樣癌的可能性。

子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變；子宮內(nèi)膜樣癌；NF-κB；eIF4E；免疫組化

子宮內(nèi)膜癌在發(fā)達(dá)國家女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中最常見，約占所有腫瘤的4%[1]。隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們生活水平的不斷提高，我國子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率也逐年上升。一直以來，子宮內(nèi)膜癌病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制始終是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。2000年，該領(lǐng)域出現(xiàn)一重大突破，Mutter及其子宮內(nèi)膜協(xié)作組提出子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變(endometrial intraepithelial neoplasia,EIN)的概念[2]，將子宮內(nèi)膜增生分為良性子宮內(nèi)膜增生、EIN，并認(rèn)為EIN是子宮內(nèi)膜樣癌（endometrioid carcinoma,EC）癌前病變的組織形態(tài)學(xué)改變。關(guān)于EIN的相關(guān)研究報告己陸續(xù)見諸于國外文獻(xiàn)，但國內(nèi)涉及EIN的研究報告卻很少。本研究采用免疫組化SP法分析了核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB） 和真核細(xì)胞翻譯起始因子 4E (eukaryotictransla-tioninitiationfactor4E，eIF4E) 在EIN及其相關(guān)病變中的表達(dá)，探討NF-κB和eIF4E在EIN進(jìn)展為子宮內(nèi)膜樣癌過程中的作用和意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科2013年1月-2014年12月刮宮標(biāo)本85例，年齡29~80歲，平均年齡45.15歲。選取增殖期子宮內(nèi)膜10例、子宮內(nèi)膜增生30例（包括單純性增生15例、復(fù)雜性增生15例），子宮內(nèi)膜樣癌20例，按照EIN診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]篩選出EIN 25例。所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度4 μm。

1.2 試劑 鼠抗人NF-κB（ZS-8008）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、鼠抗eIF4E單克隆抗體（BM1738）（武漢博士德生物技術(shù)有限公司），免疫組化SP試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照。

1.3 方法 組織標(biāo)本（蠟塊）做4 μm厚連續(xù)切片，貼附于載玻片上，置于66～70℃烤箱中烤蠟1 h，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫苯至水，PBS沖洗，3 min×2次，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液的容器中，置于微波爐內(nèi)，中火，3 min×2次，自然冷卻至室溫，PBS沖洗，3 min×2次，3%H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗，3 min×2次，滴加一抗，置于濕盒中，4℃冰箱過夜，翌日，4℃冰箱取出，恢復(fù)至室溫，PBS沖洗，3 min×3次，滴加二抗工作液，37℃溫箱孵育40 min，PBS沖洗，3 min×3次，DAB顯色系統(tǒng)顯色，統(tǒng)一時間滴加DAB工作液，顯微鏡下觀察，統(tǒng)一時間終止顯色，充分水洗、蘇木素復(fù)染細(xì)胞核、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果判定 NF-κB及eIF4E陽性染色均位于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒。采用雙盲法隨機(jī)觀察10個高倍視野（×400），每個高倍視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞。先根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)所占的百分?jǐn)?shù)計(jì)分：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；再根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；兩者評分相乘，0分為“－”；1～3分為“+”；4～6分為“2+”；7～12分為“3+”。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Mann－Whitney U檢驗(yàn)及Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行分析，相關(guān)分析應(yīng)用Spearman秩相關(guān)；采用SPSS l7.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB、eIF4E在 EIN及其相關(guān)病變的表達(dá) NF-κB及eIF4E陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒。NF-κB在子宮內(nèi)膜樣癌組的陽性率達(dá)90%，明顯高于EIN組（80%）、子宮內(nèi)膜增生組（53.33%）和增殖期子宮內(nèi)膜組（30%），EIN組與子宮內(nèi)膜樣癌組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=－1.653，P= 0.098），與其余兩組組間差異顯著（P＜0.05）。eIF4E在增殖期子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜增生、EIN及子宮內(nèi)膜樣癌中表達(dá)呈遞增趨勢，且EIN組與各組組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1和圖1。

表1 NF-κB及eIF4E在EIN及其相關(guān)病變的表達(dá)(n)Tab 1 The expressions of NF-κB and eIF4E in EIN and associated lesions(n)

圖1 NF-κB、eIF4E在EIN和子宮內(nèi)膜樣癌的表達(dá)(SP,×100)Fig 1 The expressions of NF-κB and eIF4E in EIN and endometrioid carcinoma(SP,×100)

2.2 NF-κB、eIF4E表達(dá)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示，NF-κB和eIF4E在EIN及相關(guān)病變中的表達(dá)呈顯著相關(guān)性（r=0.949，P＜0.05）。

3 討論

2000年Mutter提出的EIN一直是婦科病理學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。目前認(rèn)為EIN是一種腫瘤性的單克隆增生，具有癌的一些遺傳學(xué)特征（如單克隆性，PTEN、K-ras和MLH等基因的改變)，被視為子宮內(nèi)膜樣癌的癌前病變，但不具備癌的全部特征，其本質(zhì)是上皮內(nèi)腫瘤的形成，且不再分級[4]。EIN早期多為局灶性病變，進(jìn)展后可形成彌漫性病變。本研究病例中，局灶性病變21例，彌漫性病變4例。

3.1 NF-κB、eIF4E在EIN和子宮內(nèi)膜樣癌中的表達(dá)及意義 NF-κB是近年來發(fā)現(xiàn)的一種多向性、多功能的核轉(zhuǎn)錄因子，主要以具有活性的多肽p50/ p65異源性二聚體形式存在。當(dāng)細(xì)胞受到胞外刺激時，NF-κB的內(nèi)源性抑制因子IKB激活，介導(dǎo)p50/p65與κB位點(diǎn)結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的作用，尤其是對腫瘤形成相關(guān)蛋白的調(diào)控，如Cyclin D1、CDK、c-myc、VCAM-1等[5]。NF-κB不僅調(diào)控免疫細(xì)胞的激活、細(xì)胞的發(fā)育，而且炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡、腫瘤形成及轉(zhuǎn)移等多種病理生理過程都有NF-κB的參與[6]。有研究表明，在胃癌、肺非小細(xì)胞癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中，出現(xiàn)了NF-κB異?；罨案弑磉_(dá)。NF-κB在實(shí)體腫瘤發(fā)生中有很中心的地位，在乳腺癌[7]中NF-κB轉(zhuǎn)錄激活加強(qiáng)乳腺癌癌前病變向癌的轉(zhuǎn)變，借助上調(diào)相應(yīng)基因NOS、COX-2、VEGE來調(diào)節(jié)血管生成，促進(jìn)乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Jin[8]研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在胃癌中的激活能夠促進(jìn)下游蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲，應(yīng)用NF-κB抑制劑對減緩腫瘤進(jìn)展有一定作用。但是，NF-κB在EIN或子宮內(nèi)膜樣癌中的作用國內(nèi)外報道很少。Surazynski[9]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜樣癌組織中存在NF-κB的高表達(dá)，提示NF-κB激活后表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜癌的病情進(jìn)展，依此推測子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展極有可能與NF-κB激活有關(guān)。而Carlos等[10]研究卻顯示相反結(jié)果，在這項(xiàng)研究中，NF-κB在子宮內(nèi)膜樣癌低表達(dá)，正常子宮內(nèi)膜組織高表達(dá)，推測可能因?yàn)樽訉m內(nèi)膜周期性剝脫涉及炎癥反應(yīng)，NF-κB通過調(diào)控一些基因轉(zhuǎn)錄間接參與炎癥反應(yīng)，因此正常子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)高水平。陳麗平[11]用免疫組化法檢測正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌中NF-κB的表達(dá)，結(jié)果顯示NF-κB在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)。本研究中，NF-κB在EIN中的表達(dá)高于增殖期子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜增生（Z=-2.129，P=0.033、Z=-1.998，P= 0.046）；低于子宮內(nèi)膜樣癌，且EIN組與子宮內(nèi)膜樣癌組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），顯示出NF-κB在子宮內(nèi)膜樣癌的癌前病變EIN及子宮內(nèi)膜樣癌中的異常表達(dá)十分相近，提示NF-κB在EIN及子宮內(nèi)膜樣癌的形成發(fā)展中具有相似的作用。NF-κB在增殖期子宮內(nèi)膜中表達(dá)弱，推測NF-κB可能處于失活的有序調(diào)控中，隨著病變進(jìn)展，NF-κB被激活，并不斷累積，進(jìn)而在EIN及子宮內(nèi)膜樣癌中高表達(dá)，充分體現(xiàn)NF-κB與腫瘤發(fā)生的密切相關(guān)性。

eIF4E定位于4q21~4q25染色體，是真核細(xì)胞翻譯起始因子eIFs家族的一員，在蛋白質(zhì)合成起始階段起調(diào)控作用，并通過調(diào)控腫瘤相關(guān)mRNAs的翻譯參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。有人提出，eIF4E表達(dá)受自身磷酸化、翻譯抑制蛋白家族活性(如4EBP1)及其基因轉(zhuǎn)錄(如ras、c-myc基因)等因素的調(diào)節(jié)，各種因素導(dǎo)致eIF4E過度表達(dá)，介導(dǎo)大量與腫瘤生長分化及浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白質(zhì)，如細(xì)胞周期素Cyclin D1、Rb蛋白、血管形成因子(FGF2、VEGF)、生存素survivin和Bcl-2等[13]。近年來研究顯示，eIF4E在多種腫瘤中有過度表達(dá)，如鼻咽癌、宮頸癌、前列腺癌、乳腺癌等，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲密切相關(guān)。Filippa等[14]研究報道eIF4E在乳腺原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤中高表達(dá)，提示eIF4E能夠促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，而低表達(dá)的eIF4E能夠降低乳腺腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。eIF4E在EIN或子宮內(nèi)膜樣癌中的作用國內(nèi)外報道尚少。Darb-Esfahani等[15]通過m-TOR抑制劑雷帕霉素來抑制eIF4E的過度表達(dá)，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長增殖明顯被抑。Choi等[16]研究發(fā)現(xiàn)eIF4E蛋白在子宮內(nèi)膜腺癌中過度表達(dá)，Ⅲ～Ⅳ期明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，而正常內(nèi)膜未發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)，提示eIF4E蛋白過度表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌分期相關(guān)。國內(nèi)有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，eIF4E在正常子宮內(nèi)膜組織中低表達(dá)，與子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)差異顯著[17]。本研究中eIF4E在增殖期子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜增生、EIN及子宮內(nèi)膜樣癌中表達(dá)逐漸遞增，且EIN組與子宮內(nèi)膜增生及子宮內(nèi)膜樣癌組間均有顯著差異性（Z=-2.349，P=0.019；Z=-2.521，P=0.012）。提示eIF4E的過度表達(dá)參與了子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)生發(fā)展過程，而在EIN的高表達(dá)，從分子水平上顯示EIN不同于普通子宮內(nèi)膜增生，并在一定程度上提示EIN進(jìn)展為子宮內(nèi)膜樣癌的風(fēng)險性加大。

3.2 NF-κB與eIF4E的相關(guān)性 子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展是一個多基因、多步驟的復(fù)雜過程，分子遺傳學(xué)研究證據(jù)表明，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生可能是細(xì)胞調(diào)節(jié)通路相關(guān)基因（如原癌基因的激活，腫瘤抑制基因的失活）異常改變并逐步積累，引起細(xì)胞生長功能失調(diào)的結(jié)果[18]。有研究表明癌基因c-myc與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生密切相關(guān)，而NF-κB作為細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄的重要因子，可調(diào)控c-myc的表達(dá)和活性，同時eIF4E作為惡性蛋白質(zhì)翻譯過程中關(guān)鍵因子，c-myc可與eIF4E啟動序列結(jié)合，激活eIF4E的轉(zhuǎn)錄翻譯。Hariri等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)，在主要的造血干細(xì)胞系中，eIF4E水平可影響NF-κB活化，同時內(nèi)源性eIF4E基因可以促進(jìn)NF-κBp65和cRel定位在κB位點(diǎn)上，引起κB位點(diǎn)磷酸化進(jìn)而導(dǎo)致NF-κB的活化，影響細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平。在本研究中，NF-κB與eIF4E的表達(dá)存在顯著相關(guān)性（r=0.949，P＜0.05），推測NF-κB與eIF4E在子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有某種協(xié)同作用。

綜上，NF-κB與eIF4E在EIN及子宮內(nèi)膜樣癌中高表達(dá)，表明EIN進(jìn)展為子宮內(nèi)膜樣癌的過程中細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯加快，細(xì)胞增殖逐漸失控，推測NF-κB和eIF4E共同影響EIN發(fā)展為子宮內(nèi)膜樣癌的進(jìn)程，其中更深入的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

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(2016-05-16收稿)

Expression and significance of NF-κB and eIF4E in endometrial intraepithelial neoplasia and endometrioid carcinoma

ZHAO Qing-qing，SONG Wen-jing
（Department of Pathology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China)

Objective:To investigate the expressions and roles of NF-κB and eIF4E in the endometrial intraepithelial neoplasia(EIN)and endometrioid carcinoma(EC).Methods：Immunohistochemical SP method was used to detect the expressions of NF-κB and eIF4E in the proliferative stage of endometrium,hyperplasia endometrium,EIN and EC.The statistical data were analyzed Using MannWhitney U test and Wilcoxon test.Results:(1)The expression levels of NF-κB increased gradually,and there was no statistically significant difference between EIN and EC(P＞0.05).However,difference between the EIN and other groups was significance.(2)The positive rate of eIF4E was significantly higher in EC than in proliferative stage of endometrium,hyperplasia endometrium and EIN(P<0.05).(3)NF-κB and eIF4E had a strong correlation between EIN and associated lesions(r=0.949,P＜0.05).Conclusion:NF-κB and eIF4E are highly expressed in EIN and EC.They may be gradually activated in the process of EIN development to EC,and then accelerate transcription or translation,and increase the possibility of endometrial carcinoma.

endometrial intraepithelial neoplasia;endometrioid carcinoma;NF-κB;eIF4E;immunohistochemistry

R737.33

A

1006-8147（2016）06-0483-04

趙慶慶（1990-），女，碩士在讀，研究方向：女性生殖系統(tǒng)腫瘤；通信作者：宋文靜，E-mail：songwenjing2004@aliyun.com。