邵佳，徐靖源

（1.天津市第一中心醫(yī)院藥學(xué)部，天津300192；2.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070）

論著

氨基噻唑酮Cu(II)核酸酶的合成、結(jié)構(gòu)及活性研究

邵佳1，徐靖源2

（1.天津市第一中心醫(yī)院藥學(xué)部，天津300192；2.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070）

目的：探究氨基噻唑酮Cu（II）核酸酶的合成、晶體結(jié)構(gòu)及其活性，預(yù)期得到一種高效的體外化學(xué)核酸酶試劑。方法：利用單晶衍射、瓊脂糖凝膠電泳分別確定氨基噻唑酮Cu(II)核酸酶試劑的空間結(jié)構(gòu)及其活性。結(jié)果：氨基噻唑酮Cu(II)核酸酶試劑為單斜晶系，空間群為P2(1)/n，由單個(gè)[Cu(TZD)Br2](1)(TZD=(Z)-3-methyl-2-((E)-(1-phenylethylidene)hydrazono)-thiazolidin-4-one)單元組成，相比原來配合物[Cu(4ML)Cl]，經(jīng)改造后的1在外界誘導(dǎo)劑的存在下30 μmol/L即可將DNA由Form I完全轉(zhuǎn)變?yōu)镕orm II，核酸酶活性提高10倍以上，核酸酶機(jī)制以氧化切割為主。結(jié)論：該研究獲得一種氨基噻唑酮配體和一個(gè)新穎的氨基噻唑酮Cu(II)配合物，并表征其晶體結(jié)構(gòu)，1作為一種高效的核酸酶試劑，其能力比[Cu(4ML)Cl]提高一個(gè)數(shù)量級(jí)，可作為一種潛在的抗腫瘤藥物。

氨基噻唑酮；Cu(II)配合物；晶體結(jié)構(gòu)；核酸酶

化學(xué)核酸酶的研究是分子生物學(xué)科中最為活躍的領(lǐng)域之一，然而合成高效、專一的小分子化學(xué)核酸酶仍具有很大挑戰(zhàn)性。人工化學(xué)核酸酶的性質(zhì)一般受配體的顯著影響。噻唑酮類藥物，如吡格列酮、羅格列酮、恩格列酮、環(huán)格列酮等在臨床中廣泛應(yīng)用于II型糖尿病患者的治療。此類藥物通過激動(dòng)過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ），以增強(qiáng)糖尿病患者對(duì)胰島素的敏感性。在臨床治療中，研究人員發(fā)現(xiàn)使用噻唑酮類藥物的糖尿病患者乳腺癌、肺癌等發(fā)病率顯著降低[1-2]。許多臨床前研究也證明噻唑酮類化合物具有潛在的抗腫瘤活性[3-4]。由于噻唑酮類化合物富含S、N等雜原子基團(tuán)，因此其本身可提供電子與金屬離子螯合，自身是一類優(yōu)良的金屬離子螯合劑，有利于化學(xué)核酸酶的合成。銅元素作為生命的必需金屬元素，在體內(nèi)許多關(guān)鍵酶，如銅藍(lán)蛋白、細(xì)胞色素氧化酶等中發(fā)揮著不可替代的作用[5]。另外，銅元素本身具有氧化變價(jià)性質(zhì)，對(duì)DNA有一定裂解作用，我們?cè)噲D將具有潛在抗腫瘤活性的氨基噻唑酮類化合物與銅離子結(jié)合，預(yù)期得到一種具有潛在抗腫瘤活性的化學(xué)核酸酶試劑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Nicolet 380紅外光譜儀；Rigaku Saturn X-Ray單晶衍射儀；北京六一電泳儀；4-甲基氨基硫脲（百靈威科技）；2-乙酰吡啶（安耐吉化學(xué)）；氯乙酸（天津市化學(xué)試劑六廠）；CuBr2（天津市化學(xué)試劑六廠）；pUC19質(zhì)粒DNA（TaKaRa）。

1.2 方法

1.2.1 配體TZD的合成 依據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)表文獻(xiàn)[6]，將等摩爾比例2-乙酰吡啶(3.03 g)，4-甲基氨基硫脲(2.63 g)混合，放入含有乙醇/水（1∶2）60 mL的燒瓶中，回流2 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將淡黃色反應(yīng)液冷至室溫，有黃白色晶體析出，80 mL乙醇重結(jié)晶后得到黃白色晶體H4ML。之后，將摩爾比例為1∶1.1∶1的H4ML（2.08 g），氯乙酸（1.04 g）和三乙胺（1.01 g）混合于裝有30 mL的甲苯液中，回流1.5 h，停止加熱，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)步驟如圖1。將黃色油狀液體減壓除去甲苯溶劑后，氯化銨水洗得到粉棕色固體，乙醇50 mL重結(jié)晶得粉色片狀晶體，冷乙醇淋洗后，過濾干燥得TZD[7]。

圖1 配體TZD的合成Fig 1 Synthesis of TZD

1.2.2 配合物[Cu(TZD)Br2]的合成(1) 配體 TZD（0.099 g）、CuBr2（0.089 g）等摩爾比例共置于20 mL甲醇液中，初始淺藍(lán)色渾濁，室溫?cái)嚢? h后，溶液變?yōu)樯罹G色清液，將溶液置于濾紙中過濾，收集深綠色清液，將裝有濾液的小燒杯封口并留孔，少量沉淀?xiàng)壷茫?～4 d后，得墨綠色塊狀晶體，乙醚/乙醇清洗數(shù)次，收集晶體。主要紅外特征峰(KBr,cm-1): 1 728.7（C=O），1 585.1（C=N），1 366.3（CH3），1 317.6（CH3）。所測(cè)元素分析結(jié)果(%，括號(hào)中為理論值)：C28.79（28.01）；N11.89（11.88）；H2.56（2.56）。

1.2.3 晶體衍射 在收集晶體前，首選透明墨綠色塊狀晶體置于儀器中，293(2)K，單晶衍射儀衍射光源(λ=0.710 73 ?)為MoKα，晶體衍射數(shù)據(jù)以ω-2θ掃描方式收集。除氫原子以外原子用SHELXTL軟件初步解出坐標(biāo)位置，利用最小二乘法修正其各向異性熱參數(shù)，氫原子利用本軟件自動(dòng)加氫。配合物分子式為C11H12Br2CuN4OS，晶體學(xué)參數(shù)如下：?jiǎn)涡本?，P2（1）/n空間群，a=9.098 9（18）?，b=10.259(2) ?，c=16.469（3）?，R1(I＞2σ(I))=0.041。

1.2.4 化學(xué)核酸酶活性研究 取適量經(jīng)高壓滅菌的離心管，每管中加入等量pUC19質(zhì)粒DNA，除第一管作為質(zhì)控組外，其余各管依次加入遞增濃度的銅配合物溶液，均用緩液補(bǔ)齊體積。將此混合液離心混勻，放入37°C恒溫水浴鍋中，恒溫3 h。反應(yīng)結(jié)束后，各管加入一定體積終止劑，離心混勻，將管中液體加入提前半小時(shí)預(yù)制含有EB的1%瓊脂糖凝膠電泳孔槽中，開始電泳，觀察指示劑溴酚藍(lán)的前進(jìn)位置，至瓊脂糖凝膠約2/3位置處停止電泳，UVITEC凝膠自動(dòng)成像儀拍照。一般情況下，DNA片段分子的遷移率[8]為：超螺旋（Form I）＞線性（Form III）＞開環(huán)（Form II）。

2 結(jié)果

2.1 合成 結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期工作，為進(jìn)一步提升銅配合物體外化學(xué)核酸酶活性，利用H4ML與氯乙酸反應(yīng)得到氨基噻唑酮類化合物，增加銅離子周圍易離去基團(tuán)，減少配體與金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)。如圖2所示配體引入氯乙酸后，原與銅配位的硫原子被烷基占據(jù)，配合物由三齒變?yōu)閮升X配位，配合物分子為保持零價(jià)態(tài)，需結(jié)合兩個(gè)鹵素離子（溴離子）以平衡電位，從而得到預(yù)期的配合物[Cu(TZD)Br2]。

圖2 結(jié)構(gòu)變化Fig 2 Structural modifications

2.2 [Cu(TZD)Br2](1)的晶體結(jié)構(gòu) 1為單斜晶系，空間群為P2(1)/n，此結(jié)構(gòu)由單個(gè)[Cu(TZD)Br2]單元構(gòu)成，外圍無游離溶劑分子。如圖3所示，配體TZD以二齒配位與銅離子螯合，兩個(gè)溴離子與銅離子配位以保持配合物的零電位。[Cu(4ML)Cl]同樣為單斜晶系，但空間群為P2(1)/c。兩者的配位構(gòu)型因引入氯乙酸的緣故，配位構(gòu)型有所不同，配合物由原來的平面結(jié)構(gòu)，變?yōu)楝F(xiàn)在的非平面結(jié)構(gòu)，經(jīng)Diamond計(jì)算得到的噻唑酮環(huán)偏離由吡啶環(huán)與N1-C5-C6-N2-Cu1組成的基礎(chǔ)平面47.803°。Cu1與兩個(gè)鹵素原子間的距離分別為Cu1-Br1=2.336 6(8)?和Cu1-Br2=2.344 3(9)?；Cu1-N1=1.981(3)?比[Cu (4ML)Cl]中的銅與相應(yīng)配位氮原子鍵長(zhǎng)(Cu1-N4= 2.015（2）?)略短，Cu1-N2=2.019(3)?中的銅與相應(yīng)氮原子鍵長(zhǎng)(Cu1-N1=1.958(2)?）略長(zhǎng)，這主要由于配體中S原子未參與配位，造成Cu-N鍵長(zhǎng)的改變。配合物1主要鍵角如表1所示。

圖3 配合物1的晶體結(jié)構(gòu)Fig 3 Crystal structure of complex 1

表1 配合物1的主要鍵角[°]Tab 1 The main angles[°]for 1

2.3 配合物1的化學(xué)核酸酶活性 在電場(chǎng)作用下，pH值近中性緩沖液中，超螺旋質(zhì)粒DNA作為一種帶負(fù)電的多聚陰離子，由負(fù)極向正極移動(dòng)。DNA在化學(xué)核酸酶的作用下，會(huì)裂解為不同分子量的DNA片段，如開環(huán)DNA、線性DNA等，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，DNA片段的遷移速率有所不同，由于凝膠在制備前加入EB熒光染料，EB嵌入到不同分子量的DNA片段（包括超螺旋雙股DNA）中，在紫外燈下會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，以此觀察不同分子量DNA片段的電泳遷移率。在pH為7.2，溫度37°C的條件下，反應(yīng)3 h后，觀察1的化學(xué)核酸酶活性。

圖4 增加配合物1的濃度來觀察切割pUC19 DNA的凝膠電泳圖Fig 4 Gel electrophoresis diagram showing the cleavage of pUC19 DNA by increasing the concentration of 1

圖5 在H2O2的條件下，配合物1切割pUC19 DNA的凝膠電泳圖Fig 5 Gel electrophoresis diagrams showing the cleavage of pUC19 DNA with complex 1 with H2O2.

圖4示，在沒有外加H2O2的情況下，DNA在250 μmol/L的濃度1的作用下，超螺旋結(jié)構(gòu)幾乎被破壞，1明顯比三齒配位的[Cu(4ML)Cl]核酸酶活性高。在加入H2O2（250 μmol/L）的條件下，1的切割活性進(jìn)一步提升，在30 μmol/L的濃度下超螺旋DNA完全轉(zhuǎn)化為Form II，通過觀察Lane 8發(fā)現(xiàn)DNA呈彌散狀態(tài)，說明在誘導(dǎo)劑存在下，核酸酶活性極強(qiáng)。而[Cu(4ML)Cl]在400 μmol/L的濃度下借助高濃度的H2O2（1.2 mmol/L），才出現(xiàn)與1類似的DNA切割效果。在H2O2存在的條件下，如圖5所示，1的切割能力為[Cu(4ML)Cl]的10倍以上。由此可以推得，在相同濃度條件下，改造后的縮氨基硫脲及其衍生物二齒銅配合物比相應(yīng)三齒銅配合物核酸酶活性高出一個(gè)數(shù)量級(jí)。為了深入探討1的化學(xué)核酸酶機(jī)制，選擇6種化學(xué)核酸酶抑制劑：DMSO（羥基自由基淬滅劑）、SOD（超氧態(tài)陰離子自由基淬滅劑）、EDTA（金屬離子螯合劑）、KI（H2O2清除劑）、NaN3和L-his（單線態(tài)氧抑制劑）來觀察對(duì)配合物核酸酶活性的影響。如上圖6所示，只有Lane 5（SOD）未產(chǎn)生抑制作用，這表明超氧態(tài)陰離子自由基在核酸酶活性中不發(fā)揮重要作用；Lane 3（DMSO）產(chǎn)生抑制，說明羥基自由基可能在核酸酶活性中起重要作用；Lane 6（EDTA）處發(fā)生明顯的抑制，表明在金屬離子螯合劑EDTA存在下，1對(duì)DNA的斷裂活性減弱，暗示銅離子在1斷裂DNA過程中起重要作用。Lane 4和8都是作為單線態(tài)氧(1O2)抑制劑，且都發(fā)生了抑制作用，表明1O2在DNA切割過程中發(fā)揮著重要作用。

3 討論

化學(xué)核酸酶可以用來模擬天然核酸酶斷裂DNA，性質(zhì)又比天然核酸酶穩(wěn)定且易于長(zhǎng)期保存，是分子生物學(xué)家調(diào)控DNA的重要手段，有望作為化療藥物用于惡性腫瘤以及遺傳疾病的治療。銅作為一種生命微量元素，在生命體中扮演著重要角色，并且銅配合物本身具有相對(duì)水溶性好、配位模式多變、具有氧化還原電位等優(yōu)點(diǎn)，通常表現(xiàn)出比其它金屬配合物更好的化學(xué)核酸酶活性，其可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并促使腫瘤細(xì)胞凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)某些銅配合物的抗腫瘤活性優(yōu)于順鉑類抗癌藥物，而且兩類金屬藥物的抗腫瘤機(jī)制明顯不同，因此，激發(fā)了科研工作者們研發(fā)更多具有生物功能銅化學(xué)核酸酶試劑的研究興趣，以期望能得到高效、低毒的抗腫瘤藥物。

以H4ML為配體的[Cu(4ML)Cl]核酸酶和抗腫瘤活性數(shù)據(jù)已經(jīng)整理成文發(fā)表在 Journal of Coordination Chemistry中[6]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，[Cu (4ML)Cl]體外核酸酶活性不高，只有在高濃度外界誘導(dǎo)劑的存在下（1.2 mmol/L H2O2），才會(huì)具有相應(yīng)核酸酶切割活性。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期工作，本文以氨基噻唑酮為配體，設(shè)計(jì)得到了[Cu(TZD)Br2]核酸酶試劑，解析其晶體結(jié)構(gòu)，利用瓊脂糖凝膠電泳研究了配合物與DNA之間的核酸酶活性。結(jié)果顯示，1能夠?qū)⒊菪p股DNA切割，且其切割DNA的能力比[Cu(4ML)Cl]高出一個(gè)數(shù)量級(jí)，是同濃度下[Cu (4ML)Cl]核酸酶活性的10倍以上。研究結(jié)果顯示，該配合物是一類高效的體外化學(xué)核酸酶試劑，具有成為抗腫瘤藥物的潛質(zhì)，也為研究小分子物質(zhì)與DNA的相互作用機(jī)制提供了重要的信息。

[1] Chen S W,Tsan Y T,Chen J D,et al.Use of thiazolidinediones and the risk of colorectal cancer in patients with diabetes[J].Diabetes Care,2013,36(2):369

[2] Colmers I N,Bowker S L,Johnson J A.Thiazolidinedione use and cancer incidence in type 2 diabetes:a systematic review and metaanalysis[J].Diabetes Metab,2012,38(6):475

[3] Havrylyuk D,Mosula L,Zimenkovsky B,et al.Synthesis and anticancer activity evaluation of 4-thiazolidinones containing benzothiazole moiety[J].Eur J Med Chem,2010,45(11):5012

[4] Gududuru V,Hurh E,Dalton J T,et al.Synthesis and antiproliferative activity of 2-aryl-4-oxo-thiazolidin-3-yl-amides for prostate cancer[J].Bioorg Med Chem Lett,2004,14(21):5289

[5] Wierzbicka D,Gromadzka G.Ceruloplasmin,hephaestin and zyklopen:the three multicopper oxidases important for human iron metabolism[J].Postepy Hig Med Dosw,2014,68:912

[6] Ma Z Y,Shao J,Bao W G,et al.A thiosemicarbazone copper(II) complex as potential anticancer agent[J].J Coord Chem,2015,68 (2):277

[7] Casti?eiras A,García-Santos I,Saa M.Synthesis,structural characterization and properties of the palladium(II)and platinum(II) complexes of 2-{2-[(pyridin-2-yl)aminomethylene]hydrazono}-thiazolidin-4-oneandthe3-methylderivative[J].ZAnorgAllgChem, 2008,634:2281

[8] Shao J,Ma Z Y,Li A,et al.Thiosemicarbazone Cu(II)and Zn(II) complexes as potential anticancer agents:Syntheses,crystal structure,DNA cleavage,cytotoxicity and apoptosis induction activity[J].J Inorg Biochem,2014,136:13

（2016-06-08收稿）

Nuclease of amino-thiazolidinone Cu(II):synthesis,structure and activity

SHAO Jia1,XU Jing-yuan2
（1.Department of Pharmacy，Tianjin First Central Hospital,Tianjin 300192,China;2.School of Pharmacy,Tianjin Medical University, Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnostics,Tianjin 300070,China）

Objective:To study the synthesis,crystal structure and nuclease activity of the amino-thiazolidinone Cu(II)nuclease reagent, and to obtain an efficient chemical nuclease reagent in vitro.Methods:The crystal structure and nuclease acticity of Cu(II)nuclease reagent were discussed by X-ray and agarose gel electrophoresis.Results:The Cu(II)complex was monoclinic,space group P2(1)/n,and it consisted of a[Cu(TZD)Br2](1)(TZD= (Z)-3-methyl-2-((E)-(1-phenylethylidene)hydrazono)-thiazolidin-4-one)unit;the nuclease activity of 1(30 μmol/L)could make most of Form Itransform into Form IIwith inducer,and it was increased over 10-fold compared with[Cu (4ML)Cl];its nuclease mechanism was oxidative cleavage.Conclusion:An amino-thiazolidinone ligand and a novel amino-thiazolidinone Cu(II)nuclease reagent could be acquired.Cu(TZD)Br2capability is on a higher magnitude compared with[Cu(4ML)Cl],which can be used as a potential anti-tumor drug.

amino-thiazolidinone;Cu(II)complex;crystal structure;nuclease

R9

A

1006－8147（2016）06-0474-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21371135）

邵佳（1987-），男，博士，研究方向：抗腫瘤藥物合成及藥理學(xué)活性研究；通信作者：徐靖源，E-mail:xujingyuan@tmu.edu.cn。