郭巍，李巖，段會(huì)全，孫超，馮世慶，徐云強(qiáng)

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，天津300052）

論著

IL-11調(diào)控gp130/JAK2/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)Wistar大鼠雪旺細(xì)胞中PMP22的表達(dá)

郭巍，李巖，段會(huì)全，孫超，馮世慶，徐云強(qiáng)

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，天津300052）

目的：探索白介素-11（IL-11）對(duì)大鼠雪旺細(xì)胞分泌髓鞘蛋白的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)機(jī)制。方法：取成年Wistar大鼠坐骨神經(jīng)，分離純化培養(yǎng)雪旺細(xì)胞。加入重組大鼠IL-11，分別采用Realtime RT-qPCR和Western boltting檢測(cè)雪旺細(xì)胞髓鞘蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步檢測(cè)IL-11調(diào)控髓鞘蛋白表達(dá)的相關(guān)通路的激活情況。結(jié)果：Realtime RT-qPCR和Western boltting結(jié)果均提示IL-11可以顯著提高雪旺細(xì)胞中周圍神經(jīng)髓鞘蛋白22（PMP22）的表達(dá)水平，而對(duì)雪旺細(xì)胞中髓鞘堿性蛋白和髓鞘蛋白零的表達(dá)水平則沒無明顯影響，該生理作用可被JAK特異性抑制劑AG490所抑制。在經(jīng)過IL-11處理的雪旺細(xì)胞中可以觀察到pJAK2（Y1007＋Y1008）和pSTAT3（Y705）含量明顯高于對(duì)照組且伴隨著gp130表達(dá)的上調(diào)。結(jié)論：IL-11可通過調(diào)劑gp/30/ JAK2/STAT3信號(hào)通路以促進(jìn)雪旺細(xì)胞中PMP22的表達(dá)。

白介素-11；雪旺細(xì)胞；周圍神經(jīng)髓鞘蛋白22；JAK2/STAT3信號(hào)通路；大鼠

髓鞘為周圍神經(jīng)系統(tǒng)中雪旺細(xì)胞（SCs）膜多次纏繞包裹軸突構(gòu)成的鞘狀結(jié)構(gòu)，在神經(jīng)纖維的跳躍式傳導(dǎo)過程中提供絕緣保護(hù)作用及結(jié)構(gòu)支持[1]。在脊椎動(dòng)物中，髓鞘的厚度和所包裹的神經(jīng)纖維是成比例的，當(dāng)g比例（軸突直徑/有髓神經(jīng)纖維直徑）為0.71時(shí)神經(jīng)的傳導(dǎo)速率最高。周圍神經(jīng)脫髓鞘病變或髓鞘形成不良會(huì)降低神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)速率，常常表現(xiàn)為肌肉無力和感覺缺失等典型臨床癥狀并最終導(dǎo)致進(jìn)行性的軸突變性[2]。因此SCs形成髓鞘的能力對(duì)于周圍神經(jīng)的發(fā)育和損傷后的再生過程至關(guān)重要[1,3]。SCs形成髓鞘的過程受到多種內(nèi)源性因素的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞因子等，其中以白介素-11（IL-11）和IL-6最為重要[4-5]。研究顯示IL-11在周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、再生及變性過程中發(fā)揮重要作用[6]，并且在周圍神經(jīng)病變患者體內(nèi)可檢測(cè)到IL-11 mRNA表達(dá)水平的顯著提高[7]。大鼠坐骨神經(jīng)損傷后可以觀察到其背跟神經(jīng)節(jié)及損傷遠(yuǎn)端華勒氏變性部位IL-11含量及其受體表達(dá)上調(diào)[8]。近期研究表明，IL-11可通過結(jié)合gp130參與周圍神經(jīng)的再生過程，并且促進(jìn)神經(jīng)元中GAP-43的表達(dá)[6]，但I(xiàn)L-11在髓鞘形成過程中的作用及相關(guān)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。相關(guān)研究證實(shí)SCs膜上存在IL-11受體gp130[9]，敲除編碼白介素家族受體亞單位的gp130基因的小鼠表現(xiàn)出髓鞘退化的現(xiàn)象[10]。這表明IL-11可能通過gp130傳遞髓鞘形成的相關(guān)信號(hào)，但其下游效應(yīng)分子仍有待進(jìn)一步確認(rèn)。為進(jìn)一步闡明IL-11對(duì)外周神經(jīng)髓鞘化的影響，本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)的SCs中加入IL-11，檢測(cè)其對(duì)SCs中周圍神經(jīng)髓鞘蛋白22（PMP22）等表達(dá)的影響并進(jìn)一步探索相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 雌性Wistar大鼠（150～200 g）、重組大鼠IL-11、胎牛血清、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、II型膠原酶、AG490、PD98059兔抗大鼠PMP22、兔抗大鼠MBP、兔抗大鼠MPZ、兔抗大鼠pJAK2、兔抗大鼠pSTAT3、兔抗大鼠GAPDH、羊抗兔HPR、羊抗兔 IgG（Dylight488）、GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）、GoTaq?qPCR試劑盒（Promega）、羅氏LightCycler 480熒光定量PCR儀等。

1.2 方法

1.2.1 SCs培養(yǎng)和純化 大鼠5只，頸椎脫臼處死后取雙側(cè)坐骨神經(jīng)約1.5 cm，采用酶消化法培養(yǎng)SCs[11]。大致步驟為：解剖顯微鏡下仔細(xì)剝除神經(jīng)外膜。將神經(jīng)剪碎，體積約1 mm3。加入II型膠原酶，濃度0.1%，體積約為神經(jīng)組織體積20倍。在二氧化碳培養(yǎng)箱中充分混合消化35～45 min至無明顯組織塊。1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕輕吹打使細(xì)胞充分混勻，接種于層黏連蛋白包被的25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，密度為（3.1±0.17）×105個(gè)/mL。采用低濃度膠原酶差速消化法提純SCs[12]。大致步驟為：體外培養(yǎng)48 h后，移除未貼壁的細(xì)胞及組織碎片，加入0.05%Ⅱ型膠原酶（0.1 mL/cm2）37℃消化35～40 min后水平輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使SCs與瓶底分離，收集細(xì)胞懸液于15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，密度為（1.8±0.12）×105個(gè)/ mL。48h后，重復(fù)上述過程，進(jìn)行SCs第二次純化。

1.2.2 S100β染色鑒定SCs 4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）漂洗3次，每次5 min。加入0.3%Triton X-100透膜。加入兔抗大鼠S100β（1∶200），4℃過夜。磷酸鹽緩沖液漂洗3次，每次5 min;加入熒光二抗（羊抗兔IgG，1∶300，Dylight488），室溫下避光孵育2 h，磷酸鹽緩沖液漂洗3次，每次5 min。DAPI甘油封片。共聚焦顯微鏡觀察及拍照。

1.2.3 Real time RT-qPCR 取純化后的SCs，將其培養(yǎng)基換為含0.1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)12 h。隨后加入相應(yīng)濃度的IL-11（0、0.5、1.0、1.5 μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)12 h。Trizol法提取細(xì)胞總mRNA，利用GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA。采用GoTaq? qPCR Master Mix試劑盒和羅氏LightCycler 480熒光定量PCR儀定量分析目的基因的表達(dá)量。相應(yīng)引物序列為：MBP，F(xiàn):5′-AGAGTCCGACGAGCTTCAG A-3′,R:5′-CAGGTACTTGGATCGCTGTG-3′;MPZ， F:5′-TCTCAGGTCACGCTCTATGTC-3′,R:5′-GCCA GCAGTACCGAATCAG-3′；PMP22，F(xiàn):5′-CCCAACT CCCAGCCACCA-TG-3′,R:5′-TCATTCGCGTTTCC GCAGGATC-3′;gp130 F:GCCCTTGGGAATGTCTCC TCAGAG R:TCTTCCATATG-AGCCGTGCAGACC GAPDH,F:5′-GTATGTCGTGGAGTCTACTGGCGT-3′, R:5′-TACTCCTTGGAGGCCATGTA-GGCC-3′。各目的基因的表達(dá)量由GAPDH基因表達(dá)量校準(zhǔn)，采用2(-DeltaDeltaC(T))法計(jì)算各目的基因的相對(duì)含量[13]。

1.2.4 Western blotting 取純化后的SCs，將其培養(yǎng)基換為含0.1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)12 h進(jìn)行饑餓處理。隨后加入相應(yīng)濃度的IL-11于細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。在應(yīng)用信號(hào)通路抑制劑的實(shí)驗(yàn)中，分別在加入 IL-11之前 6 h和 2 h用 AG490和PD98059預(yù)處理SCs。用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液裂解細(xì)胞。4℃，12 000 r/min離心20 min后取上清液，與上樣緩沖液按5∶1混合后100℃變性10 min。10%SDS-PAGE凝膠電泳，每空上樣15 μg。電泳完成后，將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，加入5%的脫脂牛奶室溫封閉30 min。隨后加入相應(yīng)的一抗（兔抗，工作濃度1∶3000，4℃過夜）及二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，1∶6000，室溫1 h）。設(shè)GAPDH內(nèi)參照，洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果，采用Image J凝膠分析軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。Real time RT-qPCR結(jié)果和Western blotting灰度值均由GAPDH校正，分析結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。各組間數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義為*P<0.05，**P<0.01。NS，無明顯差別。

2 結(jié)果

2.1 SCs的觀察和鑒定 體外培養(yǎng)的SCs包體呈梭形，向兩端發(fā)出雙極或三級(jí)突起。SCs特異性標(biāo)記物S100β免疫熒光染色顯示，經(jīng)過上述培養(yǎng)和純化過程，最終SCs的純度在95%以上。見圖1。

2.2 IL-11上調(diào)SCs中PMP22 mRNA含量并促進(jìn)PMP22蛋白表達(dá) 在經(jīng)純化后得到的SCs的培養(yǎng)基中加入不同濃度的IL-11（0、0.5、1.0、1.5μg/mL），12h后檢測(cè)SCs中髓鞘堿性蛋白（MBP）、髓鞘蛋白零（MPZ）、PMP22的mRNA和蛋白含量變化。Real time RT-qPCR結(jié)果顯示與對(duì)照組相比經(jīng)IL-11處理的SCs中MBP和MPZ mRNA的含量并沒有明顯變化；但當(dāng)IL-11濃度為1.0 μg/mL和1.5 μg/mL時(shí)，可以觀察到SCs中PMP22 mRNA含量明顯提高（n=3,P=0.002；n=3，P=0.011)（圖 2A）。Western blotting結(jié)果同樣顯示當(dāng)IL-11濃度為1.0 μg/mL和1.5μg/mL時(shí)，SCs中PMP22蛋白含量顯著升高（n=3, P=0.001；n=3,P=0.001)（圖2B）。

圖2 IL-11上調(diào)SCs中PMP22的表達(dá)水平Fig 2 IL-11 up-regulated the expression level of PMP22 in SCs

2.3 JAK2/STAT3通路在 IL-11促進(jìn) SCs合成PMP22過程中的重要作用 本研究中分別用JAK抑制劑AG490（50 μmol，6 h）和MAPKK抑制劑PD98059(25 μmol，2 h)預(yù)處理SCs，隨后再向培養(yǎng)基中加入IL-11（1.0 μg/mL，12 h）。觀察SCs中PMP22的表達(dá)情況。結(jié)果見圖3A，Real time RT-qPCR結(jié)果提示：PD98059并沒有抑制IL-11對(duì)SCs中PMP22表達(dá)的促進(jìn)作用，而在經(jīng)AG490預(yù)處理的SCs中，IL-11對(duì)PMP22表達(dá)的促進(jìn)作用被顯著抑制（n＝3，P＝0.005）；Western blotting（圖3B）結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)AG490可有效抑制IL-11對(duì)PMP22表達(dá)的促進(jìn)作用（n＝3，P＝0.007）。

圖3 JAK2特異性抑制劑（AG490）和MAPKK特異性抑制劑（PD98059）對(duì)IL-11促進(jìn)SCs中PMP22表達(dá)的影響Fig 3 Effects of JAK2 and MAPK inhibitors on IL-11 induced PMP22 expression

為進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，本研究檢測(cè)了IL-11處理過的SCs中pJAK2（Y1007＋Y1008）和pSTAT3（Y705）含量的變化。Western blotting結(jié)果分析顯示與對(duì)照組相比經(jīng)過IL-11（1.0 μg/mL，12 h）處理的SCs中pJAK2和pSTAT3含量明顯提高（n＝3，P＝0.011；n＝3，P＝0.002），而總JAK2和STAT3含量則無明顯變化（圖4）。提示IL-11可以通過激活 SCs胞中 JAK2/STAT3通路促進(jìn)PMP22的合成。

2.4 gp130在IL-11促進(jìn)SCs中PMP22表達(dá)的作用 為了進(jìn)一步驗(yàn)證IL-11是否也是通過結(jié)合gp130來激活JAK2/STAT3信號(hào)通路以增強(qiáng)SCs中PMP22的合成，本研究通過Real time RT-qPCR和Western blotting的方法檢測(cè)經(jīng)過IL-11處理的SCs中g(shù)p130的表達(dá)變化。Real time RT-qPCR結(jié)果（A）和Western blotting分析結(jié)果（B）均顯示在經(jīng)過IL-11處理的SCs中g(shù)p130的表達(dá)量呈現(xiàn)明顯提高（n＝3，P＝0.001；n＝3，P＝0.020）（圖5）。結(jié)果提示，IL-11可通過結(jié)合gp130以激活JAK2/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)SCs中PMP22的表達(dá)。

圖4 經(jīng)IL-11處理后，SCs中JAK2和STAT3磷酸化情況Fig 4 Levels of JAK2 and STAT3 phosphorylation examined by Western blotting analysis

圖5 經(jīng)IL－11處理后SCs中g(shù)p130的表達(dá)情況Fig 5 The expressional level of gp130 in SCs treated with IL-11

3 討論

本研究證實(shí)，IL-11可以顯著提高 SCs中PMP22的表達(dá)而對(duì)MBP和MPZ的表達(dá)無明顯作用。在非神經(jīng)組織中，IL-11主要通過JAK2/STAT3通路和RAS/MAPK通路發(fā)揮作用[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)IL-11對(duì)SCs中PMP22表達(dá)的促進(jìn)作用可被JAK特異性抑制劑AG490所抑制，并且在經(jīng)過IL-11處理的SCs細(xì)胞中pJAK2（Y1007＋Y1008）和pSTAT3（Y705）含量明顯高于對(duì)照組。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IL-11可通過激活JAK2/STAT3通路上調(diào)SCs中PMP22的表達(dá)，但I(xiàn)L-11是如何激活JAK2/STAT3信號(hào)的具體機(jī)制仍不明確。近來有研究表明IL-6家族（包括白血病抑制因子、IL-6、IL-11、抑瘤素M、睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子等）可通過結(jié)合其共同受體gp130激活JAK/STAT通路以促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)過IL-11處理的SCs中g(shù)p130表達(dá)明顯上調(diào)。因此我們認(rèn)為IL-11可通過結(jié)合gp130激活JAK2/STAT3信號(hào)通路以促進(jìn)SCs中PMP22的表達(dá)。

PMP22是一種由SCs分泌的糖蛋白四聚體，是構(gòu)成外周神經(jīng)髓鞘的重要組成部分。盡管PMP22在髓鞘中含量豐富，但其生理作用尚未完全闡明。作為髓鞘形成過程中的重要部分，小鼠出生后和神經(jīng)再生的過程中PMP22含量會(huì)明顯上調(diào)[17]。研究顯示PMP22基因缺陷與許多遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)病變有關(guān)，如腓骨肌萎縮癥1A型、遺傳性壓力敏感性周圍神經(jīng)病變等[18]。Amici等[19]研究發(fā)現(xiàn)PMP22可與整合α6β4、層粘連蛋白形成復(fù)合體參與SCs與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，敲除IL-11受體gp130基因也將導(dǎo)致小鼠外周神經(jīng)髓鞘退化[10]。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出IL-11很有可能通過gp130/JAK2/STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)SCs中PMP22的表達(dá)進(jìn)而形成和穩(wěn)定外周神經(jīng)髓鞘。

早期研究證實(shí)cAMP和microRNA-29a分別可以在轉(zhuǎn)錄層面和轉(zhuǎn)錄后層面調(diào)節(jié)PMP22的表達(dá)[20]。但這兩種調(diào)節(jié)過程與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。坐骨神經(jīng)橫斷后，背跟神經(jīng)節(jié)中IL-11 mRNA和IL-1的含量在1 d之內(nèi)快速升高，在隨后的1～2周內(nèi)逐漸降低[8,21]；Sheu等[22]發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)斷端的近端和遠(yuǎn)端STAT3的磷酸化作用也在1 d之內(nèi)達(dá)到峰值，并且持續(xù)時(shí)間超過2周；而PMP22 mRNA含量在神經(jīng)損傷后則迅速下降，1周后逐漸上升[23]。因此IL-11可能是通過gp130/JAK2/STAT3信號(hào)通路參與PMP22在外周神經(jīng)損傷后期表達(dá)的上調(diào)，但關(guān)于外周神經(jīng)損傷后PMP22表達(dá)迅速下降的機(jī)制尚不明確。關(guān)于IL-11和gp130/JAK2/STAT3信號(hào)通路在外周神經(jīng)再生中的具體作用仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究證實(shí)IL-11可通過gp130/ JAK2/STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)SCs中PMP22的表達(dá)。如果該通路在生物體內(nèi)的髓鞘形成過程中也具有重要作用，則可將gp130作為藥物靶點(diǎn)[24]，研制新型藥物調(diào)控gp130的信號(hào)以提高治療外周神經(jīng)髓鞘病變的效果。同樣，在SCs移植修復(fù)神經(jīng)損傷的治療中，也可將gp130/JAK2/STAT3作為關(guān)鍵通路，以調(diào)控髓鞘的形成。

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（2016-05-11收稿）

IL-11 enhances expression of PMP22 in cultured Schwann cells via gp130/JAK2/STAT3 signaling pathway

GUO Wei,LI Yan,DUAN Hui-quan,SUN Chao,FENG Shi-qing,XU Yun-qiang
（Department of Orthopaedics,General Hospital,Tianjin Medical University，Tianjin 300052，China）

Objective:To examine the effect of IL-11 on the expression of myelin proteins in cultured Schwann cells.Methods：Schwann cells were cultured and purified from sciatic nerves of adult Wistarrats.IL-11 was used to treat purified Schwann cells.The expression level of myelin proteins was examined with Real time RT-qPCR and Western boltting.Results：IL-11 significantly increased the expression level of PMP22 in Schwann cells,but not those of MPZ and MBP.And this effect was significantly inhibited by AG490,anspecificinhibitor of JAK.And the levels of JAK2 and STAT3 phosphorylation were significantly increased in the presence of IL-11 stimulated Schwann cells compared with the absence of IL-11,which was accompanied with the up-regulation of gp130.Conclusion：IL-11 can enhance the production of PMP22 in Schwann cells via gp130/JAK2/STAT3 signaling pathway and thus may contribute to myelination.

interleukin-11;Schwann cells;PMP22;JAK2/STAT3 signaling pathway;rat

R68

A

1006－8147（2016）06-0478-05

郭巍（1989-），男，碩士在讀，研究方向：髓鞘再生；通信作者：徐云強(qiáng)，E-mail:docxu@sina.com。