孫建華，曲曉軍，王金英，于沖，夏海華，原韜，潘鈺，姜宏宇，于麗萍

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150020）

HW236-5發(fā)酵產(chǎn)品
——納豆激酶的酶學(xué)特性研究

孫建華，曲曉軍，王金英，于沖，夏海華，原韜，潘鈺，姜宏宇，于麗萍

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150020）

本次試驗所用納豆激酶是由本所分離并命名的HW236-5納豆芽孢桿菌，發(fā)酵大豆經(jīng)提取分離獲得，主要對納豆激酶的酶學(xué)特性進行研究。采用SDS-PAGE法以及Zeta電位法分別測得納豆激酶的分子量為28 kDa，等電點為8.58，納豆激酶的酶活為62520 U/g。納豆激酶在不同的加熱溫度時，溫度越高，其酶活越低。NaCl在濃度低于1.35 mol/L時，對納豆激酶的酶活起到促進作用，但是高于此濃度時，納豆激酶的酶活明顯受到了抑制。

HW236-5納豆芽孢桿菌；納豆；納豆激酶

納豆激酶最早來源于日本的一種傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品納豆，它是由275個氨基酸組成的單鏈多肽的絲氨酸蛋白酶，其酶活性質(zhì)容易變性失活［1］。1987年，由日本的須見洋行［2］等人發(fā)現(xiàn)并命名。其實納豆是起源于中國傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品——豆豉，后被僧人傳入日本［3］。因為它是來源于傳統(tǒng)食品中的一種藥物，并且其毒副作用小，因而具有廣闊的開發(fā)前景并極有可能成為新一代的溶栓藥物［4，5］。但納豆激酶的缺點也限制了其發(fā)展，比如納豆激酶的純酶穩(wěn)定性差、容易失活、不利于儲存以及運輸?shù)龋识鹑藗儗ζ涿笇W(xué)特性的研究［6，7］。

本次試驗主要是研究本單位分離自納豆的納豆芽孢桿菌B.Subtlis HW236-5,經(jīng)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心鑒定并保藏，發(fā)酵大豆［3］提取的納豆激酶在不同條件下的酶學(xué)穩(wěn)定性，采用纖維蛋白-瓊脂糖平板法測定納豆激酶的酶活。在不同加熱溫度、pH、加熱時間以及不同NaCl離子強度時，對納豆激酶酶活穩(wěn)定性的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

納豆激酶：以黑龍江省科學(xué)院微生物研究所篩選的納豆芽孢桿菌HW236-5發(fā)酵大豆經(jīng)提取獲得。

試劑：實驗涉及的試劑均采用分析純、生化純。

設(shè)備：電子分析天平、電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺等。

1.2 方法

1.2.1 納豆激酶的基礎(chǔ)性質(zhì)

納豆激酶的分子量及等電點。

A.分子量的測定：采用SDS-PAGE電泳法

SDS-PAGE電泳法操作步驟：

a.將模具準(zhǔn)備好，并用適量的水溶液檢測其是否漏水，如果漏水，做相應(yīng)的調(diào)整至不漏水，然后進行下面的操作。

b.在小燒杯中配制所需濃度的分離膠，配置溶液所需體積按表1，用玻璃棒攪拌使溶液混勻，用移液槍吸取適量的凝膠溶液，并小心加入到不漏水的模具內(nèi)，避免氣泡的出現(xiàn)。加入分離膠結(jié)束后，并在其上層加入一層水或者乙醇，既隔絕空氣又消除氣泡，保證凝膠表面的平整。

c.待分離膠凝結(jié)后，在模具上層插入梳子，并配制濃縮膠，配置溶液所需體積按表1，輕輕攪拌混勻后，加至分離膠的上層。

d.將凝膠模具放入到電泳槽內(nèi)備用，并將配好的電泳緩沖液先加入到內(nèi)部的電泳槽中，使其沒過最低的那個平板，再往外部電泳槽中倒入電泳緩沖液，從而使所制得的凝膠無論是加樣的部位，還是遠離加樣的部位，都能夠浸泡在電泳緩沖溶液中。

e.將納豆激酶樣品與配置好的放置在4℃冰箱中備用的樣品緩沖液按1∶5的比例，在帶蓋的試管中混合，然后置于沸水浴中，煮沸5 min后取出，待混合液冷卻后，取10 μL混合樣品加入到樣品位置處。

f.通電，直至樣品線跑至凝膠的底端為止。

g.將凝膠取下，放入培養(yǎng)皿中，倒入染色液，染色1.5 h；最后進行脫色處理。

h.將脫色處理后的凝膠，用凝膠成像儀或者相機進行拍照記錄。

表1 SDS-不連續(xù)體系凝膠配置Tab.1 SDS-discontinuous gel system prepared

B等電點的測定：采用Zeta電位測定法

納豆激酶的等電點在8.6±0.3的范圍內(nèi)，故用酸堿溶液對納豆激酶溶液調(diào)節(jié)pH，使pH的范圍在8.4～8.9，并測定每一個pH下的Zeta電位。等電點為Zeta電位為零的點。

1.2.2 納豆激酶的酶學(xué)特性研究

納豆激酶酶活性質(zhì)的測定是參照Astrup法制備纖維蛋白——瓊脂糖平板，并依據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生部WS2011（X2005）95》中“尿激酶瓊脂糖-纖維蛋白平板法”進行測定。

1.2.2.1 試劑配制

A.磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mmol/LpH=7.75）。取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O），磷酸二氫鈉（NaH2PO4· 2H2O）混合制備0.01 mol/L、pH=7.75的磷酸鹽緩沖溶液。

B.工作液。取磷酸鹽緩沖液（0.01 mmol/L）與0.9%氯化鈉（即生理鹽水）按照1:17的體積比混勻即可。

C.1%的瓊脂糖溶液。取瓊脂糖1 g，加工作液100 mL，放置在微波爐中，用中火加熱3 min后，即可溶解得到瓊脂糖溶液。

D.纖維蛋白原溶液。取纖維蛋白原148mg，加工作液配成0.3%的溶液，便為纖維蛋白原溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

E.凝血酶溶液。取凝血酶20 BP單位（5.24 mg），加生理鹽水20 mL，配成1 BP/mL的凝血酶溶液。

1.2.2.2 纖維蛋白——瓊脂糖平板的制備

取經(jīng)過微波爐加熱溶解后的瓊脂糖溶液16.2 mL置于燒杯中，放入45℃水浴中保溫，同時將纖維蛋白原液16.2 mL、凝血酶液1.3 mL亦在45℃水浴中加熱和保溫，待溫度平衡后，將三種液體混勻，然后迅速倒入平皿中，室溫下放置30 min凝固即成。之后儲存于4℃層析柜中待用，并在使用之前對平板進行打孔處理，用于納豆激酶的酶活測定。

1.2.2.3 納豆激酶活性測定方法

用移液槍吸取經(jīng)過處理的酶液10 μL滴在平板上，加蓋，在恒溫培養(yǎng)箱37℃中培育18 h，到時間后，取出平板，用千分尺測量平板溶解圈的兩垂直直徑，以垂直兩直徑的乘積為酶的酶活。

1.2.2.4 納豆激酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)纖維蛋白——瓊脂糖平板測定方法，以尿激酶作為標(biāo)準(zhǔn)品，并以其相應(yīng)的濃度作為橫坐標(biāo)，經(jīng)游標(biāo)卡尺測量的相對直徑的乘積，所得的面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.5 納豆激酶的最適反應(yīng)溫度

用0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.4）配制一定酶活力的納豆激酶溶液。將酶液分別置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃的水浴中保溫30 min，用纖維蛋白-瓊脂糖平板法測定其相對酶活。并以25℃的酶活力為100%，其他溫度下的酶活與其比值為該溫度下的相對酶活。

1.2.2.6 納豆激酶的最適反應(yīng)pH

用磷酸——檸檬酸緩沖液（pH=3~8）、碳酸鈉緩沖液（pH=9~10）及NaOH溶液（pH=11）配制酶液（pH值取的間隔為0.5），并在溫度為40℃的水浴中保溫30 min，然后用纖維蛋白-瓊脂糖平板法測定其相對酶活。以其中最高酶活時的pH值相對應(yīng)的納豆激酶的酶活力為100%，其余pH下的酶活與其的比值為該pH下的相對酶活。

1.2.2.7 納豆激酶的保溫時間穩(wěn)定性

用pH為6.5的緩沖溶液配置相應(yīng)濃度的納豆激酶溶液，在40℃的水浴中保溫不同的時間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min)，然后用纖維蛋白-瓊脂糖平板法測定其相對酶活。以其中最高的殘余酶活為相對酶活100%，其他時間的殘余酶活與其的比值為該時間下的相對酶活。

1.2.2.8 NaCl濃度對納豆激酶酶學(xué)性質(zhì)的影響

在40℃水浴中、溶液為pH=6.5以及加熱時間為60 min條件下，在酶的水溶液中添加不同濃度的NaCl，測定納豆激酶在離子強度分別為0.15 mol/L、0.55 mol/L、0.95 mol/L、1.35 mol/L、1.75 mol/L時的酶活。以不含金屬的相應(yīng)納豆激酶溶液的殘余酶活為相對酶活100%，其他相應(yīng)的含有不同濃度NaCl的納豆激酶溶液的殘余酶活與其的比值為該NaCl濃度下的相對酶活。

2 結(jié)果與分析

納豆激酶的分子量：

圖1 納豆激酶的電泳圖Fig.1 The electrophore gram of natto kinase

將制備的納豆激酶樣品，經(jīng)過Sephadex G-75凝膠層析純化后，利用SDS-PAGE法測定納豆激酶的分子量，并使所得到的樣品與凝膠中的蛋白標(biāo)品進行比較，從而得到樣品的分子量。實驗結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，第一條條帶的是蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，分別顯示不同的分子量，從下往上依次為14.4 kDa、22 kDa、31 kDa、43 kDa、66.2 kDa、97.4 kDa。所得到的納豆激酶的條帶在22 kDa～31 kDa。經(jīng)測定納豆激酶的分子量為28 kDa。

納豆激酶等電點，納豆激酶在不同pH下的Zeta電位，并選擇zeta電位接近零時的pH，進行相應(yīng)的細分，以能得到Zeta電位為0時的pH，該pH即為納豆激酶的等電點。實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 納豆激酶的Zeta電位圖Fig.2 The picture of zeta about nattokinase

由圖2可知，在pH=8.58時，納豆激酶所帶的電荷為零，故此納豆激酶的等電點為8.58。

納豆激酶的酶活測定，根據(jù)纖維蛋白-瓊脂糖平板測定方法，以尿激酶作為標(biāo)準(zhǔn)品，并以其相應(yīng)的濃度作為橫坐標(biāo)，經(jīng)游標(biāo)卡尺測量溶解圈的相對直徑，并以兩直徑的乘積為縱坐標(biāo)，繪制酶活的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖3所示。

圖3 納豆激酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3Standard of nattokinase's enzyme activity concentration

得到納豆激酶酶活的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：y=1.5695 x+157.06，其中R2=0.9805。表明此方法用于測定納豆激酶的活性，在濃度為20~100 U/mL時，線性關(guān)系良好。

由纖維蛋白一瓊脂糖平板法測定樣本中的納豆激酶的酶活，經(jīng)由游標(biāo)卡尺測量后得到納豆激酶的溶解圈面積為255.19 mm2，并由圖3中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算可得，樣品中納豆激酶的基本酶活為62 520 U/g。

以25℃時的納豆激酶的殘余活性為相對酶活100%，其他溫度下的納豆激酶的殘余酶活與之的比值為該溫度下的相對酶活。實驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 溫度對納豆激酶酶學(xué)性質(zhì)的影響Fig.4 The temperature influence on nattokinase's enzyme activity

由圖4可知，隨著溫度的逐漸上升，納豆激酶的相對酶活是逐漸下降的趨勢。在低溫的環(huán)境下，納豆激酶的酶活受到的影響較小，穩(wěn)定性能夠得到較好的保存；且納豆激酶的酶活在40℃~55℃下降趨勢明顯；高溫條件下，納豆激酶的酶活會完全失活，喪失了其溶解血栓的能力。故而，在對納豆激酶的儲存或者使用時，都應(yīng)該控制溫度在40℃以下，從而使納豆激酶能夠有較高的酶活。

不同pH對納豆激酶酶活性質(zhì)的影響，實驗條件為：水浴溫度40℃、加熱時間30 min、pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0。并以其中最高的納豆激酶殘余酶活為相對酶活100%，其他pH下的納豆激酶殘余酶活與之的比值為該pH下的相對酶活。實驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 pH對納豆激酶酶學(xué)性質(zhì)的影響Fig.5The pH influence on nattokinase's enzyme activity

由圖5可知，隨著pH值的增加，納豆激酶的相對酶活會逐漸升高然后再下降，最后納豆激酶的相對酶活幾乎為零，也表示納豆激酶在此pH的區(qū)間內(nèi)，完全失去活性。納豆激酶的最適pH為6.5，并且其可以在pH=4.5~8.0時維持較高的酶活。

溫度對酶活的影響具有不可逆性，在高溫下失活變性后，酶的結(jié)構(gòu)被破壞。酶在pH=6.5、水浴溫度40℃下進行保溫處理，保溫的時間對酶活穩(wěn)定性的影響如圖6。

圖6 保溫時間對納豆激酶酶活性質(zhì)的影響Fig.6 The heat-time influence on nattokinase's enzyme activity

在保溫時間較短時，對酶活起到了激發(fā)的作用，促使酶活逐漸上升；當(dāng)保溫時間過長，酶活隨著時間的延長而逐漸降低。故在以后對酶進行應(yīng)用研究時，盡量控制酶反應(yīng)的時間在60 min以內(nèi)，以保證在反應(yīng)期間酶活能夠保持較高的活性。

不同NaCl濃度對納豆激酶酶活穩(wěn)定性的影響，實驗條件是：加熱溫度40℃、加熱時間為60 min，以不含金屬的相應(yīng)納豆激酶溶液的殘余酶活為相對酶活100%，其他相應(yīng)的含有不同濃度NaCl的納豆激酶溶液的殘余酶活與其的比值為該NaCl濃度下的相對酶活，實驗結(jié)果如圖7所示。

圖7 NaCl濃度對納豆激酶酶學(xué)性質(zhì)的影響Fig.7The concentration of Na+influence on nattokinase's enzyme activity

由圖7可知，隨著NaCl溶液濃度的逐漸加大，納豆激酶的相對酶活呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。低濃度的NaCl對納豆激酶的活性有相應(yīng)的促進作用；但當(dāng)濃度較高時，又會對納豆激酶的相對酶活有一定的抑制作用。當(dāng)NaCl的濃度低于1.35 mol/L時，納豆激酶的相對酶活都有相應(yīng)程度的升高，尤其是當(dāng)NaCl的濃度為0.95 mol/L時，納豆激酶的相對酶活為最高，其相對酶活為127.87%，激活作用相對明顯；但當(dāng)NaCl的濃度高于1.35 mol/L時，納豆激酶的相對酶活受到一定程度的抑制，從而導(dǎo)致其相對酶活降低。

3 結(jié)論

通過本次試驗研究，測得經(jīng)菌號HW236-5的納豆芽孢桿菌發(fā)酵大豆提取的納豆激酶的酶學(xué)特性，納豆激酶的分子量為28 kDa，等電點為8.58，酶活為62 520 U/g；納豆激酶的酶活穩(wěn)定性隨著溫度的升高而逐漸降低；并且當(dāng)溫度足夠高時，納豆激酶會徹底失活，納豆激酶應(yīng)該在40℃以下進行儲存以及應(yīng)用；納豆激酶在中性pH時，能保持較高的活性；但當(dāng)pH值偏向酸或者堿的情況下，納豆激酶的相對活性會相應(yīng)降低。當(dāng)pH=6.5~8.0時，納豆激酶的相對酶活相對較高；但當(dāng)pH＜6.5或者pH＞8.0時，納豆激酶的酶活急劇下降；納豆激酶的酶活穩(wěn)定性隨著保溫時間的延長，會受到一定的損失；NaCl在低濃度時對納豆激酶的酶活起到相應(yīng)的促進作用；但在高濃度時，其對納豆激酶的酶活起到一定的抑制作用。人體中的NaCl濃度為0.155 mol/L，處于對納豆激酶的酶活起促進作用的濃度范圍內(nèi)。因此，在使用或者食用納豆激酶時，應(yīng)該注意對NaCl濃度的控制，因為當(dāng)NaCl濃度超過1.35 mol/L時，對納豆激酶的酶活是起到相應(yīng)的抑制作用的，故應(yīng)合理控制NaCl濃度的大小，從而使酶能最大化的發(fā)揮其作用。

［1］張玉巖.多功能保健食品納豆的營養(yǎng)價值［J］.湖南農(nóng)機（學(xué)術(shù)版），2013，40（2）：237.

［2］［日］須見洋行，馬場健史，岸丁明.納豆中のづロウキナゼ活性化酵素と血栓溶解能［J］.日本食品科學(xué)工學(xué)會志，1996，43（10）：46-49.

［3］黑龍江省科學(xué)院應(yīng)用微生物研究所.發(fā)酵大豆-納豆及其成分的保健功能［M］.哈爾濱：黑龍江人民出版社，2005.

［4］刁建中，陳桂光，馬波，等.納豆激酶的最新研究進展［J］.輕工科技，2012，160（3）：7-8.

［5］關(guān)海琳.藥食兩用納豆激酶的研究進展［J］.生物技術(shù)世界，2014，（02）：82.

［6］趙仲麟，李淑英，聶瑩，等.納豆激酶生產(chǎn)菌的篩選及發(fā)酵納豆特性研究［J］.生物技術(shù)通報，2015，31（003）：161-164.

［7］Kwon E Y，Kim K M，Kim M K，et al.Production of nattokinase by high cell density fed-batch culture of Bacillus subtilis［J］.Bioprocess and Biosystems Engineering，2011，34（7）：789-793.

Research of enzymology characteristics of natto kinase

SUN Jian-Hua,QIU Xiao-jun,WANG Jin-Ying，YU Chong，XIA Hai-Hua,YUAN Tao，PAN Yu，JIANG Hong-Yu,YU Li-Ping
（1.Iistitute of Microbiology,Heilongjiang Academy of ciences,Harbin 150010,China;
2.Iistitute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences,Haerbin 150020,China)

The main study of this experiment focuses on enzymology characteristics of natto kinase,by use of Bacillus natto HW236-5 isolated and named by Institute of Microbiology.Bacillus natto HW236-5 was obtained from extraction and separation of fermented soybean.By methods of SDS-PAGE and Zeta Potentiometry,it respectively measured that the molecular weight of natto kinase is 28 kDa,isoelectric point is 8.58, enzyme activity of natto kinase is 62520 U/g.When natto kinase is in different temperature,it finds out that the higher is the temperature,the lower is its enzyme activity.When NaCl concentration is lower than 1.35 mol/L,it plays promoting effects on enzyme activity of natto kinase.On the contrary,it is higher than 1.35 mol/L,the enzyme activity of natto kinas is inhibited.

Bacillus natto HW236-5；Natto；Nattokinase

Q55

A

1674-8646（2016）01-0004-04

2015-10-20

兼具整腸、調(diào)脂及調(diào)節(jié)免疫力的納豆軟膠囊保健食品的研制（KY14BSJH07）

孫建華（1961-），女，黑龍江哈爾濱人，學(xué)士，研究員，主要從事醫(yī)學(xué)微生物、免疫制劑及保健食品研究。

于麗萍（1962-），女，黑龍江大慶人，學(xué)士，高級工程師，主要從事微生物研究及科研管理工作。