柳云恩, 劉 穎, 史秀云, 劉學(xué)磊, 佟 周, 佟昌慈, 張玉彪, 施 琳,叢培芳, 金紅旭, 侯明曉

沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)部 全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實(shí)驗(yàn)室 遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110016

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·災(zāi)難醫(yī)學(xué)·

爆震沖擊波對(duì)大鼠腦組織炎癥因子IL-1β、IL-6及IL-10表達(dá)影響

柳云恩, 劉 穎, 史秀云, 劉學(xué)磊, 佟 周, 佟昌慈, 張玉彪, 施 琳,叢培芳, 金紅旭, 侯明曉

沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)部 全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實(shí)驗(yàn)室 遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110016

目的 觀察顱腦爆震傷后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-10的變化，探討顱腦爆震傷后相關(guān)因子與時(shí)間的關(guān)系及損傷機(jī)制。方法 將健康雄性SD大鼠56只，隨機(jī)分為模型組(n=8)和對(duì)照組(n=48)。采用Western-blot、ELISA和Real-time PCR方法，測(cè)定傷后3、6、12、24、48、72 h大鼠血清及腦組織中IL-1β、IL-6以及IL-10的含量和mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組血清及腦組織各個(gè)時(shí)間點(diǎn)炎癥因子IL-1β、IL-6的含量以及mRNA的表達(dá)均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；抑炎因子IL-10含量以及mRNA的表達(dá)先明顯降低后恢復(fù)正常，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 IL-1β、IL-6以及IL-10等炎癥因子的變化有助于判斷和治療顱腦爆震傷。

顱腦爆震傷； 白細(xì)胞介素-1β； 白細(xì)胞介素-6； 白細(xì)胞介素-10

DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2016.06.05

隨著強(qiáng)殺傷力爆炸性武器的廣泛使用、恐怖襲擊的增多和某些惡性事故頻繁出現(xiàn)，爆震傷在現(xiàn)代社會(huì)中極其常見(jiàn)并引起國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注[1]。爆震產(chǎn)生的沖擊波能夠直接或間接作用于機(jī)體而引發(fā)各種組織器官損傷，其中顱腦爆震傷(blast-related traumatic brain injury，bTBI)居于首位[2]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)爆震傷已經(jīng)進(jìn)行了較為系統(tǒng)和深入的研究，但有關(guān)爆震傷中顱腦損傷的致傷特點(diǎn)及致傷機(jī)制報(bào)道則較少[3-4]。因此，本研究通過(guò)建立顱腦爆震傷大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織中IL-1β、IL-6和IL-10的變化，探討炎癥因子在顱腦爆震傷中的作用，旨在為顱腦爆震傷的損傷特點(diǎn)及機(jī)制提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 健康成年雄性SD大鼠56只，體質(zhì)量(200±10)g，由沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科提供。動(dòng)物自由飲食、飲水(飼料購(gòu)自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司)，清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

鼠抗GAPDH單克隆抗體系武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，兔抗IL-1β多克隆抗體、兔抗IL-6多克隆抗體、兔抗IL-10多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG二抗及HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司；Western Blot一抗稀釋液購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所；IL-1β、IL-6和IL-10 ELISA 試劑盒購(gòu)自法國(guó)Diaclone公司；IL-1β、IL-6、IL-10和β-actin引物由上海Sangon公司合成。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將56只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組。模型組根據(jù)傷后時(shí)間又分為6個(gè)亞組，每亞組8只。傷后時(shí)間點(diǎn)分別為3、6、12、24、48、72 h。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立 模型組：采用爆震沖擊裝置建立顱腦損傷大鼠動(dòng)物模型。大鼠稱(chēng)重麻醉后放置于爆震傷裝置上，通過(guò)保護(hù)管保護(hù)大鼠胸腹部，頭部外露。下方炮筒壓力達(dá)到0.12 MPa時(shí)鋁膜爆破，超壓波顯示壓力為0.55 MPa，大鼠飛起高度為80～150 cm。對(duì)照組：不致傷，僅作為腦組織中IL-1β、IL-6和IL-10測(cè)定的對(duì)照。

1.2.3 Western-blot檢測(cè)腦組織IL-1β、IL-6以及IL-10的含量 分別于顱腦爆震傷后3、6、12、24、48、72 h取大鼠腦組織。提取蛋白后，將蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，于含3%牛血清白蛋白的TBST(0.05%Tween-20的TBS)中室溫封閉1 h，分別用兔抗iNOS、IL-1β多克隆抗體以及鼠抗GAPDH單克隆抗體4℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗3次，分別用HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG二抗，室溫孵育1 h。TBST漂洗3次，用ECL Western印跡試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

1.2.4 ELISA檢測(cè)血清中IL-1β、IL-6以及IL-10的含量 分別于顱腦爆震傷后3、6、12、24、48、72 h取血液，分離血清后置入-80℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)將血清在冰浴上融化，加入到抗原包被的96孔板中，孵育，甩干。加入Detection A溶液，孵育30 min，甩干洗板，再加入Detection B溶液，孵育30 min，甩干洗板，顯色。檢測(cè)每個(gè)孔的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每個(gè)血清中所含IL-1β、IL-6以及IL-10的濃度。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)IL-1β、IL-6以及IL-10 mRNA的表達(dá) 利用Trizol試劑提取大鼠腦組織總RNA。取4.0 μg總RNA，65℃變性5 min，經(jīng)AMV反轉(zhuǎn)錄酶42℃反轉(zhuǎn)錄30 min，合成cDNA。取cDNA產(chǎn)物5 μl，依次加入10×PCR緩沖液，上、下游引物各50.0 pmol、dNTP 0.2 mmol/L、MgCl 22.0 mmol/L以及TaqDNApoly-merase 1 U。以下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：94℃ 3 min，94℃ 45 s，52℃45 s(IL-1β)，50℃ 45 s(IL-6)，51℃ 45 s(IL-10)，55℃ 45 s(β-actin)，72℃ 45 s。進(jìn)行30次循環(huán)后進(jìn)一步延伸，72℃ 5 min。根據(jù)GenBank中IL-1β、IL-6和IL-10的cDNA序列，用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5設(shè)計(jì)特異性引物。見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1 Western-blot檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組大鼠腦組織中炎癥因子IL-1β和IL-6表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，IL-1β在6 h時(shí)達(dá)到高峰并持續(xù)至48 h，隨后濃度稍有降低；IL-6在24 h時(shí)開(kāi)始升高，48 h時(shí)達(dá)到最高；抑炎因子IL-10的表達(dá)降低，48 h時(shí)開(kāi)始恢復(fù)。見(jiàn)圖1。

表1 特異性引物設(shè)計(jì)

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)大鼠腦組織中IL-1β、IL-6和IL-10表達(dá)水平(與對(duì)照組比較，①P<0.05)

2.2 ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中炎癥因子IL-1β和IL-6表達(dá)增高。其中，IL-1β在6 h時(shí)達(dá)到高峰并持續(xù)至48 h，隨后濃度稍有降低；IL-6則在3 h時(shí)開(kāi)始升高，24 h達(dá)到最高；抑炎因子IL-10表達(dá)降低，24 h時(shí)開(kāi)始恢復(fù)。見(jiàn)表2。

2.3 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果 模型組大鼠腦組織中IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，IL-1β在6 h時(shí)達(dá)到高峰并持續(xù)至48 h，隨后濃度稍有降低；IL-6在3 h時(shí)開(kāi)始升高，24 h達(dá)到最高；抑炎因子IL-10的mRNA表達(dá)則明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，24 h時(shí)開(kāi)始恢復(fù)。見(jiàn)表3。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血清中IL-1β、IL-6以及IL-10的含量比較

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05

表3 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織中IL-1β、IL-6以及IL-10 的mRNA表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05

3 討論

顱腦爆震傷的發(fā)生逐年增多，其病因復(fù)雜，致死率高，除具有嚴(yán)重的原發(fā)性損傷外，繼發(fā)性炎癥損傷已成為顱腦爆震傷預(yù)后較差的重要原因之一[5]。IL-1β、IL-6和IL-10作為機(jī)體內(nèi)重要的炎癥因子和抑炎因子，常參與機(jī)體炎癥和創(chuàng)傷反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。尤其有關(guān)異常釋放的炎性因子參與腦損傷的發(fā)生和修復(fù)的研究，目前已得到廣泛的重視[6-7]。因此，本研究通過(guò)測(cè)定傷后不同時(shí)間點(diǎn)血清及腦組織中IL-1β、IL-6和IL-10的變化，進(jìn)一步明確各因子在顱腦爆震傷中的作用。本研究結(jié)果表明，不同時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠體內(nèi)IL-1β和IL-6含量均明顯升高,IL-10的含量明顯降低后恢復(fù)。各細(xì)胞因子mRNA的變化趨勢(shì)與蛋白水平一致，這進(jìn)一步證明了顱腦爆震傷發(fā)生時(shí)相關(guān)炎癥因子的變化。

促炎性細(xì)胞因子IL-1β主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是一種多效性的細(xì)胞因子，腦中觸發(fā)炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)之一，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元等活化表達(dá)[8]。在生理?xiàng)l件下，腦內(nèi)IL-1β水平很低，腦損傷后IL-1β表達(dá)上調(diào)，除增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞的粘附作用,導(dǎo)致了腦血管結(jié)構(gòu)和血腦屏障的破壞,從而進(jìn)一步加劇繼發(fā)性腦損害的發(fā)生，IL-1β還可通過(guò)激活磷脂酶A2，使磷脂過(guò)度降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷[9]。IL-1β與細(xì)胞表面受體結(jié)合,激活炎癥信號(hào)通路,最終激活核因子KB(NF-kB)，在腦損傷的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中同樣起到重要的作用[10]。急性顱腦損傷時(shí)，促炎細(xì)胞因子IL-1β激活后能夠促使機(jī)體IL-6的釋放,后者正反饋于單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和多形粒細(xì)胞(PMN),進(jìn)一步產(chǎn)生更多的各種炎癥介質(zhì)[11]。

IL-6是一種由184個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，由單核細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞等多種有核細(xì)胞產(chǎn)生。作為顱腦爆震傷發(fā)生后早期出現(xiàn)的一種細(xì)胞炎癥因子，IL-6的異常表達(dá)可出現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷及感染性疾病中[12]。IL-6激活并介導(dǎo)多種細(xì)胞因子的相互作用，能夠?qū)е虏⒓又乩^發(fā)性腦損害。機(jī)體損傷發(fā)生炎癥反應(yīng)產(chǎn)生IL-6，能夠誘導(dǎo)多種細(xì)胞合成和分泌多種急性期蛋白，促進(jìn)感染時(shí)中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生、活化、促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化及產(chǎn)生免疫球蛋白[13]。損傷發(fā)生在早期神經(jīng)系統(tǒng)及外周血中，IL-6含量明顯升高，還會(huì)促使炎癥細(xì)胞大量積聚在病變區(qū)域，導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，造成腦實(shí)質(zhì)的損傷[14]。此外，IL-6還可促進(jìn)細(xì)胞鈣離子內(nèi)流，鈣超載引起細(xì)胞一系列生化反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞崩解。本研究中IL-6的表達(dá)升高，與相關(guān)腦損傷的研究結(jié)果一致[15]。

IL-10是一種重要的抗炎細(xì)胞因子,主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞分泌。其通過(guò)抗炎和抗凋亡能夠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16]。有研究表明，IL-10能夠在分子和轉(zhuǎn)錄水平抑制細(xì)胞合成釋放IL-1β、IL-6以及腫瘤壞死因子(TNF)等促炎因子[17]。此外，IL-10能通過(guò)下調(diào)單核細(xì)胞表面主要組織相容性抗原Ⅱ的表達(dá)，降低其抗原呈遞作用，下調(diào)T淋巴細(xì)胞活性，抑制炎性細(xì)胞的激活、遷移和粘附[18]。本研究中，IL-10的表達(dá)降低后逐漸恢復(fù)正常，這說(shuō)明顱腦爆震傷對(duì)抗炎介質(zhì)產(chǎn)生了抑制作用。檢測(cè)IL-10的表達(dá)有助于臨床顱腦爆震傷的診斷。

綜上所述，顱腦爆震傷后機(jī)體瞬間產(chǎn)生嚴(yán)重應(yīng)激反應(yīng)。IL-1β、IL-6以及IL-10等炎癥因子參與顱腦爆震傷的發(fā)生和發(fā)展，且表達(dá)量與損傷時(shí)間具有相關(guān)性。因此，IL-1β、IL-6和IL-10對(duì)顱腦爆震傷的診斷、治療及預(yù)后中有一定意義，較早抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，干預(yù)IL-1β、IL-6以及IL-10等的表達(dá)可能成為爆震導(dǎo)致腦損傷的有效治療方法之一。

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Detonation shock wave in rat tissue inflammation factor influence on expression of IL-1β,IL-6 and IL-10

LIU Yun-en,LIU Ying,SHI Xiu-yun,LIU Xue-lei,TONG Zhou,TONG Chang-ci,ZHANG Yu-biao,SHI Lin,CONG Pei-fang,JIN Hong-xu,HOU Ming-xiao

(Department of Emergency Medicine,Laboratory of PLA Wound and Trauma Center,The General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

Objective To explore the changes of IL-1β,IL-6 and IL-10 expression in rat brain at different time points after blast injury and explore the possible mechanism.Methods A total of 56 healthy male rats were randomly divided into the model group(n=8)and the normal control group(n=48).After 3 hours,6 hours,12 hours,24 hours,48 hours and 72 hours of the injury,Western-blot,ELISA and Real-time PCR methods were used for determination of IL-1β,IL-6 and IL-10 content and expression changes of mRNA in rat serum and brain.Results Compared with normal control group,the expression of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 and mRNA were significantly increased in serum and brain tissue of model group(P<0.05);the expression of anti-inflammatory factor IL-10 and mRNA was reduced before 24 hours(P<0.05),and then significantly reduced back to normal.Conclusion The change of inflammatory factors of IL-1β,IL-6 and IL-10 may help determine and carry out treatment of craniocerebral blast injury.

Traumatic brain blast injury; Interleukin-1β; Interleukin-6; Interleukin-10

2014年總后衛(wèi)生部重大新上項(xiàng)目(AWS14L008)；2013年全軍十二五面上延續(xù)項(xiàng)目(CSY13J003)；遼寧省自然科學(xué)基金(201602771)

柳云恩(1979-)，男，遼寧葫蘆島人，主治醫(yī)師，博士

侯明曉，E-mail：houmingxiao188@163.com；金紅旭，E-mail：hongxuj@126.com

2095-5561(2016)06-0336-05

R651.1

A

2016-11-21