佟昌慈， 柳云恩， 劉 穎， 佟 周， 張玉彪， 施 琳， 叢培芳，史秀云， 劉學(xué)磊， 金紅旭， 侯明曉

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)部 全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實(shí)驗(yàn)室 遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110016

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·災(zāi)難醫(yī)學(xué)·

人工重組Clara細(xì)胞蛋白16對放射性肺炎及肺纖維化防護(hù)機(jī)制研究

佟昌慈， 柳云恩， 劉 穎， 佟 周， 張玉彪， 施 琳， 叢培芳，史秀云， 劉學(xué)磊， 金紅旭， 侯明曉

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)部 全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實(shí)驗(yàn)室 遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110016

目的 探討人工重組Clara細(xì)胞蛋白16(rhCC16)對放射性肺炎及肺纖維化的防護(hù)機(jī)制。方法 將30只SD大鼠隨機(jī)分成3組，對照組(n=10)、照射組(n=10)和rhCC16+照射組(n=10)。照射組和rhCC16+照射組均予單次全胸15 Gy劑量進(jìn)行照射。3組均取SD大鼠肺組織進(jìn)行HE、Masson染色；免疫組化、Western Blot及Real Time PCR檢測白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、Bax以及Bcl-2的表達(dá)；ELASA檢測血清中IL-6、TNF-α和TGF-β水平；Western Blot、Real Time PCR以及MTT驗(yàn)證rhCC16對大鼠肺泡上皮細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果 與對照組比較，照射組肺組織呈現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞滲出，纖維病變明顯，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞凋亡增多，IL-6、TNF-α以及TGF-β表達(dá)水平增高；rhCC16干預(yù)處理后病變現(xiàn)象明顯減輕，IL-6、TNF-α以及TGF-β的表達(dá)明顯降低。結(jié)論 rhCC16可以抑制輻射誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡以及纖維病變，對放射性肺炎及肺纖維化具有防護(hù)作用。

rhCC16； 放射性肺炎； 肺纖維化

DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2016.06.06

放射性肺炎及肺纖維化是指在放療過程中胸部部分正常的肺組織由于受到一定劑量的放射線照射而引起的放射性損傷。放射治療是廣泛應(yīng)用于肺部腫瘤的臨床治療方法。但是，其主要并發(fā)癥放射性肺炎和放射性肺纖維化嚴(yán)重影響放射治療的效果[1]。放射治療導(dǎo)致放射性肺損傷的機(jī)制尚不明確。近年來，有研究表明，以炎癥因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)為主的生物因子對于肺損傷的始動(dòng)和維持具有重要作用。炎癥反應(yīng)在放射性肺炎及肺纖維化過程中起重要作用[2-3]。目前IL-6，TNF-α，TGF-β等細(xì)胞因子被認(rèn)為是介導(dǎo)放射性肺炎和肺纖維化的重要介質(zhì)，其表達(dá)水平反映了放射性肺炎和肺纖維化的程度[2-4]。

Clara細(xì)胞是一種非纖毛上皮細(xì)胞，具有分泌功能，位于肺的細(xì)支氣管黏膜上，保護(hù)呼吸道，可以修復(fù)損傷的肺上皮細(xì)胞，清除呼吸道中的有害物質(zhì)[4]。Clara細(xì)胞蛋白16(Clara cell protein16，CC16)，作為Clara細(xì)胞主要分泌產(chǎn)物[5-6]，是一種多見于支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的組織特異性蛋白[6]。CC16作為評(píng)估肺上皮細(xì)胞通透性和完整性的生物標(biāo)志。當(dāng)肺組織損傷時(shí)，CC16在BALF中的含量下降，而氣血屏障的損壞則導(dǎo)致血漿CC16含量的增高[7-11]。CC16具有免疫抑制作用、抗炎作用等多種生物學(xué)功能，CC16基因缺失的大鼠肺組織更容易受到損害，炎癥反應(yīng)更強(qiáng)[12]。炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶磷脂酶A2(PLA2)通過分解磷脂導(dǎo)致生物膜的損傷，CC16可抑制PLA2的活性，從而抑制炎癥反應(yīng)，達(dá)到保護(hù)生物膜的作用[13]。另外，CC16可直接抑制白細(xì)胞介素-1(IL-1)、TNF-α、γ干擾素(IFN-γ)等多種炎癥因子的表達(dá)及其生物學(xué)活性[10-11,14]。有研究表明，CC16在慢性阻塞性肺病、哮喘等氣道炎癥中具有重要作用[15-16]，亦在多種因素導(dǎo)致的急性肺損傷中起重要作用[14,17-18]。因此，本研究通過建立人工重組CC16(rhCC16)處理放射性肺炎及肺纖維化的SD大鼠模型，檢測大鼠的病變程度，旨在驗(yàn)證rhCC16對放射性肺炎及肺纖維化的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人肺泡上皮細(xì)胞株HPAEpiC(美國ATCC公司)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco公司)；RNA提取試劑Trizol(美國Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄及SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TakaRa公司)。抗體：TGF-β(美國Cell signaling公司)，IL-6(美國Cell signaling公司)；Bax(美國Cell signaling公司)，TNF-α(美國Santa Cruz公司)；GAPDH(美國Gene script公司)；Bcl-2(美國Invitrogen公司)；二抗：HRP-山羊抗兔，山羊抗大鼠(中杉公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合成；MTT試劑盒(美國Gibco 公司產(chǎn)品)。rhCC16(上海星科生物科技有限公司)，SD大鼠30只，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，鼠齡26周，體質(zhì)量(200±20)g，健康清潔級(jí)。動(dòng)物自由飲食、飲水(飼料購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將30只成年健康SD大鼠隨機(jī)分為對照組、照射組和rhCC16+照射組，每組各10只。對照組給予尾靜脈注射生理鹽水；照射組通過直線加速器全胸X線照射，照射劑量為單次15 Gy，劑量率為2 Gy/min，照射距離為1.1 m，時(shí)間為1 min，同時(shí)給予生理鹽水注射；rhCC16+照射組給予照射組相同劑量的X線，同時(shí)在照射前后7 d給予rhCC16(10 mg/kg)尾靜脈靜脈注射。各組大鼠正常飼養(yǎng)，每天進(jìn)行動(dòng)物稱重，最后解剖取材。

1.2.2 病理染色分析 X線照射7 d后對動(dòng)物進(jìn)行解剖，將肺組織標(biāo)本放入10%中性甲醛中固定約3 d，用二甲苯脫蠟梯度乙醇進(jìn)行脫水，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色和Masson染色。通過病理影像系統(tǒng)在顯微鏡下攝像。免疫組化染色：石蠟切片置于60℃烘箱中，烘片4 h，脫蠟至水。3% H2O2室溫孵育5～10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，于pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液中高壓抗原修復(fù)，血清封閉后孵育一抗過夜。洗片后孵育生物素標(biāo)記二抗工作液及辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DAB顯色后自來水充分沖洗，復(fù)染、脫水以及封片。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)以及rhCC16處理 大鼠肺泡上皮細(xì)胞CCL-149在DMEM培養(yǎng)液(含10% 胎牛血清)，5% CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)。rhCC16處理前，35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中鋪入生長良好的HPAEpiC細(xì)胞，細(xì)胞覆蓋率為70%～80%時(shí),PBS清洗3次,用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h后，再分別加入rhCC16(200 ng/ml)無抗生素的DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.2.4 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和引物設(shè)計(jì) Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。提取的1 μg總RNA為轉(zhuǎn)錄模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為70℃ 5 min，42℃ 50 min，95℃ 5 min。根據(jù)GeneBank中的cDNA序列，分別設(shè)計(jì)IL-6、TNF-α以及TGF-β的引物。見表1。

表1 Real Time PCR引物設(shè)計(jì)

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR及Western blot 采用SYBR熒光染料，Smart Cycler System分析軟件分析。反應(yīng)體系為cDNA 2 μl，ddH2O 6.4 μl，上下游引物各0.8 μl,SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 μl,共20 μl總反應(yīng)體系。擴(kuò)增條件：退火56℃30 min，延伸72℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)蛋白樣品加入相應(yīng)比例的SDS凝膠上樣緩沖液(6×loading buffer)，煮沸變性5 min，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，然后將膜移至5%的脫脂奶粉PBST緩沖液，室溫封閉1 h,PBST洗膜3次。加入一抗，4℃孵育過夜。PBST洗膜3次,加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h。洗膜3次，暗室顯影。通過Western Blot及Real Time PCR檢測大鼠肺組織中IL-6，TNF-α，TGF-β的表達(dá)水平。

1.2.6 MTT法 傳代5×104個(gè)/100 μl細(xì)胞于96孔平底板，5%CO2，37℃培養(yǎng)過夜。每孔加入rhCC16(200 ng/ml)無抗生素的DMEM培養(yǎng)液100 μl繼續(xù)培養(yǎng)，設(shè)3個(gè)副孔。每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔加入100 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD值490 nm處測量各孔的吸光值。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)及纖維化情況比較 受到單次大劑量照射后第8天取各組大鼠肺組織，進(jìn)行HE及Masson染色。對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁未見增厚，未見纖維細(xì)胞；照射組可見明顯滲出的炎癥細(xì)胞，肺泡結(jié)構(gòu)改變，大量增生纖維細(xì)胞，纖維組織栓塞，出現(xiàn)明顯纖維化癥狀；rhCC16+照射組，具有較完整的肺泡結(jié)構(gòu)，炎癥細(xì)胞輕度浸潤，肺泡壁輕度增厚。與對照組比較，照射組大鼠表現(xiàn)出明顯的急性炎癥反應(yīng)及纖維變性，rhCC16干預(yù)減輕了其病變。見圖1。

2.2 3組Bax及Bcl-2的蛋白及mRNA的表達(dá)水平比較 在照射24 h后，rhCC16有效地抑制了肺組織凋亡因子Bax的表達(dá)，促進(jìn)了凋亡抑制因子Bcl-2的表達(dá)。與對照組比較，照射組大鼠組織中Bax表達(dá)水平明顯增高，rhCC16+照射組大鼠Bax表達(dá)水平明顯降低，接近正常對照組；而Bcl-2的表達(dá)情況則相反。見圖2。

2.3 3組SD大鼠血清中IL-6、TNF-α以及TGF-β水平比較 ELASA檢測血清中IL-6、TNF-α、TGF-β水平，與對照組比較，照射組大鼠血清中IL-6、TNF-α、TGF-β水平明顯增高，而rhCC16+照射組大鼠血清中IL-6、TNF-α以及TGF-β水平明顯降低，接近對照組。見表2。

圖1 3組大鼠肺組織受到單次大劑量照射后第8天取肺組織進(jìn)行HE及Masson染色，rhCC16減輕了照射誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞浸潤和纖維變性

圖2 rhCC16對凋亡相關(guān)因子的影響(a.Bax及Bcl-2大鼠肺組織免疫組織化學(xué)染色；b.Western Blot；c～d.Real Time PCR)

表2 3組大鼠血清中IL-6，TNF-α以及TGF-β

注：與對照組比較，①P<0.01；與照射組比較，②P<0.01

2.4 3組SD大鼠肺組織中IL-6、TNF-α以及TGF-β表達(dá)水平比較 與對照組比較，照射組大鼠肺組織中IL-6、TNF-α以及TGF-β表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；rhCC16+照射組SD大鼠IL-6、TNF-α以及TGF-β表達(dá)水平明顯降低，接近正常對照組。見圖3。

圖3 大鼠肺組織中IL-6、TNF-α、TGF-β表達(dá)水平(a.Western Blot；b～d.Real Time PCR)

2.5 rhCC16對大鼠肺泡上皮細(xì)胞的保護(hù)作用 為了進(jìn)一步驗(yàn)證rhCC16對肺泡細(xì)胞的在放射線照射條件下的保護(hù)作用，利用大鼠肺泡上皮細(xì)胞CCL-149進(jìn)行驗(yàn)證。

與對照組比較，照射組中IL-6、TNF-α以及TGF-β表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；rhCC16+照射組IL-6、TNF-α以及TGF-β水平明顯降低，接近對照組。與對照組比較，照射組Bax表達(dá)水平明顯增高；rhCC16+照射組Bax表達(dá)水平明顯降低，接近正常對照組；而Bcl-2的表達(dá)情況則相反。MTT法檢測細(xì)胞存活率，rhCC16+照射組細(xì)胞存活率明顯高于照射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 3組大鼠肺泡上皮細(xì)胞中IL-6、TNF-α、TGF-β表達(dá)水平(a.Western Blot；b～f.Real Time PCR；g.MTT)

3 討論

放射性肺炎及肺纖維化是局部放射治療惡性胸部腫瘤后正常肺組織損傷的一種非特異性炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，甚至危及患者的生命。目前，多采用大劑量的激素治療，但療效的不理想及相關(guān)的不良反應(yīng)限制了其在臨床中的應(yīng)用[19]。放射治療導(dǎo)致放射性肺損傷的機(jī)制目前仍未被完全認(rèn)識(shí)。有研究表明，射線引起肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺組織上皮細(xì)胞凋亡是引起放射性肺炎和肺纖維化的的始動(dòng)因素[20]，同時(shí)，以TNF-α、IL-6以及TGF-β為主的生物介質(zhì)對于造成肺組織損傷的始動(dòng)和維持發(fā)揮著重要的作用，而伴隨炎癥損傷的修復(fù)機(jī)制則在肺纖維化的形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[2-3]。

CC16作為肺損傷的生物標(biāo)記是肺泡上皮細(xì)胞襯液中含量最多的蛋白[3]。有研究表明，CC16表達(dá)的下降在哮喘等多種慢性肺部疾病的發(fā)病過程中起重要作用，可以抑制炎癥反應(yīng)[15-16]。因此，推測rhCC16在放射性肺炎及肺纖維化過程中可能起重要作用。建立放射性肺炎及肺纖維化大鼠模型并給予rhCC16處理，可以有效減輕輻射對大鼠的損害。通過HE及Masson染色對各組大鼠肺組織進(jìn)行病理學(xué)分析，rhCC16可減緩照射引起的炎癥細(xì)胞浸潤和纖維變性。這表明rhCC16對放射性肺炎及肺纖維化具有防護(hù)作用。免疫組織化學(xué)、Western Blot及Real Time PCR檢測結(jié)果表明，rhCC16可降低輻射誘導(dǎo)的凋亡因子Bax，促進(jìn)凋亡抑制因子Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)一步說明rhCC16可以減少肺組織中的細(xì)胞凋亡。放射線對于正常肺組織的損傷激活通過核因子NF-κB為主的炎癥信號(hào)通路，促進(jìn)炎性免疫細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-α大量釋放，造成炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的擴(kuò)大。而TGF-β作為體內(nèi)重要的炎癥損傷修復(fù)因子，不僅反映了放射性肺損傷發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的高低，還促使放射性炎癥向肺纖維化轉(zhuǎn)化的重要因素[2-3,21-23]。因此,通過檢測IL-6、TNFα以及TGF-β的表達(dá)反應(yīng)rhCC16對放射性肺炎及肺纖維化的影響。ELASA、Western Blot及Real Time PCR分別檢測血清及肺組織中IL-6、TNFα以及TGF-β的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，rhCC16可有效減輕輻射誘導(dǎo)的IL-6、TNF-α以及TGF-β的表達(dá)水平。這進(jìn)一步證明rhCC16對放射性肺炎及肺纖維化具有防護(hù)作用。因此，筆者推測rhCC16對大鼠肺泡上皮細(xì)胞CCL-149具有同樣的保護(hù)作用。利用放射線照射細(xì)胞并給予rhCC16處理，應(yīng)用Western Blot及Real Time PCR方法檢測，結(jié)果顯示rhCC16可以在mRNA和蛋白水平上降低輻射誘導(dǎo)的IL-6、TNF-α、TGF-β的表達(dá)，抑制輻射誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，而凋亡因子Bax表達(dá)的降低及凋亡抑制因子Bcl-2表達(dá)的升高，則證明rhCC16可以抑制輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。同時(shí)，MTT法檢測細(xì)胞存活率結(jié)果顯示，rhCC16可提高細(xì)胞在放射性照射下的存活率。這說明rhCC16可以保護(hù)大鼠肺泡上皮細(xì)胞CCL-149免遭放射線的破壞。

綜上所述，rhCC16可以抑制炎癥因子IL-6、TNF-α、TGF-β以及凋亡因子Bax的表達(dá)，誘導(dǎo)Bcl-2的表達(dá)，抑制放射線誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡，從而抑制放射性肺炎及肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，保護(hù)肺組織免遭放射線的破壞。因此，rhCC16在放射性肺炎及肺纖維化中起重要的防護(hù)作用。

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Protective mechanism of human recombinant clara cell protein 16 on radiation pneumonia and pulmonary fibrosis

TONG Chang-ci,LIU Yun-en,LIU Ying,TONG Zhou,ZHANG Yu-biao,SHI Lin,CONG Pei-fang,SHI Xiu-yun,LIU Xue-lei,JIN Hong-xu,HOU Ming-xiao

(Department of Emergency Medicine,Laboratory of PLA Wound and Trauma Center,The General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

Objective To explore the protective mechanism of human recombinant clara cell protein 16(rhCC16) on radiation pneumonia and pulmonary fibrosis.Methods A total of SD rats were randomly divided into 3 groups:the normal control group(n=10),the irradiation group (n=10) and the rhCC16+irradiation group(n=10).Animals in the irradiation group and the rhCC16+irradiation group were irradiated with single dose of 15 Gy and rhCC16.Lung tissues were stained by HE and Masson staining;immunohistochemistry,Western blot and Real Time PCR were used to detect the expression levels of IL-6,TNF,TGF-β,Bax and Bcl-2;Serum was harvested for ELISA assay of IL-6,TNFαand TGF-β;Western blot,Real Time PCR and MTT were used to test protective effect of rhCC16 in rat alveolar epithelial cell.Results Compared with the normal control group,the lung tissue of irradiation group presented obvious inflammatory cell infiltration,fiber lesions significantly,alveolar structural damage,cell apoptosis increased and expression levels of IL-6,TNFα and TGF-β increased,which were significantly reduced after rhCC16 intervention treatment.RhCC16 could inhibit the expression of IL-6,TNFα and TGF-β,inhibit apoptosis,and protect rat alveolar epithelial cells from radiation damage.Conclusion RhCC16 can inhibit the radiation induced inflammatory reaction and fibrosis,and has protective effect on radiation pneumonia and pulmonary fibrosis.

RhCC16; Radiation pneumonia; Pulmonary fibrosis

2013年遼寧省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2013225089)；2013年全軍十二五面上延續(xù)項(xiàng)目(CSY13J003)；2014年總后衛(wèi)生部重大新上項(xiàng)目(AWS14L008)

佟昌慈(1988-)，女，遼寧撫順人，技師，碩士

侯明曉，E-mail：houmingxiao188@163.com；金紅旭，E-mail：hongxuj@126.com

2095-5561(2016)06-0341-07

R818

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2016-10-21