陳勇，赤仁杰

（沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院骨三科，沈陽 110024）

β?七葉皂甙鈉對脊髓損傷大鼠脊髓組織水通道蛋白4與水通道蛋白9表達的影響

陳勇，赤仁杰

（沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院骨三科，沈陽 110024）

目的探討β?七葉皂甙鈉對脊髓損傷大鼠水通道蛋白（AQP）4與AQP9表達的影響。方法成年雌性SD大鼠150只，隨機分為假手術(shù)組、脊髓損傷組和β?七葉皂甙鈉組，每組50只。用改良的Allen’s法建立急性脊髓損傷模型后，術(shù)后行BBB運動功能評分及斜板實驗評價大鼠后肢功能，免疫組化和Western blotting方法檢測各組大鼠脊髓組織AQP4與AQP9的表達變化。結(jié)果相比于假手術(shù)組，各時間點脊髓損傷組和β?七葉皂甙鈉組運動功能評分及斜板實驗評分均顯著降低（P＜0.05）；但是第7天開始，各時間點β?七葉皂甙鈉組大鼠后肢功能恢復(fù)情況明顯優(yōu)于脊髓損傷組（P＜0.05）。相比于假手術(shù)組，各時間點脊髓損傷組和β?七葉皂甙鈉組大鼠脊髓組織AQP4與AQP9的含量顯著升高（P＜0.05）；但是與同時間點脊髓損傷組相比，β?七葉皂甙鈉組大鼠脊髓組織AQP4與AQP9的含量顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論β?七葉皂甙鈉能夠通過降低AQP4與AQP9蛋白表達對脊髓損傷大鼠的神經(jīng)功能發(fā)揮保護作用。

脊髓損傷；β?七葉皂甙鈉；水通道蛋白4；水通道蛋白9；大鼠

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脊髓損傷是一種非常嚴(yán)重的外傷，隨著交通業(yè)和建筑業(yè)的發(fā)展，其發(fā)生率逐年上升，常常導(dǎo)致患者終身癱瘓，而且其繼發(fā)性損傷也會引起各種并發(fā)癥，甚至死亡［1］。研究［2］發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后，脊髓損傷區(qū)的水通道蛋白（aquaporin，AQP）表達增加，水分子會大量地進入損傷部位，使脊髓壓力迅速升高，繼而引起脊髓水腫的發(fā)生，加重脊髓內(nèi)微循環(huán)障礙，加重脊髓繼發(fā)性損傷。目前對脊髓損傷后引起的水腫研究甚少，脊髓水腫發(fā)生的分子生物學(xué)機制尚不十分清楚，但猜測AQP與組織水腫關(guān)系密切。本研究通過Allen’s法制作脊髓損傷模型，免疫組化和Western blotting方法檢測β?七葉皂甙鈉處理后，脊髓損傷大鼠大脊髓組織AQP4和AQP9的表達，探討β?七葉皂甙鈉參與脊髓損傷后水腫形成的機制。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器

β?七葉皂甙鈉（山東綠葉制藥股份有限公司生產(chǎn)），羊抗大鼠AQP4、AQP9購于美國Chemico公司，兔抗羊IgG購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。SP免疫組化染色試劑盒與DAB顯色試劑盒購于福州邁新公司。

1.2動物分組及模型制備

150只成年健康SD大鼠，按隨機數(shù)字表法分為隨機分為假手術(shù)組、脊髓損傷組和β?七葉皂甙鈉組，每組50只。脊髓損傷模型制備：用10%水合氯醛麻醉大鼠，充分暴露T9～11椎板，暴露脊髓，用自制改良的Allen’s打擊器，以重量為3 g的平頭撞擊器，從3 cm高處自由落體的致傷能量，造成脊髓急性損傷，假手術(shù)組僅進行單純椎板摘除。β?七葉皂甙鈉組在脊髓損傷動物模型制備后腹腔注射β?七葉皂甙鈉，5 mg/（kg·d）。術(shù)后1、3、7、14、21 d每組各取10只動物進行檢測。

1.3大鼠后肢功能行為學(xué)測試

運動功能評分：將動物置于測試平臺持續(xù)觀察4 min，記錄其后肢活動。0分表示后肢完全癱瘓無活動能力，21分表示運動能力正常。斜板實驗：將表面粗糙的橡膠墊固定于斜板上，逐漸增加斜板與水平面之間的角度，直至大鼠剛好可在板上停留5 s，記錄這一角度值，每只大鼠測3次，取平均值。

1.4免疫組織化學(xué)染色

將大鼠以0.8%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，打開胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，先以0.9%生理鹽水灌流，4%多聚甲醛固定，然后打開椎管，剝離脊髓，置于4%多聚甲醛后固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片（5 μm）。按SP試劑盒說明書測定AQP4和AQP9的表達，以平均光密度值為標(biāo)準(zhǔn)對各組目標(biāo)蛋白進行評定。

1.5Western blotting檢測

將大鼠以0.8%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，冰上取脊髓組織，然后將組織超聲粉碎，低溫離心1 h，棄去沉淀取上清，用BCA法測定蛋白濃度，繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算每個泳道的上樣量。沸水浴將樣品變性，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，4℃封閉過夜，一抗、二抗室溫孵育2 h，暗室內(nèi)曝光，顯影、定影，對結(jié)果進行掃描，然后對結(jié)果進行圖像分析，以平均光密度值為標(biāo)準(zhǔn)對各組目標(biāo)蛋白進行評定。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用表示，各組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1行為學(xué)評價

各時間點脊髓損傷組和β?七葉皂甙鈉組組BBB評分及斜板實驗評分均顯著低于假手術(shù)組（P＜0.05）；但是自7d開始，各時間點β?七葉皂甙鈉組大鼠后肢功能恢復(fù)情況明顯優(yōu)于脊髓損傷組（P＜0.05），見表1、2。

2.2免疫組化檢測結(jié)果

表1　3組大鼠運動功能評分比較（n=10，x±s）Tab.1　Comparison of BBB scores among three groups（n=10，x±s）

表2　3組大鼠斜板試驗評分比較（n=10，x±s）Tab.2　Comparison of inclined plane test scores among 3 groups（n=10，x±s）

免疫組化結(jié)果顯示，AQP4與AQP9在假手術(shù)組大鼠脊髓組織僅有微量陽性表達，與相同時間點的假手術(shù)組相比，脊髓損傷組AQP4與AQP9的陽性表達顯著升高（P＜0.01）；與相同時間點的脊髓損傷組相比，β?七葉皂甙鈉組大鼠脊髓組織AQP4與AQP9的陽性表達則明顯降低（P＜0.01）。見圖1、2。

2.3Westernblotting檢測

圖1　免疫組織化學(xué)方法檢測脊髓損傷7 d后AQP4與AQP9的表達 ×400Fig.1　The expression of AQP4 and AQP9 were detected by immunohistochemical staining at 7 days after SCI×400

圖2　各組大鼠AQP4和AQP9蛋白的平均光密度值Fig.2　Mean optic density values of AQP4 and AQP9 in each group

Western blotting結(jié)果顯示，與相同時間點的假手術(shù)組相比，脊髓損傷組AQP4與AQP9的蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與相同時間點的脊髓損傷組相比，β?七葉皂甙鈉組大鼠脊髓組織AQP4與AQP9的蛋白表達則明顯降低（P＜0.01）。見圖3、4。

3　討論

脊髓損傷具有很高的發(fā)病率和致殘率，而且脊髓一旦發(fā)生損傷、壞死，恢復(fù)的可能性較小，給家庭和社會帶來沉重的負擔(dān)。目前對脊髓損傷的治療仍然是一個世界性的醫(yī)學(xué)難題［3?4］。

圖3　Western blotting方法檢測AQP4與AQP9的表達Fig.3　The expression of AQP4，AQP9 and β?actin detected by Western blotting

七葉皂苷鈉是娑羅子果實的提取物，研究［5］發(fā)現(xiàn)其具有消腫、抗炎、抗?jié)B出和改善微循環(huán)的作用。目前臨床主要用于各種原因引起的腦水腫及伴發(fā)的腦功能失調(diào)、創(chuàng)傷、骨折、手術(shù)后引起的腫脹與血腫。研究［6］發(fā)現(xiàn)七葉皂苷鈉具有很強的穩(wěn)定血管內(nèi)皮細胞和消除自由基的作用，另有研究［7］發(fā)現(xiàn)，N?甲基?D?天門冬氨酸受體拮抗劑和七葉皂苷鈉聯(lián)合應(yīng)用對脊髓細胞具有保護作用，能使脊髓組織損害明顯減輕，而且在脊髓牽拉損傷前應(yīng)用七葉皂苷鈉對脊髓神經(jīng)細胞凋亡有抑制作用［8］。綜上可知，七葉皂苷鈉對脊髓損傷的神經(jīng)細胞有保護作用。本研究對脊髓損傷大鼠和β?七葉皂甙鈉組大鼠進行BBB評分及斜板實驗評分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自7 d開始，相同時間點β?七葉皂甙鈉組大鼠后肢功能恢復(fù)情況明顯優(yōu)于脊髓損傷組，提示β?七葉皂甙鈉有助于脊髓損傷大鼠運動功能的恢復(fù)，這與之前的研究一致。但是七葉皂苷鈉具有多種藥理作用，其對脊髓細胞保護作用機制尚不十分清楚。

圖4　各組大鼠AQP4和AQP9蛋白的平均光密度值Fig.4　Mean optic density values of AQP4 and AQP9 in each group

AQPs是存在于微生物、動植物和人體內(nèi)的一組小分子蛋白質(zhì)，是一種膜通道蛋白，與水電解質(zhì)的運輸平衡密切相關(guān)，根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)又細分為水通道和水甘油通道。AQP4，又名汞不敏感水通道蛋白，在哺乳動物腦和脊髓的星形膠質(zhì)細胞有廣泛表達，在腦水腫、水鹽代謝、腦脊液的生成、吸收等方面發(fā)揮著重要作用［9?10］。研究［11?12］發(fā)現(xiàn)，降低脊髓損傷部位AQP4的表達能夠使急性缺血性損傷時脊髓灰質(zhì)后角深層的滲透膨脹率明顯減少，減輕脊髓水腫的水平，結(jié)果提示AQP4與脊髓損傷后的引起的脊髓水腫密切相關(guān)。AQP9主要表達于腦和脊髓白質(zhì)部分的星形膠質(zhì)細胞，與神經(jīng)組織中水的轉(zhuǎn)運、中樞滲透壓的形成和腦脊液的形成密切相關(guān)，還可能與鉀離子的代謝、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和腦細胞的能量代謝有關(guān)［13］。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，相比于假手術(shù)組，脊髓損傷組大鼠脊髓組織AQP4與AQP9的表達顯著升高，提示脊髓損傷后，AQP4與AQP9很可能參與了脊髓水腫的形成，但是，但是，β?七葉皂甙鈉能否通過抑制AQP4與AQP9減輕脊髓水腫，對脊髓損傷后的神經(jīng)提供保護作用是一個值得思考的問題。本研究建立脊髓損傷模型后，對脊髓損傷大鼠腹腔注射β?七葉皂甙鈉，然后在不同的時間點處死大鼠，利用免疫組織化學(xué)方法和Western blotting方法檢測損傷部位脊髓組織AQP4與AQP9的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與相同時間點的脊髓損傷組相比，β?七葉皂甙鈉組大鼠脊髓組織AQP4與AQP9的蛋白表達則明顯降低。結(jié)果提示，下調(diào)AQP4與AQP9蛋白的表達很可能是β?七葉皂甙鈉對脊髓損傷大鼠提供神經(jīng)保護作用的機制之一。

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（編輯于溪）

Effect of β?sodium Aescinate on the Expression of Aquaporin?4 and Aquaporin?9 in Rats with Spinal Cord Injury

CHEN Yong，CHI Renjie
（Department of Orthopedic，Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China）

ObjectiveTo study the effect of β?sodium aescinate on the expressions of aquaporin?4 and aquaporin?9 in rats with spinal cord inju?ry.MethodsA total of 150 rats were randomly divided into 3 groups：sham group（n=50），spinal cord injury（SCI）group（n=50）and β?sodi?um aescinate group（n=50）.The experimental animal models was established by modified Allen’s model.The Basso，Beattie and Bresnahan（BBB）locomotor rating scale and inclined plane test were used to evaluate rat behavioral consequences after injury.The immunohistochemical staining and western blotting assay were performed to observe the expressions of aquaporin?4 and aquaporin?9.ResultsCompared with sham group，BBB score and inclined plane test score of SCI group and β?sodium aescinate group were significantly lower at each time point（P＜0.05）；however，the functional recovery was significantly better in β?sodium aescinate group than in SCI group at each time point from 7 d after SCI（P＜0.05）.The aquaporin?4 and aquaporin?9 positive expressions of rats in sham group were lower significantly than rats in SCI group and β?sodium aescinate group（P＜0.05）；however，the aquaporin 4 and aquaporin 9 positive expressions of rats in β?sodium aescinate group was lower signifi?cantly than rats in SCI group at each time point（P＜0.05）.Conclusionβ?sodium aescinate can protect the neurologic function in rats with spi?nal cord injury by decreasing aquaporin?4 and aquaporin?9 protein expression.

spinal cord injury；β?sodium aescinate；aquaporin?4；aquaporin?9；rat

R651.2

A

0258-4646（2016）12-1124-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.12.015

陳勇（1973-），男，副主任醫(yī)師，碩士. E-mail：cy730729@sohu

2016-06-17

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