寇向龍,徐美蓉,張建平,趙賓賓,韓舜愈,*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

?

響應(yīng)面法優(yōu)化亞麻籽氫氰酸提取條件

寇向龍1,2,徐美蓉2,張建平2,趙賓賓1,韓舜愈1,*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

為了提高亞麻籽中的氫氰酸含量檢測(cè)的效率,同時(shí)確保其準(zhǔn)確性,用響應(yīng)面法對(duì)異煙酸-巴比妥酸比色法前處理中的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化。運(yùn)用Design Expert 7.0數(shù)據(jù)分析軟件在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法,建立了氫氰酸提取率與各影響因子的回歸方程。結(jié)果表明:氫氰酸的最佳提取條件為液固比50∶1(mL/g)、提取時(shí)間45 min、氫氧化鈉吸收液濃度 10 g/L,氫氰酸實(shí)際提取率可達(dá)96.12%。結(jié)論:此方法真實(shí)可靠,可用于大批量檢測(cè)亞麻籽中的氫氰酸含量。

亞麻籽,氫氰酸,生氰糖苷,異煙酸-巴比妥酸比色法,響應(yīng)面法

亞麻籽是世界十大油料之一[1],因富含α-亞麻酸和亞油酸[2]及木酚素[3]而具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力[4]、提高記憶力、降血脂血糖[5]、延緩衰老[6]和抗癌[7]等保健功效。然而,亞麻籽中的生氰糖苷可在β-葡萄糖苷酶的作用下生成劇毒的氫氰酸[8],是影響其開發(fā)利用的阻礙[9],使亞麻籽的開發(fā)程度與所含功能成分很不對(duì)稱[10]。因此,亞麻籽中氫氰酸的檢測(cè)對(duì)其品種改良具有重要意義。

氫氰酸的檢測(cè)方法主要有硝酸銀滴定法、吡啶-巴比妥酸光度法、異煙酸-吡唑啉酮分光光度法、異煙酸-巴比妥酸比色法等[8]。

周小潔等對(duì)上述4種氫氰酸檢測(cè)方法進(jìn)行了比對(duì)實(shí)驗(yàn),認(rèn)為所得結(jié)果沒(méi)有顯著的差異,均可用于亞麻籽的檢測(cè)[8]。但各方法均有局限性。硝酸銀滴定法檢測(cè)靈敏度低,穩(wěn)定性差[11];吡啶有刺激性氣味和較大毒性,對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的身體健康有較大影響,一般實(shí)驗(yàn)室不適用[12]。異煙酸-吡唑啉酮顯色時(shí)間較長(zhǎng),需40 min[13]。綜合比較異煙酸-巴比妥酸比色法相對(duì)其他方法更有優(yōu)勢(shì)[8,12],其原理是在中性條件下,氰化物與氯胺T作用生成氯化氰,再與異煙酸反應(yīng),生成戊烯二醛,最后與巴比妥酸作用產(chǎn)生一種紫藍(lán)色的化合物,在一定濃度范圍內(nèi),其色度與氰化物含量成正比。于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度,與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較,即可得所測(cè)樣品氰化物的含量[14]。

本實(shí)驗(yàn)選用異煙酸-巴比妥酸比色法來(lái)檢測(cè)亞麻籽中的氫氰酸含量,并參考國(guó)標(biāo)GB/T 15665-1995《豆類 配糖氫氰酸含量的測(cè)定》[15]中的水解法,利用響應(yīng)面分析法對(duì)異煙酸-巴比妥酸比色法的前處理的提取過(guò)程加以優(yōu)化,使其更加精確可靠。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亞麻籽,隴亞10號(hào) 由甘肅農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所亞麻課題組提供。

Cary 50紫外可見光分光光度計(jì) 美國(guó)瓦里安公司;BS124S 電子天平 德國(guó)Sartorius公司;KjeltecTM 8200半自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司;SPH-2102C恒溫?fù)u床 上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;GH-2000A低噪音空氣泵 北京中興公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氫氰酸提取 提取方法參考孟凡信等的方法[16],將亞麻籽樣品用粉碎機(jī)粉碎后,稱取2.00 g置于250 mL具塞錐形瓶中,加蒸餾水后,蓋上蓋子放在搖床上振蕩提取。經(jīng)抽濾后,吸取濾液10 mL于凱氏定氮儀樣品管中,加入100 g/L乙酸鋅溶液20 mL,再加入酒石酸1～2 g,立即用半自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行蒸餾,用裝有10 mL氫氧化鈉溶液的100 mL容量瓶收集餾出液,注意管子一定要通到液面以下,當(dāng)餾出液接近100 mL時(shí),取下容量瓶,加蒸餾水至刻度。

1.2.2 樣品檢測(cè)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 向8個(gè)25 mL具塞比色管各加入氫氰酸標(biāo)準(zhǔn)使用液(10 μg/mL)0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL,加少量水稀釋,同時(shí)取樣品餾出液5 mL,加入25 mL具塞比色管中。分別向各管滴入1.0 g/L酚酞指示劑1滴,然后用3%的乙酸溶液調(diào)至紅色剛好消失,用水定容至10 mL刻度,加入136 g/L磷酸二氫鉀緩沖液3 mL和10 g/L氯胺T溶液 0.25 mL,混勻后,放置2 min。然后在各管加入5 mL異煙酸-巴比妥酸溶液。25 ℃下顯色15 min,上機(jī)檢測(cè),檢測(cè)前先用空白管調(diào)零。根據(jù)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品所測(cè)吸光值可得出樣品中的氫氰酸含量[16]。

計(jì)算公式:P(mg/kg)=(A×V1×10×1000)/(m×V2×1000)

P-樣品中氰氰酸的含量(mg/kg)；A-從曲線中查出的氫氰酸質(zhì)量(μg);m-樣品質(zhì)量(g);V1-試樣餾出液的體積(mL)；V2-加入比色管的流出液的體積(mL)；10-稀釋倍數(shù)。

提取率Y(%)=P/P0×100[17]

P0-國(guó)標(biāo)GB/T 15665-1995《豆類 配糖氫氰酸含量的測(cè)定》[15]中方法所測(cè)得氫氰酸含量(114.08 mg/kg,五次重復(fù))。

1.2.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化 選取液固比、提取時(shí)間、吸收液濃度作為影響因素,以氫氰酸的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.1 固液比的影響 稱取2.00 g 亞麻籽,氫氧化鈉吸收液濃度12 g/L,提取時(shí)間40 min,分別加水60、80、100、120 mL(既液固比為 30∶1、40∶1、50∶1、60∶1)。

1.2.3.2 提取時(shí)間的影響 稱取2.00 g 亞麻籽,氫氧化鈉吸收液濃度12 g/L,加水100 mL,設(shè)置提取時(shí)間為20、30、40、50、60 min。

1.2.3.3 氫氧化鈉吸收液濃度 稱取亞麻籽2.00 g,加水100 mL,提取時(shí)間40 min。選用不同濃度的氫氧化鈉吸收液4、12、20、40 g/L做提取率比對(duì)實(shí)驗(yàn)。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用 Design-Expert 7.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,研究各個(gè)因素之間對(duì)亞麻籽氫氰酸提取率的影響,作出響應(yīng)面圖,對(duì)亞麻籽氫氰酸檢測(cè)前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化。表1為響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表。

表1 提取工藝因素水平表Table 1 Levels of each factor

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1,曲線方程為y=0.0832x-0.0078,其中y為吸光值,x為標(biāo)樣比色管中所含的氫氰酸質(zhì)量(μg)。相關(guān)系數(shù)R2=0.9998,說(shuō)明方程具有良好的線性相關(guān)。

圖1 氫氰酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 The standard curve of hydrocyanic acid quality

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 液固比對(duì)氫氰酸提取率的影響 如圖2所示,50∶1的提取率最高,60∶1有所下降可能是由于稀釋濃度太低,抽濾和上機(jī)時(shí)損失較多。因此最佳液固比最終確定為50∶1。

圖2 不同固液比下的氫氰酸提取率Fig.2 Hydrocyanic acid extraction rate of different solid-liquid ratio

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)氫氰酸提取率的影響 如圖3所示,提取率隨提取時(shí)間的增長(zhǎng)而有所增加,到40 min后變化不明顯,因此最終選用40 min。

圖3 不同提取時(shí)間下的氫氰酸提取率Fig.3 Hydrocyanic acid extraction rate in different extraction time

2.2.3 氫氧化鈉吸收液濃度對(duì)氫氰酸提取率的影響 如圖4所示,當(dāng)氫氧化鈉濃度為12 g/L時(shí),提取率最高,濃度增大后提取率下降是由于氫氧化鈉濃度過(guò)高導(dǎo)致餾出液堿性過(guò)強(qiáng),無(wú)法用乙酸將pH調(diào)至中性,在堿性環(huán)境下,顯色劑無(wú)法發(fā)生顯色反應(yīng)。最終選擇了12 g/L的氫氧化鈉作為氫氰酸吸收液。

圖4 不同濃度氫氧化鈉對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of different concentrations of sodium hydroxide on the extraction rate

2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用3因素3水平15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)(3個(gè)中心位點(diǎn))的響應(yīng)面分析法對(duì)氫氰酸提取條件進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Scheme and experimental results of response surface design

表3 模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

各因素交互作用的響應(yīng)面圖見圖5。從圖5可以直觀地看出各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值亞麻籽氫氰酸提取率的影響。當(dāng)液固比和提取時(shí)間固定時(shí),提取率隨氫氧化鈉吸收液濃度變化幅度較大。提取率隨液固比以及提取時(shí)間變化幅度相對(duì)較小。所以氫氧化鈉吸收液濃度對(duì)亞麻籽氫氰酸的提取率影響顯著[18]。

圖5 各兩因素的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface showing the pairwise interactive effects of three factors on extraction rate

經(jīng)響應(yīng)面回歸分析得到的最佳前處理?xiàng)l件為液固比50.39∶1(mL/g)、提取時(shí)間44.94 min、吸收液氫氧化鈉的濃度10.19 g/L,在此條件下亞麻籽氫氰酸提取率理論值為 96.66%。為了便于實(shí)際操作,將最佳條件修正為液固比 50∶1(mL/g)、提取時(shí)間45 min、吸收液濃度 10 g/L。在修正條件下,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得亞麻籽氫氰酸提取率為96.12%,與理論值相比較為吻合。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面分析法確定了氫氰酸的最佳提取條件為為液固比50∶1(mL/g)、提取時(shí)間45 min、吸收液濃度10 g/L,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得亞麻籽氫氰酸提取率為96.12%,與理論預(yù)測(cè)值96.66%較為吻合。說(shuō)明此方法真實(shí)可靠,可用于大批量檢測(cè)亞麻籽中的氫氰酸含量。

[1]孫蘭萍,許暉.亞麻籽生氰糖苷的研究進(jìn)展[J].中國(guó)油脂,

2007,32(10):24-26.

[2]林非凡,譚竹鈞.亞麻籽油中α-亞麻酸降血脂功能研究[J].中國(guó)油脂,2012,37(9):44-47.

[3]林鳳英,林志光,邱國(guó)亮,等.亞麻籽的功能成分及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品工業(yè),2014,35(2):220-223.

[4]張靜雯.膳食纖維的功能及在食品中的應(yīng)用[J].食品工程,2011,(4):17-18.

[5]Abuelgassim A O. Effect of flaxseeds and date palm leaves extracts on serum concentrations of glucose and lipids in alloxan diabetic rats[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences,2010,13,1141-1145.

[6]Makni M,Sefi M,Garouiel M,et al. Dietary polyunsaturated fatty acid prevents hyperlipidemia and hepatic oxidant status in pregnant diabetic rats and their macrosomic offspring[J].Journal of Diabetes Complications,2011,25,267-274.

[7]Sturgeon SR,Volpe SL,Puleo E,et al. Dietary Intervention of Flaxseed,Effect on Serum Levels of IGF-1,IGF-BP3,and C-Peptide. Nutrition and Cancer,2011,63,376-380.

[8]周小潔,郭亮,車向榮,等.亞麻籽及其餅粕中氰化物測(cè)定方法的比較[J].動(dòng)物生產(chǎn),2008,44(7):49-51.

[9]李可.亞麻籽粕膳食纖維的提取工藝研究[D]. 烏魯木齊:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[10]胡曉軍,李群,許光映,等.亞麻籽中主要營(yíng)養(yǎng)成分的分布研究[J].中國(guó)油脂.2012,37(12):64-66.

[11]劉義軍,魏曉奕,王飛,等.含氰糖苷類作物脫毒技術(shù)及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2013,34(12):357-360.

[12]王志玲,趙忠,朱海蘭.異煙酸-巴比妥酸分光光度法測(cè)定苦杏仁油氰化物含量的不確定度評(píng)定[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(10):174-177.

[13]李高陽(yáng),丁霄霖.亞麻籽中氰化物定性定量方法的研究[J].食品工業(yè)科技,2008,29(6),291-296.

[14]譚建新,戈京國(guó),哀綽斌,等.異煙酸一巴比妥酸分光光度法(試行)[J].中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè),1994,10(1):13-14.

[15]GB/T 15665-1995,豆類 配糖氫氰酸含量的測(cè)定[S].

[16]孟凡信,張鴻軍,張翠珍. 新方法測(cè)定杏仁油中氰化物含量[J].監(jiān)督與選擇,2008,3:52-53.

[17]龍?jiān)骑w,王沛佩,楊克迪,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化亞麻籽油提取工藝[J].食品科學(xué),2012,33(14):45-49.

[18]徐美蓉,李玉芳,董煚,等. 大豆異黃酮超聲波輔助提取條件優(yōu)化的研究[J].大豆科學(xué),2013,32(1):52-53.

Optimization of extraction conditions for hydrocyanic acid in flaxseed by response surface methodology

KOU Xiang-long1,2,XU Mei-rong2,ZHANG Jian-ping2,ZHAO Bin-bin1,HAN Shun-yu1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070,China)

Inordertoimprovetheefficiencyofdetectionforhydrocyanicacidcontentinflaxseed,whileensuringitsaccuracy,Thepretreatmentmethodofisonicotinic-barbituricacidcolorimetricmethodhadbeenoptimizedbyresponsesurfacemethodology.Aquadraticpolynomialregressionmodelwasfittedusingathree-factor,three-levelBox-Behnkendesignandanalyzedusingresponsesurfacemethodologytoobtaintheoptimalextractionconditions.Theresultshowedthatthebestextractiontechnologyconditionswasattheratioofsolventandmaterial50∶1,with10g/Lconcentrationofsodiumhydroxideabsorbingliquidandextractingfor45min.Thehydrocyanicacidextractionratiocouldreach96.12%.Thismethodistrueandreliable,canbeusedtodetectlargequantitiesofhydrocyanicacidinflaxseed.

flaxseed;hydrocyanicacid;cyanogenicglycosides;isonicotinic-barbituricacidcolorimetry;responsesurfacemethodology

2016-05-10

寇向龍(1988-)，男，碩士研究生，助理研究員，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)，E-mail：kxlong0125@126.com。

*通訊作者:韓舜愈(1963-)，男，博士，教授，研究方向：果蔬加工及葡萄酒風(fēng)味化學(xué)，E-mail：gsndhsy@163.com。

TS207.3

B

1002-0306(2016)21-0201-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.030