趙雅楠,王 穎,2,張東杰,*,沈 琰,楊義杰

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江大慶 163319;2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心,黑龍江大慶 163319)

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EST-SSR標(biāo)記在谷類(lèi)作物中的通用性研究進(jìn)展

趙雅楠1,王 穎1,2,張東杰1,*,沈 琰1,楊義杰1

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江大慶 163319;2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心,黑龍江大慶 163319)

EST-SSR標(biāo)記是基于表達(dá)序列標(biāo)簽(Express Sequence Tags,EST)開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats,SSR)的一種與功能基因直接相關(guān)的新型分子標(biāo)記技術(shù),因其在不同作物間具有較好的通用性而被廣泛應(yīng)用于作物基因組學(xué)研究。不同谷類(lèi)作物間EST-SSR的通用性可降低引物開(kāi)發(fā)成本、提高效率,為遺傳研究較薄弱的作物奠定基礎(chǔ)。文章概括介紹了EST-SSR標(biāo)記,對(duì)其在不同谷類(lèi)作物間及相比較于G-SSR標(biāo)記的通用性情況進(jìn)行簡(jiǎn)單歸類(lèi)分析,評(píng)述了EST-SSR標(biāo)記的不足及其優(yōu)化措施,以期利用EST-SSR高通用性的特點(diǎn)推動(dòng)谷類(lèi)作物基因組學(xué)的發(fā)展。

EST-SSR,谷類(lèi)作物,通用性

谷類(lèi)作物是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最重要的糧食作物,不僅為人體提供大部分熱能和蛋白質(zhì),還提供多種人體所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),是人類(lèi)生存的重要儲(chǔ)備糧食。隨著人們生活水平、健康意識(shí)及膳食結(jié)構(gòu)水平的不斷提高,國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)谷物及谷物加工食品的需求量逐漸上升,使我國(guó)在谷物育種、谷類(lèi)食品加工等方面快速發(fā)展,取得了卓越成就[1]。目前,大豆[2]、小麥[3]、大麥[4]等大宗谷類(lèi)作物已完成了遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建,并對(duì)一些重要的農(nóng)藝性狀如抗性[5]、株高[6]等進(jìn)行了QTL定位,育成了多批高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)多抗的新品種,在谷物食品生產(chǎn)加工中發(fā)揮重要作用。He[7]等在面包焙烤加工研究中發(fā)現(xiàn)面筋強(qiáng)度、淀粉含量是影響面包品質(zhì)的重要因素,提出在選擇小麥原料時(shí)要考慮篩選含有高低分子量谷蛋白亞基和硬度基因Pinb-D1b的培育品種,而用于制作面條的品種則要求含有Wx-B1缺失基因及可標(biāo)記低含量多酚氧化酶活性的STS標(biāo)記以保證面條硬度適宜、顏色白亮?？梢?jiàn),谷物食品加工業(yè)與谷物育種工作息息相關(guān),對(duì)未來(lái)谷物育種方向具有一定的指導(dǎo)作用。

表達(dá)序列標(biāo)簽(express sequence tags,EST)是一段在cDNA文庫(kù)中隨機(jī)克隆的長(zhǎng)度在150～500 bp的表達(dá)序列,可以代表某一生物體的某個(gè)組織在特定時(shí)空條件下的一個(gè)表達(dá)基因。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat,SSR)是一類(lèi)由1～6個(gè)堿基組成的基元串聯(lián)重復(fù)的DNA序列,在基因組中廣泛存在[8]。而表達(dá)序列標(biāo)簽微衛(wèi)星(EST-SSR)是一種在EST范圍內(nèi)開(kāi)發(fā)SSR的新型分子標(biāo)記技術(shù),與傳統(tǒng)SSR分子標(biāo)記相比具有費(fèi)用低、耗時(shí)短的優(yōu)點(diǎn),可避免測(cè)序、建庫(kù)等繁瑣步驟[9]。同時(shí),EST是具有表達(dá)功能的DNA序列,僅占整個(gè)基因組的2%左右,可以忽略其余98%的“junk DNA”,直接獲得基因表達(dá)的信息,在很大程度上縮小了基因的篩選范圍,真正實(shí)現(xiàn)高效、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便[10-11]。此外,由于EST來(lái)自編碼區(qū),其保守性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于來(lái)自非編碼區(qū)的DNA序列,因此EST-SSR標(biāo)記在種屬、甚至是遠(yuǎn)緣作物之間具有較好的通用性[12]。EST-SSR標(biāo)記的通用性分析,既為一些遺傳研究較落后的作物,提供了開(kāi)展現(xiàn)代基因組學(xué)研究的基本分析工具,促進(jìn)種間遺傳信息的借鑒、交流,也有助于研究近緣種間的遺傳演化規(guī)律等。本文從EST-SSR標(biāo)記在不同種屬間谷類(lèi)作物的通用性進(jìn)行論述,同時(shí)相較于G-SSR(Genomic-SSR)標(biāo)記通用性情況進(jìn)行分析,并對(duì)其今后在基因組研究中的深入利用進(jìn)行了討論和展望,以期為EST-SSR標(biāo)記開(kāi)展遺傳多樣性分析、基因定位等研究人員提供參考。

1 EST-SSR標(biāo)記

EST是指mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用噬菌體或質(zhì)粒作為載體,形成cDNA文庫(kù)后,大規(guī)模的在cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑選克隆,對(duì)3′端或5′端進(jìn)行一步法測(cè)序,形成的一段大小在150～500 bp、具有特異性的DNA片段,可以反映出mRNA的部分信息。盡管不同作物EST中SSR的分布頻率各不相同,但研究表明,8%的EST序列中存在SSR,其中近半數(shù)可以成功設(shè)計(jì)引物,EST-SSR標(biāo)記則是根據(jù)這一特點(diǎn)在EST中篩選含有SSR的序列,根據(jù)序列兩端側(cè)翼具有高度保守性的特點(diǎn)為其設(shè)計(jì)引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測(cè),將得到的EST序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知資源進(jìn)行blast比對(duì),判斷其可能代表的功能或信息[13]。EST技術(shù)的不斷成熟使其在不同物種間的應(yīng)用也更加廣泛和深入,隨著DNA測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展,EST資源數(shù)據(jù)庫(kù)不斷充實(shí),可以根據(jù)需求直接獲取,但并非所有的EST-SSR都可以成功設(shè)計(jì)引物。首先要利用SSR篩選軟件在EST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行可利用性篩選,通過(guò)拼接和聚類(lèi)將質(zhì)優(yōu)、無(wú)冗余的EST留下。通常根據(jù)核苷酸的核心序列重復(fù)次數(shù)選擇,如二核苷酸,n≥10,三核苷酸,n≥7等,需要注意的是,不同軟件的篩選條件和計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)各不相同,在設(shè)計(jì)篩選參數(shù)時(shí)一定要寬嚴(yán)適中,否則會(huì)導(dǎo)致SSR不精準(zhǔn)或拼接錯(cuò)誤。為提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,在篩選SSR時(shí)可以將幾種軟件結(jié)合使用,相互驗(yàn)證篩選結(jié)果。EST-SSR的引物設(shè)計(jì)一般遵循以下原則:引物長(zhǎng)度在20 bp左右,(C+G)含量盡量控制在50%,SSR兩端距3′端或5′端20 bp以上,且3’端末尾不能是T或A等[14]。

近些年,隨著EST-SSR技術(shù)的不斷發(fā)展,其應(yīng)用領(lǐng)域及研究?jī)?nèi)容也不斷拓展,在谷類(lèi)作物品質(zhì)性狀評(píng)價(jià)、果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分研究中應(yīng)用廣泛,為谷類(lèi)作物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成分子機(jī)制研究及品質(zhì)改良提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。姜鵬[15]等基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一些與“寧麥9號(hào)”低蛋白質(zhì)含量、低面筋強(qiáng)度等優(yōu)質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的等位變異;林延慧[16]等構(gòu)建了包括18個(gè)連鎖群的大豆分子連鎖圖譜,得到4個(gè)與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL;梁慧珍[17]等對(duì)與大豆異黃酮、脂肪及蛋白質(zhì)含量相關(guān)的基因進(jìn)行定位,共檢測(cè)到23個(gè)與上述重要品質(zhì)性狀相關(guān)的QTL并準(zhǔn)確定位到各連鎖群,同時(shí)在相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)大豆中蛋白質(zhì)含量分別與異黃酮及脂肪含量呈極顯著負(fù)相關(guān),為進(jìn)一步明確大豆中各營(yíng)養(yǎng)成分關(guān)聯(lián)關(guān)系及大豆優(yōu)質(zhì)品質(zhì)性狀在染色體的具體位置及效應(yīng)提供重要價(jià)值,對(duì)促進(jìn)大豆品質(zhì)性狀優(yōu)化具有重要意義;張曉娜[18]等利用179對(duì)SSR引物構(gòu)建了水稻遺傳連鎖圖譜,得到4個(gè)能夠控制糙米中維生素E含量的QTL;劉克琦[19]利用SSR技術(shù)對(duì)水稻中維生素A含量與水稻米色性狀關(guān)聯(lián)關(guān)系進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)水稻中維生素A性狀由至少兩對(duì)獨(dú)立顯性基因控制,而與米色沒(méi)有直接關(guān)系,為水稻中維生素種類(lèi)及合成機(jī)制研究及富含維生素水稻品種的選育與推廣奠定基礎(chǔ)。禾谷類(lèi)作物中的維生素、蛋白質(zhì)、脂肪等都是重要的品質(zhì)性狀,EST-SSR標(biāo)記技術(shù)可通過(guò)尋找影響各品質(zhì)性狀含量的QTL,明確谷類(lèi)作物中部分EST-SSR序列特征及與營(yíng)養(yǎng)成分的關(guān)聯(lián)性,利用克隆、雜交等手段將傳統(tǒng)谷類(lèi)作物進(jìn)行品質(zhì)改良,最終實(shí)現(xiàn)作物品質(zhì)優(yōu)化,突出各谷類(lèi)作物功能特性使其滿(mǎn)足人們?cè)谌粘z食過(guò)程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求。

2 EST-SSR標(biāo)記在不同谷類(lèi)作物間的通用性分析

隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展,各種作物EST序列的開(kāi)發(fā)數(shù)量急劇上升,發(fā)掘未知EST-SSR位點(diǎn),揭示更多基因信息成為分子生物學(xué)研究的重要目標(biāo)。但由于部分谷類(lèi)作物的分子標(biāo)記研究起步較晚,已知的EST序列數(shù)量較少,遺傳研究基礎(chǔ)相對(duì)薄弱,因此,近緣物種轉(zhuǎn)移法逐漸成為發(fā)展EST-SSR標(biāo)記的有效方法[20]。幾種谷類(lèi)作物EST-SSR的通用性情況見(jiàn)表1。同一種屬作物間,EST-SSR側(cè)翼序列具有高度的保守性和相似性,因此,一套EST-SSR引物可以通用于同一種屬間的不同作物,一部分引物能夠擴(kuò)增出清晰的條帶,甚至具有很好的多態(tài)性,特別是近緣作物之間,親緣關(guān)系越近,同源序列越多,擴(kuò)增效果越好。EST-SSR在不同谷類(lèi)作物間具有良好的通用性,將一種已研究成熟作物中開(kāi)發(fā)出的EST-SSR引物通用于其他作物,可降低開(kāi)發(fā)成本、提高效率、擴(kuò)充EST數(shù)據(jù)資源、促進(jìn)不同作物間基因信息的交流、推動(dòng)作物基因組學(xué)發(fā)展。

表1 幾種谷類(lèi)作物EST-SSR的通用性情況Table 1 The transferability of EST-SSR in different crops

2.1 EST-SSR標(biāo)記在種間不同谷類(lèi)作物的通用性分析

近些年,EST數(shù)量呈指數(shù)級(jí)快速增長(zhǎng),為作物EST-SSR的開(kāi)發(fā)提供了廣闊空間。張?bào)w付[23]等隨機(jī)挑選了119對(duì)藜麥EST-SSR引物,對(duì)4個(gè)同屬不同種藜麥資源的研究表明通用性比率為55.9%。李曉嵐[25]等利用40對(duì)烏拉爾甘草引物構(gòu)建了4種、22份甘草屬材料的EST-SSR指紋圖譜,并對(duì)其進(jìn)行聚類(lèi)分析,發(fā)現(xiàn)有效擴(kuò)增率為100%,其中15對(duì)引物可產(chǎn)生多態(tài)性條帶,共獲得59個(gè)等位基因,多態(tài)性比率為89.4%。郭紅媛[26]等利用40對(duì)燕麥EST-SSR引物分析了另外15份燕麥種質(zhì)資源的遺傳多樣性,共獲得89個(gè)等位基因,對(duì)其進(jìn)行聚類(lèi)分析,在相似系數(shù)為0.93時(shí)可將其分為3類(lèi)。進(jìn)一步利用上述40對(duì)EST-SSR引物鑒定31份遺傳信息不明確的燕麥種質(zhì)資源的基因組倍性,發(fā)現(xiàn)應(yīng)試種質(zhì)中可能存在新的燕麥資源。以上數(shù)據(jù)表明,谷類(lèi)作物種間基因同源性較高,EST-SSR標(biāo)記在谷類(lèi)作物種間具有良好的適應(yīng)性和通用性,得到的引物與傳統(tǒng)途徑開(kāi)發(fā)的EST-SSR標(biāo)記一樣,均可應(yīng)用于遺傳研究中,在谷類(lèi)作物種間親緣關(guān)系分析、指紋圖譜數(shù)據(jù)構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定、基因組鑒定等方面發(fā)揮重要作用。

2.2 EST-SSR標(biāo)記在屬間不同谷類(lèi)作物的通用性分析

EST-SSR不僅可以通用于同屬間近緣作物,在許多不同屬作物間也具有一定的轉(zhuǎn)移性。宿俊吉[27]將351對(duì)小麥EST-SSR引物通用于四倍體冰草中,其中314對(duì)引物能成功擴(kuò)增,通用性比率高達(dá)89.5%。龔亞明[28]等設(shè)計(jì)了163對(duì)豌豆EST-SSR引物,以26份蠶豆為模板驗(yàn)證其通用性,發(fā)現(xiàn)其中99對(duì)可產(chǎn)生有效擴(kuò)增,通用性比率為61%,其中36對(duì)引物具有多態(tài)性,平均等位基因數(shù)為4.1,平均PIC值達(dá)0.48,聚類(lèi)分析顯示可將應(yīng)試的26份蠶豆資源劃分成兩大類(lèi)。Varshney等[29]選取了165對(duì)大麥EST-SSR引物驗(yàn)證其在小麥、黑麥以及水稻中的通用性,發(fā)現(xiàn)通用率分別為78.2%、75.2%、42.4%,且在各應(yīng)試品種的擴(kuò)增產(chǎn)物中均檢測(cè)出不同程度的多態(tài)性片段。EST-SSR標(biāo)記在不同屬谷類(lèi)作物間具有一定的通用性,這極大豐富了谷類(lèi)作物的SSR標(biāo)記信息,在一定程度上緩解了部分谷類(lèi)作物SSR引物數(shù)量少、多態(tài)性低的現(xiàn)狀,同時(shí)得到的多態(tài)性引物在谷類(lèi)作物的遺傳多樣性分析、聚類(lèi)分析、屬間資源親緣關(guān)系驗(yàn)證等研究中具有較好的適用性,特別是對(duì)于一些研究進(jìn)步晚、開(kāi)發(fā)標(biāo)記數(shù)量少的谷類(lèi)作物,利用近緣作物轉(zhuǎn)移法將一些開(kāi)發(fā)成熟作物的EST-SSR標(biāo)記進(jìn)行通用,在節(jié)約開(kāi)發(fā)成本的同時(shí)可以加強(qiáng)屬間作物的基因交流,豐富基因信息,對(duì)其他近緣作物的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)起到借鑒作用,為其基因組信息開(kāi)發(fā)提供新的思路與途徑。

EST-SSR序列的通用性在不同作物間各不相同,其通用性高低在一定程度上受二者遺傳關(guān)系的影響。SahaP[30]等將145對(duì)高羊茅EST-SSR引物通用于黑麥草、草甸羊茅、小麥及水稻中,通用性比率分別為86%、83%、71%、59%,表明通用性比率與應(yīng)試品種和高羊茅的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近相關(guān)。EST-SSR翼序列的保守程度與作物親緣關(guān)系遠(yuǎn)近相關(guān),親緣關(guān)系越近,序列同源性越高,其引物通用性越好,一般來(lái)講,同屬(族)不同種作物間的通用性高于同科不同屬間作物的通用性[31]。鐘敏[32]研究綠豆SSR引物與其同屬作物豇豆(50%)與小豆(73.3%)間的通用性明顯高于陳明麗[33]研究的菜豆SSR引物在豇豆(43.9%)與小豆(38.2%)間的通用性。徐磊[34]將禾本科高粱EST-SSR引物通用于其同屬作物割手密中,通用性為70%,而李宏偉[35]將禾本科小麥的597對(duì)EST-SSR引物通用于其同科不同屬作物玉米中,僅有393對(duì)引物成功擴(kuò)增,通用率為65.8%。此外,EST-SSR引物在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間也具有通用性。Savadi[36]、Backiyarani[37]等發(fā)現(xiàn)高粱、芭蕉的EST-SSR引物在花生(39%)、姜目(58%)中均具有一定的通用性。谷類(lèi)作物間EST-SSR標(biāo)記通用性研究為一些遺傳研究基礎(chǔ)較薄弱的作物提供了新思路,初步實(shí)現(xiàn)了EST-SSR標(biāo)記的資源共享,充分利用了近緣作物間基因具有一定同源性的特點(diǎn)。與此同時(shí),EST來(lái)源于編碼區(qū),是對(duì)作物基因內(nèi)部變異的直接評(píng)價(jià),可以直接將標(biāo)記與性狀或生理生化特征相聯(lián)系,為后續(xù)的基因定位等研究提供重要參考。

3 G-SSR標(biāo)記與EST-SSR標(biāo)記的通用性比較分析

SSR標(biāo)記具有數(shù)量豐富、重復(fù)性好等特點(diǎn),是一種比較成熟的分子標(biāo)記技術(shù),按照SSR來(lái)源可分為Genomic-SSR和EST-SSR,二者在谷類(lèi)作物間具有不同程度的通用性。文明富[38]等將419對(duì)木薯EST-SSR引物和182對(duì)G-SSR引物通用于麻瘋樹(shù)和橡膠樹(shù)中,其EST-SSR引物和G-SSR引物在麻瘋樹(shù)的通用性比率分別為55.85%和37.36%,在橡膠樹(shù)中的通用性比率分別為38.9%和26.37%,木薯EST-SSR引物在麻瘋樹(shù)和橡膠樹(shù)中的通用性明顯高于其G-SSR引物。Yu[39]等將47對(duì)水稻EST-SSR引物和41對(duì)G-SSR引物分別通用于中國(guó)芒中,其中24對(duì)EST-SSR引物和17對(duì)G-SSR引物成功擴(kuò)增,通用性比率分別為51%和41%,說(shuō)明水稻SSR引物可通用于芒屬作物中,且其EST-SSR引物的通用性明顯高于G-SSR引物。丁西朋等[40]以4份柱花草為模板,探究103對(duì)G-SSR引物和117對(duì)EST-SSR引物的通用性情況。其中93對(duì)G-SSR引物可在至少一份供試材料中發(fā)生有效擴(kuò)增,其中44對(duì)可以在4種供試材料中同時(shí)發(fā)生擴(kuò)增,通用性比率為42.7%,117對(duì)EST-SSR引物中,98對(duì)是有效引物,其中81對(duì)可在4種供試材料中同時(shí)發(fā)生擴(kuò)增,通用性比率為69.2%。Chandra等[41]也對(duì)柱花草的20對(duì)EST-SSR引物和21對(duì)G-SSR引物的通用性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)EST-SSR標(biāo)記的通用性比率高達(dá)86%,而G-SSR標(biāo)記僅為45%,表明柱花草EST-SSR的通用性高于G-SSR。

G-SSR與EST-SSR的來(lái)源序列不同導(dǎo)致其引物通用性及多態(tài)性情況存在差異。G-SSR來(lái)源于基因間序列,而EST-SSR來(lái)源于轉(zhuǎn)錄區(qū)域。作為基因的一部分,EST-SSR中包含一些控制植物基本生理生化代謝、與其生命過(guò)程息息相關(guān)的基因。為縮小其后代與親本的遺傳差異,更好的保留親本優(yōu)良特性,這部分基因在物種間往往具有較好的穩(wěn)定性,不易突變,在生物進(jìn)化過(guò)程中表現(xiàn)出的序列同源性和共線性更明顯[42-43]。因此,相較于G-SSR,EST-SSR位點(diǎn)在遺傳過(guò)程中更穩(wěn)定,EST-SSR標(biāo)記的通用性也普遍高于G-SSR標(biāo)記。微衛(wèi)星的多態(tài)性主要由于其復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的滑動(dòng)或染色單體的不等交換等原因產(chǎn)生的,主要表現(xiàn)為其核心重復(fù)單元種類(lèi)及重復(fù)次數(shù)在同一物種的不同基因位點(diǎn)上迥然不同,而這部分多態(tài)性很有可能通過(guò)內(nèi)含子表現(xiàn)出來(lái),由于G-SSR與EST-SSR的序列來(lái)源不同,EST-SSR中不含有內(nèi)含子,當(dāng)用G-SSR引物擴(kuò)增模板DNA時(shí),很有可能將內(nèi)含子擴(kuò)增出,表現(xiàn)出的多態(tài)性一部分來(lái)源于內(nèi)含子,而并不僅僅是微衛(wèi)星的。此外,在生物進(jìn)化過(guò)程中,作物的部分基因會(huì)受到搭載效應(yīng)的影響,承受強(qiáng)選擇作用使其在群體中的遺傳多樣性降低,搭載效應(yīng)在對(duì)作物生命休戚相關(guān)性狀的選擇中比較明顯,而對(duì)其它性狀選擇引起的選擇牽連效應(yīng)較小[44-46]。因此,搭載效應(yīng)可能使EST的多態(tài)性降低,一些關(guān)鍵性狀出現(xiàn)雜合變異的物種被淘汰,而EST序列來(lái)自編碼區(qū),控制作物性狀,部分非關(guān)鍵性狀發(fā)生變異的作物卻能在生物進(jìn)化和自然選擇過(guò)程中保留下來(lái)[47]。因此,EST-SSR引物的多態(tài)性普遍低于G-SSR。

綜上所述,谷類(lèi)作物EST-SSR標(biāo)記的通用性普遍高于G-SSR,而多態(tài)性則普遍低于G-SSR。但也存在特殊情況,賀潤(rùn)麗等[48]分別選取66對(duì)大豆G-SSR引物和43對(duì)EST-SSR引物通用于6種不同來(lái)源的黃芪中,通用比率分別為31.82%和76.74%,多態(tài)性比率分別為18.18%和53.49%,表明經(jīng)過(guò)篩選的大豆G-SSR和EST-SSR均可通用于黃芪中,且EST-SSR的通用性比率和多態(tài)性比率均高于G-SSR。程雪妮[49]等將小麥的203對(duì)SSR引物和46對(duì)EST-SSR引物通用于無(wú)雀麥芒中,其中137對(duì)(67.49%)SSR引物和30對(duì)(65.22%)EST-SSR引物成功擴(kuò)增,表明小麥G-SSR和EST-SSR在無(wú)芒雀麥中都具有一定的通用性,但是G-SSR標(biāo)記的通用性高于EST-SSR,這與前人的研究結(jié)果正好相反。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能因?yàn)樗x取的EST-SSR標(biāo)記數(shù)量較少,不能準(zhǔn)確、全面的反映出作物的基因組信息。此外,還可能與所選取EST-SSR標(biāo)記的來(lái)源有關(guān)。研究證明,來(lái)源于3′UTR和5′UTR的EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性非常好,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它來(lái)源于編碼區(qū)的序列,可能其中部分EST-SSR標(biāo)記來(lái)源于其基因的3′UTR和5′UTR,故而其整體多態(tài)性比率升高。SSR多態(tài)性高低是決定其是否能成為有效遺傳標(biāo)記的關(guān)鍵,盡管EST-SSR的通用性較高,但其多態(tài)性較低仍是阻礙其應(yīng)用于基因組學(xué)研究中的一塊短板。EST-SSR固有的高保守性特點(diǎn)使EST-SSR引物開(kāi)發(fā)之后的多態(tài)性篩選、核心引物確定等工作難度較大,因此,在選擇EST-SSR標(biāo)記時(shí)要充分考慮其多態(tài)性情況。在選擇EST-SSR標(biāo)記時(shí)要參考其所在位置,盡可能選擇靠近高變異區(qū)的。同時(shí),可以借鑒切割擴(kuò)增多態(tài)性的方法,將沒(méi)有表現(xiàn)出多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物回收,利用限制性?xún)?nèi)切酶處理,進(jìn)一步分析片段內(nèi)部差異。此外,還可以提升檢測(cè)手段,使用分辨率更高的毛細(xì)管熒光電泳技術(shù)等。

4 討論與展望

作為人類(lèi)重要的糧食作物,谷物籽粒不僅為人類(lèi)提供極重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),還可以作為原料生產(chǎn)主副食品,促進(jìn)谷物及其食品加工業(yè)的發(fā)展。近些年,谷物因其特殊的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及藥用價(jià)值已成為人們理想的健康食品,但由于一些小宗谷類(lèi)作物的研究還不夠透徹,在育種及生產(chǎn)加工方面仍存在很多問(wèn)題亟待解決,因此,要不斷拓展谷物研究領(lǐng)域,加強(qiáng)谷物中蛋白質(zhì)、維生素、纖維素等營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)性狀的研究,將分子標(biāo)記技術(shù)與谷物育種有機(jī)結(jié)合,進(jìn)行谷物育種實(shí)用性轉(zhuǎn)化,對(duì)谷物功能特性成分及作用機(jī)理進(jìn)行深入研究,發(fā)掘谷物潛在特性,推動(dòng)谷物及其食品加工業(yè)的發(fā)展,加強(qiáng)谷物的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

EST-SSR作為一種新型分子標(biāo)記技術(shù),在具備一般分子標(biāo)記技術(shù)特點(diǎn)的同時(shí)還具有一些特殊優(yōu)勢(shì),已經(jīng)在基因組學(xué)研究中起到重要作用,但也仍存在一定的缺陷。其一,開(kāi)發(fā)EST時(shí)需要對(duì)3′端或5′端進(jìn)行一步法測(cè)序,在這一過(guò)程中很容易出現(xiàn)測(cè)序錯(cuò)誤,進(jìn)而會(huì)影響EST數(shù)據(jù)庫(kù)的準(zhǔn)確性。研究發(fā)現(xiàn),EST數(shù)據(jù)庫(kù)中只有97%是精確的,錯(cuò)誤數(shù)據(jù)會(huì)在判斷EST代表哪種基因功能或信息時(shí)產(chǎn)生影響;其二,在EST序列中篩選SSR位點(diǎn)時(shí),由于選用軟件及參數(shù)設(shè)置的差異性和局限性,導(dǎo)致測(cè)序成本、效率及準(zhǔn)確性均受到影響;其三,由于不同生物體的不同組織在不同時(shí)空條件下的基因表達(dá)頻率不同,導(dǎo)致cDNA文庫(kù)中的mRNA豐度各不相同,高豐度的EST一般具有冗余性,不利于提取,而低豐度的基因往往具有特異性,有很高的研究?jī)r(jià)值;其四,由于EST來(lái)源于編碼區(qū),開(kāi)發(fā)出的EST-SSR只能反映作物轉(zhuǎn)錄區(qū)序列的差異,而對(duì)于一些調(diào)控序列、內(nèi)含子等位于非編碼區(qū)的信息差異則不能體現(xiàn)出來(lái)。為克服上述缺點(diǎn),可從以下四個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化。第一,提高cDNA文庫(kù)質(zhì)量。在構(gòu)建cDNA文庫(kù)時(shí),要盡可能的選取質(zhì)量高、代表性強(qiáng)的材料,如在不同發(fā)育階段和環(huán)境條件下取不同器官的組織,這樣可以包含更多的基因信息。第二,利用減法雜交技術(shù)有效實(shí)現(xiàn)目的基因序列的富集,大幅度減少高豐度非特異性cDNA,提高低豐度cDNA所占比例。第三,進(jìn)行特異性篩選以降低冗余性EST對(duì)測(cè)序的影響。第四,在對(duì)EST數(shù)據(jù)庫(kù)中的SSR進(jìn)行可用性篩選時(shí),可以將幾種篩選軟件有機(jī)結(jié)合,相互驗(yàn)證篩選結(jié)果以提高準(zhǔn)確性。

EST-SSR標(biāo)記起步雖晚,但發(fā)展迅猛,隨著EST-SSR技術(shù)的不斷發(fā)展,EST數(shù)據(jù)庫(kù)逐漸豐富,EST-SSR標(biāo)記在谷類(lèi)作物間的通用性應(yīng)用已成為作物基因發(fā)掘、親緣關(guān)系鑒定、遺傳多樣性分析等研究的可靠根據(jù),目前已經(jīng)在禾谷類(lèi)、豆菽類(lèi)等谷類(lèi)作物中廣泛應(yīng)用,在降低引物開(kāi)發(fā)成本、提高研發(fā)效率等方面的優(yōu)勢(shì)十分顯著。對(duì)不同谷類(lèi)作物間EST-SSR標(biāo)記通用性進(jìn)行分析,將會(huì)快速推進(jìn)種屬內(nèi)不同作物基因結(jié)構(gòu)和相關(guān)功能信息的開(kāi)發(fā),能夠使不同科屬作物間的基因研究成果相互交叉,形成合力,共同促進(jìn)谷類(lèi)作物基因組學(xué)的發(fā)展。

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Research progress in transferability of EST-SSR makers in grain crops

ZHAO Ya-nan1，WANG Ying1,2，ZHANG Dong-jie1，*，SHEN Yan1，YANG Yi-jie1

(1.College of Food Science,Heilongjiang Bayi Agricultural Universitiy,Daqing 163319,China;2.National Coarse Cereals Engineering Research Center,Daqing 163319,China)

EST-SSRisanewmoleculemarkingtechnologytoexploitSimpleSequenceRepeats(SSR)basedonExpressSequenceTags(EST).Itwaswidelyusedinthestudyofcropgenomicsbecauseofitsgoodtransferabilityindifferentcrops.ThetransferabilityofEST-SSRindifferentgraincropscouldcutthecostsofprimersdevelopmentandimproveefficiency.Itcouldlaythefoundationofthecropsthatgeneticstudiesareweak.EST-SSRmakersanditstransferabilityindifferentgraincropscomparedwithG-SSRwereintroducedinthispaper.ThedisadvantagesandimprovementsinordertoacceleratethedevelopmentofcropgenomicsbyusingthehightransferabilityofEST-SSRwerereviewed.

EST-SSR;graincrops;transferability

2016-06-02

趙雅楠(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程，E-mail:zyn658@163.com。

*通訊作者:張東杰(1966-)，男，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程，E-mail:byndzdj@126.com。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD34B02)；黑龍江省應(yīng)用技術(shù)與開(kāi)發(fā)重大項(xiàng)目(GA14B104)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)21-0357-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.061