劉鈺龍劉 峰周坤能蘇曉妹方先文張云輝,*鮑依群,*

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇南京 210095;2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所 / 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺, 江蘇南京 210014;3安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所, 安徽合肥 230031

水稻溫敏型葉片白化突變體tsa1的表型鑒定和基因定位

劉鈺龍1,**劉 峰1,**周坤能3蘇曉妹1方先文2張云輝2,*鮑依群1,*

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇南京 210095;2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所 / 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺, 江蘇南京 210014;3安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所, 安徽合肥 230031

一個由甲磺酸乙酯(EMS)誘變寧粳 36水稻品種獲得的溫敏型葉片白化突變體 tsa1在低溫條件下(20～24℃)表現(xiàn)葉片白化, 但在較高溫度下(28～32℃)葉色與野生型無顯著差異。突變體白化葉片中葉綠素a和類胡蘿卜素含量與野生型相比顯著下降。顯微觀察發(fā)現(xiàn)突變體白化組織中正常葉綠體數(shù)量稀少, 包含大量小型的異常葉綠體, 進一步用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)異常葉綠體中無發(fā)育完整的類囊體片層結(jié)構(gòu), 表明該突變體中葉綠體發(fā)育存在嚴(yán)重缺陷。遺傳分析表明該突變性狀受單個隱性核基因控制。利用tsa1與南京11雜交所得的F2群體中的368個隱性極端個體, 將該突變基因定位于第5染色體長臂163 kb的范圍內(nèi)。本研究為該基因的圖位克隆及功能解析奠定了基礎(chǔ)。

水稻(Oryza sativa.L); 溫敏型; 白化; 突變體; 葉綠體發(fā)育

葉片是植物最主要的光合器官, 葉綠體是光合作用的主要場所, 可將太陽能轉(zhuǎn)化、貯存為能被生物體利用的化學(xué)能。葉綠體起源于原始光合細(xì)菌,擁有自己的基因組, 能夠編碼上百種蛋白質(zhì), 但超過95%的葉綠體必需蛋白都是由核基因組編碼的[1]。葉綠體屬于植物細(xì)胞中眾多質(zhì)體的一種, 植物光合器官中的葉綠體是由種子中的原質(zhì)體(proplast)經(jīng)黃化體(etioplast)發(fā)育而成, 受到核基因與質(zhì)體基因共同調(diào)控[2]。葉綠體的光合能力依賴于其中包含的大量光合色素, 其中葉綠素主要負(fù)責(zé)光能的捕獲、傳遞和轉(zhuǎn)化, 而類胡蘿卜素能夠維持光系統(tǒng)穩(wěn)定性, 防止光傷害。光合色素的生物合成是一個非常復(fù)雜的酶促反應(yīng)過程, 僅葉綠素的合成就有至少15種酶的參與[3]。光合色素含量、葉綠體數(shù)量的改變可引起植物葉色的顯著變化, 因此葉色變異突變體是解析光合色素代謝途徑以及葉綠體發(fā)育過程的理想材料[4-5]。

水稻(Oryza sativa L.)是世界最主要的糧食作物之一, 通過對其葉色突變的研究, 可深入解析C3禾本科作物光合作用的分子機制, 有助于通過基因工程手段提高葉片光合效率, 進而提高糧食產(chǎn)量, 具有重要的意義。葉色變異是水稻中一個較為常見的突變類型, 通過圖位克隆的方法, 已經(jīng)從中分離到至少86個葉色相關(guān)基因(http：//www.ricedata.cn/), 絕大多數(shù)突變體在苗期葉色表型最為明顯, 隨著生育時期的推進, 部分突變體表型可減弱或消失, 其表型的變化有時還受到光照、溫度等條件的影響。目前已經(jīng)報道的水稻葉色突變體種類眾多, 表型各異, 根據(jù)其葉色表型可以分為白化(albino)、黃化(chlorine)、淡綠(virescent)、條紋(stripe)、斑馬(zebra)等不同類型[6]。

溫敏型葉片白化突變體是葉色突變中較為常見的一種, 只在某些特定溫度下出現(xiàn)不同程度的白化。已研究報道的水稻溫敏型葉片白化突變體v1[7]、v2[8]、v13(t)[9]、W1[10]、W17[11]、W25[11]、fan5[12]、osv4[13]、ctd9[14]、wlp1[15]等均在低溫條件下呈現(xiàn)白化。水稻突變體W1在30℃條件下表型正常, 葉綠素和類胡蘿卜素含量與野生型無顯著差異; 但是在低溫(15～20℃)條件下表現(xiàn)為白化, 葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著降低[10]。W25在不同溫度下葉色差異顯著, 在較低溫度(≤25℃)條件下, 幼葉為完全白化,而在較高溫度(≥30℃)條件下, 其第1～2葉卻表現(xiàn)為淺綠色或正常綠色[11]。深入研究發(fā)現(xiàn), 大部分白化葉片突變體的表型都是由于葉綠體發(fā)育的缺陷造成的。例如, v13(t)突變體在24℃下, 白化葉片中葉綠體發(fā)育不正常, 只能看到一些空的囊泡狀結(jié)構(gòu), 觀察不到類囊體基粒片層結(jié)構(gòu)存在[9]。W25突變體在低于25℃的條件下, 白化葉片的葉綠體輪廓完好, 但是內(nèi)部結(jié)構(gòu)簡單, 僅有少量的片狀結(jié)構(gòu), 尚未分化出基粒和基粒片層, 葉綠體發(fā)育滯后[11]。fan5在低于臨界溫度26.1℃的條件下, 葉片呈現(xiàn)白化, 其葉綠體無類囊體垛疊結(jié)構(gòu), 只有與前質(zhì)體類似的泡狀結(jié)構(gòu)[12]。李育紅等[16]和李超等[17]發(fā)現(xiàn)的白化葉片突變體, 其白化部位細(xì)胞有嗜鋨體存在, 但沒有正常的類囊體和基粒片層結(jié)構(gòu)。王榮平等[18]對gra75突變體的葉綠體觀察發(fā)現(xiàn), 白化葉片的葉綠體數(shù)量顯著減少, 葉綠體結(jié)構(gòu)異常, 沒有類囊體片層。因此, 溫敏型葉片白化突變體是研究溫度影響葉綠體發(fā)育的良好材料。

本試驗利用甲磺酸乙酯(EMS)誘變寧粳36得到的一個溫敏型葉片白化突變體 tsa1 (thermo-sensitive albino), 對 tsa1進行了不同溫度處理、葉綠素測定及葉綠體觀察等相關(guān)試驗, 并完成了突變基因的初定位,可為該基因的圖位克隆及深入功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻溫敏型葉片白化突變體 tsa1, 經(jīng)多代自交已經(jīng)穩(wěn)定遺傳。2014年夏將 tsa1突變體與秈稻“南京11”雜交, 同年在海南種植F1植株, 2015年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種植親本和F2群體。在田間隨機選取成熟期的野生型與 tsa1突變體各 10株, 考察其株高、有效穗數(shù)、劍葉長寬, 并收獲其稻穗, 用于統(tǒng)計結(jié)實率與千粒重等農(nóng)藝性狀, 利用 t測驗分析統(tǒng)計結(jié)果的差異顯著性。

1.2 遺傳分析與基因定位

2014年于海南考察F1植株的表型, 2015年于江蘇南京統(tǒng)計 F2群體中正常型和突變型的個體數(shù), 用卡方測驗法分析統(tǒng)計結(jié)果。

采用隱性極端個體法進行連鎖分析與基因定位。選用均勻分布于水稻12條染色體上在“寧粳36”和“南京11”之間存在多態(tài)性的SSR標(biāo)記, 利用F2群體中10株極端單株進行初步連鎖分析。根據(jù)初步定位結(jié)果, 在定位區(qū)間內(nèi)利用Primer Premier 5.0軟件開發(fā)新的InDel標(biāo)記, 逐步縮小目標(biāo)區(qū)段。

1.3 突變體苗期葉色表型鑒定及光合色素含量測定。

在光照培養(yǎng)箱中(8 h黑暗/16 h光照), 不同的溫度條件下(20℃、24℃、28℃、32℃)播下野生型與突變體種子, 直至成苗。采用丙酮浸提的方法提取色素, 選用各溫度下培養(yǎng)的發(fā)芽20 d后的幼苗, 剪取最后一片完全展開葉的中間部位(取樣株數(shù)≥5, 總質(zhì)量為30～200 mg), 于2 mL 80%丙酮中, 室溫避光浸提24 h, 中間混勻多次。將浸提液5000轉(zhuǎn) min-1離心 10 min, 取上清液用紫外可見分光光度計分別測定 663、645和 470 nm 處的吸光值。參照Lichtenthaler[19]的方法, 測定和計算葉片單位質(zhì)量葉綠素a (Chl a)、葉綠素b (Chl b)和類胡蘿卜素(Car)的含量。Chl a = 12.21A663- 2.81A645; Chl b = 20.13A645- 5.03A663, Car = (1000A470- 2.05 Chl a -114 Chl b)/245, A代表吸光值(absorbance), 用t測驗分析差異顯著性。

1.4 原生質(zhì)體葉綠體觀察

取20℃條件下培養(yǎng)14 d的野生型與突變體幼苗,切成1～2 mm的小段, 放入含有纖維素酶、果膠酶的酶解液中, 抽真空1 h, 在室溫下40轉(zhuǎn) min-1震蕩酶解5 h, 過濾除去殘渣, 將濾液100轉(zhuǎn) min-1離心10 min收集原生質(zhì)體, 顯微鏡下觀察, 照相記錄。

1.5 苗期葉鞘熒光觀察

撕取在20℃條件下培養(yǎng)20 d的野生型與突變體幼苗的葉鞘, 在激光共聚焦顯微鏡明場及488 nm通道下觀察細(xì)胞形態(tài)及葉綠體自發(fā)熒光, 照相記錄。

1.6 苗期葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

分別取各溫度處理的野生型與突變體的葉片,用含有 2.5%戊二醛的磷酸緩沖液固定 24 h后, 用50%、70%、80%、95%、100%的丙酮脫水, 之后用Epon812樹脂包埋樣品, 切片并染色, 再用透射電鏡觀察。

1.7 質(zhì)體發(fā)育與葉綠素合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析

選取在20℃條件下培養(yǎng)20 d的野生型與突變體相同部位的葉片, 提取其總RNA。取2 μg RNA作為模板, 反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA。利用Real-time PCR測定野生型與突變體中質(zhì)體發(fā)育與葉綠素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平, 其中包括PsaA1/A2 (光系統(tǒng)I葉綠素脫輔基蛋白)、PsbD1/D2 (光系統(tǒng)II醌結(jié)合蛋白)、RbcL (Rubisco酶大亞基)、Rpoα/β/β′/β′′(質(zhì)體RNA聚合酶亞基)、RCA (二磷酸核酮糖羧化酶活化酶)、NADH2 (NADH氧化還原酶2)、NADH4 (NADH氧化還原酶4)、ATPCF2 (ATP合酶亞基)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 tsa1是溫敏型白化突變體

在24℃光照培養(yǎng)箱中, 相比野生型, tsa1突變體植株幼苗明顯白化, 白化表型在萌發(fā)后 5 d最為明顯, 而后逐漸恢復(fù), 萌發(fā)后 20 d突變體植株表現(xiàn)白色條紋葉(圖 1)。在大田中種植 tsa1突變體時發(fā)現(xiàn),分期播種的 tsa1突變體表型有較大差異, 早期播種(江蘇南京, 5月上旬)的較晚期播種(江蘇南京, 5月下旬)的白化表型更明顯。因此, 我們在光照培養(yǎng)箱中用不同的溫度處理野生型和突變體植株, 發(fā)現(xiàn)tsa1突變體突變表型受低溫誘導(dǎo)： 20℃時, 突變體葉片完全白化; 24℃時, 突變體葉片表現(xiàn)白條紋; 28℃時, 突變體葉片表現(xiàn)淡黃綠色; 32℃時, 突變體與野生型無明顯差異(圖2-A)。色素含量測定結(jié)果顯示, 20℃、24℃、28℃條件下培養(yǎng)的突變體葉片中葉綠素a和類胡蘿卜素含量顯著低于野生型, 而 32℃條件下培養(yǎng)的突變體葉片中光合色素含量與野生型無顯著差異(圖2-B), 該結(jié)果與觀察到的植株表型相一致。此外, 在成熟期 tsa1突變體的株高、劍葉長寬、每株穗數(shù)、結(jié)實率和千粒重等農(nóng)藝性狀與野生型相比沒有顯著差異(圖3)。以上結(jié)果表明, tsa1突變體是一個溫敏型葉片白化突變體, 低溫可誘導(dǎo)突變表型的出現(xiàn)。

圖1 野生型(WT)和tsa1突變體苗期表型Fig. 1 Phenotype of wild type and tsa1 mutant at seedling stage24℃萌發(fā)后5 d (A)、14 d (B)和20 d (C)的野生型和tsa1突變體幼苗表型。比例尺為1 cm。Phenotype of 5 DAG (days after germination) (A), 14 DAG (B), and 20 DAG (C) seedlings of wild type (WT) and tsa1 mutant. Bars = 1 cm.

圖2 不同溫度下野生型(WT)和tsa1突變體幼苗表型及光合色素含量Fig. 2 Phenotype and photosynthetic pigment content of wild type, tsa1 mutant seedlings at different temperaturesA： 野生型和tsa1突變體在不同溫度(20、24、28和32℃)下發(fā)芽20 d后的幼苗表型。比例尺為1 cm; B： 野生型和tsa1突變體在不同溫度下發(fā)芽20 d后的光合色素的含量。*表示根據(jù)t測驗差異顯著, P ＜ 0.05, **表示根據(jù)t測驗差異極顯著, P ＜ 0.01。A： phenotype of 20 DAG seedlings of wild type and tsa1 mutant at different temperatures (20, 24, 28, and 32℃). Bars = 1 cm; B： photosynthetic pigment content of 20 DAG seedlings of wild type and tsa1 mutant at different temperatures (20, 24, 28, and 32℃). * indicates significant difference at P ＜ 0.05 as determined by t-test; ** indicates extremely significant difference at P ＜ 0.01 as determined by t-test.

圖3 成熟期野生型和tsa1突變體表型及農(nóng)藝性狀統(tǒng)計Fig. 3 Phenotype and agronomic traits of wild type and tsa1 mutant at mature stageA： 成熟期野生型(WT)和tsa1突變體植株表型。比例尺為15 cm; B～G： 成熟期野生型(WT)和tsa1突變體株高(B)、結(jié)實率(C)、千粒重(D)、劍葉長(E)、劍葉寬(F)及每株穗數(shù)等(G)主要農(nóng)藝性狀分析。B～G各數(shù)據(jù)在0.05水平無顯著差異(t測驗)。A： phenotype of the wild type (WT) and the tsa1 mutant plants at mature stage. Bar = 15 cm; B-G： major agronomic traits of the wild type and tsa1 mutant at mature stage, including plant height (B), seed-setting rate (C), thousand seed weight (D), length of flag leaf (E), width of flag leaf (F) and panicle number per plant (G). Data in B-G are no significant difference at the 0.05 level by t-test.

2.2 tsa1白化組織中正常葉綠體數(shù)量減少

選取20℃條件下培養(yǎng)15 d的野生型及tsa1突變體植株, 在激光共聚焦顯微鏡下通過葉綠素的自發(fā)熒光觀察其中葉綠體形態(tài)。如圖 4-A顯示, 野生型葉鞘組織細(xì)胞中葉綠體飽滿、呈梭形, 而 tsa1突變體中正常葉綠體(白色箭頭指示)數(shù)量極為稀少, 經(jīng)統(tǒng)計, 野生型中正常葉綠體密度約為9530個 mm-2,而突變體中為460個 mm-2; 此外, 在tsa1突變體中還觀察到大量直徑小于 1 μm的具有葉綠素自發(fā)熒光的異常葉綠體(藍色箭頭指示)。通過酶解水稻幼苗,我們分離了 20℃條件下培養(yǎng) 15 d的野生型和 tsa1突變體植株的原生質(zhì)體(圖 4-B), 統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)野生型中有 77.4%的細(xì)胞含有正常的葉綠體, 而在 tsa1突變體中含有外觀正常的葉綠體的細(xì)胞僅占 3.9% (圖4-C)。以上結(jié)果表明, 低溫下tsa1突變體植株細(xì)胞中正常葉綠體數(shù)量顯著降低, 進而導(dǎo)致其白化的表型。

2.3 tsa1突變體中葉綠體發(fā)育存在缺陷

通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn), 野生型葉肉細(xì)胞中葉綠體含量豐富(圖5-A), 葉綠體中的類囊體片層排列緊密整齊(圖5-D), 而tsa1突變體白化葉片的葉肉細(xì)胞中沒有觀察到正常的葉綠體(圖5-B), 取而代之的是大量直徑小于1 μm的異常葉綠體, 該結(jié)構(gòu)中含有嗜鋨顆粒, 但不含有成型的類囊體片層(圖5-E)。此外, 我們將 20℃條件下培養(yǎng)的完全白化植株移栽到32℃培養(yǎng) 7 d后切片觀察, 發(fā)現(xiàn)突變體中出現(xiàn)大量大小正常的葉綠體, 其中含有一定數(shù)量的類囊體垛疊(圖5-A～F)。這些結(jié)果暗示, 在低溫下tsa1突變體中葉綠體不能正常發(fā)育成熟, 停滯在中間階段, 形成了異常的小型葉綠體結(jié)構(gòu)。后用Real-time PCR的方法對葉綠素合成和質(zhì)體發(fā)育的相關(guān)基因進行了表達分析表明, 突變體中光合作用相關(guān)基因PsaA1/A2、PsbD1/D2、RbcL及電子傳遞相關(guān)基因RCA、NADH2/4、ATPCF2表達顯著下調(diào), 而編碼質(zhì)體RNA聚合酶的亞基的Rpoα/β/β′/β′′基因表達上調(diào)(圖5-G)。以上結(jié)果說明TSA1突變阻礙了低溫下水稻幼葉中的葉綠體發(fā)育進程, 并影響了光合作用調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 最終導(dǎo)致白化表型。

圖4 野生型(WT)和tsa1突變體的葉綠體觀察Fig. 4 Observation of chloroplasts in wild type (WT) and tsa1 mutantA： 野生型(WT)和tsa1突變體葉鞘細(xì)胞葉綠體自發(fā)熒光。白色箭頭指示正常葉綠體, 藍色箭頭指示異常葉綠體。比例尺為10 μm; B： 野生型(WT)和tsa1突變體葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體。比例尺為5 μm; C： 野生型(WT)和tsa1突變體中含有正常葉綠體的葉肉細(xì)胞所占百分比。**表示根據(jù)t測驗差異極顯著, P ＜ 0.01。A： autofluorescence of chloroplast in leaf sheath cell of the wild type and tsa1 mutant. Normal chloroplasts are indicated by white arrow, while abnormal chloroplast by blue arrow. Bar = 10 μm; B： protoplast of the wild type and tsa1 mutant mesophyll cells. Bar = 5 μm; C： percentage of mesophyll cells with normal chloroplasts in the wild type (WT) and tsa1 mutant. ** indicates extremely significantly difference at P ＜ 0.01 as determined by t-test.

(圖5)

圖5 野生型(WT)和tsa1突變體葉肉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平Fig. 5 Ultrastructure of mesophyll cells of WT and tsa1 mutant and expression level of related genesA～F： 野生型和tsa1突變體在不同溫度下葉肉細(xì)胞的電鏡圖片; D、E、F分別是A、B、C中虛線區(qū)域的放大圖。A、B標(biāo)尺為5 μm, C標(biāo)尺為2 μm, D、E、F中標(biāo)尺為1 μm; G： 光合作用與葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。野生型基因轉(zhuǎn)錄水平設(shè)定為“1”。**表示根據(jù)t測驗差異極顯著, P ＜ 0.01。A-F： TEM picture of mesophyll cell of wild type (WT) and tsa1 mutant at different temperatures; D, E and F are the enlarged picture of the dashed areas in A, B, and C, respectively. Bars in A and B = 5 μm, Bars in C = 2 μm, Bars in D, E, and F = 1 μm; G： expression of photosynthesis and chloroplast development related genes. The gene expression level of the wild type is set to “1”. ** indicates extremely significant difference at P ＜ 0.01 as determined by t-test.

2.4 Tsa1基因的精細(xì)定位

用tsa1突變體與秈稻“南京11”雜交, 所得F1代植株表型正常, F2代群體中出現(xiàn)明顯的分離, 其中正常單株1186株, 突變型單株368株, 符合3∶1的分離比例(χ2= 1.5027 ＜ χ20.05,1), 說明該突變性狀受單個隱性核基因控制。選取在兩親本間有多態(tài)性的463個均勻分布于水稻 12條染色體上的 SSR和InDel標(biāo)記, 采用極端隱性個體定位的方法, 利用F2群體中10株極端單株進行初步連鎖分析。結(jié)果顯示突變基因與位于第 5染色體長臂的 SSR標(biāo)記RM19159和RM5907存在連鎖關(guān)系。而后在該區(qū)間內(nèi)設(shè)計了8對InDel標(biāo)記(表1), 利用篩選到的368株極端個體, 將突變基因定位到InDel標(biāo)記Indel-12和Indel-16之間, 物理距離為163 kb (圖6)。

3 討論

葉綠體的分化是在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核遺傳物質(zhì)的協(xié)同調(diào)控下完成的, 一般可分為3個步驟[20-21], 第1階段, 當(dāng)葉片原基分化為分生組織時, 激活了質(zhì)體的復(fù)制及質(zhì)體DNA的合成; 第2階段, 分生組織細(xì)胞不斷擴增, 由核編碼的質(zhì)體RNA聚合酶開始優(yōu)先轉(zhuǎn)錄質(zhì)體轉(zhuǎn)錄和翻譯元件相關(guān)基因, 質(zhì)體中翻譯和轉(zhuǎn)錄活性大大增加, 葉綠體遺傳系統(tǒng)元件建立; 最后, 葉肉細(xì)胞成熟, 質(zhì)體編碼的RNA聚合酶開始轉(zhuǎn)錄光合作用相關(guān)元件, 至此葉綠體發(fā)育形成[22]。很多研究表明, 葉綠體的發(fā)育受環(huán)境溫度顯著影響。例如, OsV1基因編碼了定位于葉綠體的NUS1蛋白,免疫沉淀顯示其能夠與質(zhì)體中的RNA相結(jié)合, 該基因的突變影響了低溫下葉綠體核糖體 RNA的正常積累, 導(dǎo)致質(zhì)體蛋白合成及葉綠體發(fā)育的異常[7]。水稻中的 OsV2編碼一個定位在質(zhì)體和線粒體上的鳥苷酸激酶(guanylate kinase), 該酶是鳥嘌呤代謝通路中的關(guān)鍵酶, 催化GMP磷酸化形成GDP, 該基因的突變導(dǎo)致了葉綠體在低溫條件下蛋白翻譯機制的缺陷, 從而使葉綠體的分化受到抑制[8]。OsV4編碼一個在水稻幼葉中高表達的PPR蛋白, osv4突變體幼苗在低溫下葉片光合色素的含量下降、葉綠體異常,分析顯示其中核糖體組分(葉綠體16S和23S rRNA)和質(zhì)體編碼聚合酶(PEP)依賴型轉(zhuǎn)錄本的表達水平顯著降低, 進而導(dǎo)致其早期葉綠體發(fā)育障礙[13]。TCD9基因編碼Cpn60蛋白α亞基(Cpn60α), 在低溫脅迫下水稻 TCD9基因的突變阻礙了 FtsZ的轉(zhuǎn)錄/翻譯, 影響了質(zhì)體分裂, 導(dǎo)致葉片早期葉綠體結(jié)構(gòu)的異常[14]。在wlp1突變體中, 編碼葉綠體50s核糖體蛋白 L13 (RPL13)的 WLP1 基因發(fā)生突變, 導(dǎo)致突變體低溫條件下rpoA和rpoB基因的錯誤翻譯進而破壞了質(zhì)體編碼聚合酶(PEP)的合成, 引起葉片和穗子的白化[15]。由此可見, 絕大多數(shù)溫敏型白化突變體中, 某些葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯受到了影響, 而低溫脅迫能夠進一步抑制葉綠體相關(guān)蛋白、光合色素的合成, 顯著影響葉綠體發(fā)育, 進而出現(xiàn)明顯的白化表型。

表1 水稻第5染色體上的連鎖標(biāo)記Table 1 Linkage markers used in the fine mapping on the rice chromosome 5

圖6 Tsa1基因的精細(xì)定位Fig. 6 Fine mapping of Tsa1 gene

本研究中, tsa1突變體只在低溫下出現(xiàn)突變表型, 在20～24℃條件下葉片及葉鞘明顯白化, 而在較高溫度下突變體植株趨于正常。深入觀察tsa1突變體白化植株發(fā)現(xiàn), 其中正常葉綠體數(shù)量稀少, 取而代之的是大量小型的異常葉綠體, 該結(jié)構(gòu)具有自發(fā)熒光, 說明其中含有光合色素。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)異常葉綠體具有較高的電子密度, 說明其中含有較為豐富的蛋白質(zhì)內(nèi)容物, 但是沒有觀察到典型的類囊體垛疊結(jié)構(gòu)。表達分析結(jié)果顯示, tsa1突變體中光合作用相關(guān)基因下調(diào), 葉綠體發(fā)育第 2階段相關(guān)基因表達顯著上調(diào)。這些結(jié)果暗示該突變基因可能影響了葉綠體的后期發(fā)育, 使葉綠體滯留在發(fā)育中間階段。而之前報道的水稻白化突變體中, 葉綠體的形態(tài)幾乎喪失, 取而代之的是只含有嗜鋨體的空泡狀結(jié)構(gòu)[9,12,16-17], 這與本研究中報道的tsa1突變體有所不同, 因此對該突變體的深入研究很有可能拓展我們對葉綠體發(fā)育的認(rèn)識。目前, 我們已經(jīng)將TSA1基因鎖定在第5染色體長臂163 kb的區(qū)間內(nèi), 包含編號為OSJBa0009C07、OJ1007H05和OJ1115D04的3個BAC克隆。已經(jīng)克隆的水稻葉色相關(guān)基因中, 僅有4個基因分布于第5染色體, 且均與TSA1處于不同位置。其中, YGL1基因編碼葉綠素合成酶, 位于編號為AC136221的BAC克隆上[23]; BGL基因編碼一個鳥嘌呤核苷酸交換因子 OsRopGEF10, 定位于編號為OJ1126D01的BAC克隆上[24]; OsHAP3B和OsHAP3C編碼產(chǎn)物為CAAAT-box 結(jié)合復(fù)合體HAP的亞基, 分別定位于編號為 OJ1280A04和OJ1735C10的BAC克隆上[25]。根據(jù)預(yù)測, Tsa1定位區(qū)間內(nèi)包含28個ORF, 其中Os05g0586300編碼產(chǎn)物具有DNA結(jié)合/轉(zhuǎn)錄激活活性, Os05g0587300編碼產(chǎn)物屬于HSP40分子伴侶家族, Os05g0588100編碼一個定位于葉綠體的?；鞍琢蝓ッ? Os05g0586500編碼一個氨基酸轉(zhuǎn)運子, 此外還含有眾多功能未知的蛋白質(zhì)。目前, tsa1突變體中目的基因的鑒定工作正在進行, 該基因的圖位克隆及深入研究有助于我們深入了解葉綠體發(fā)育途徑, 對于提高水稻光合效率, 進而提高產(chǎn)量, 具有積極的意義。

4 結(jié)論

tsa1是一個溫敏型的白化突變體, 低溫(20～24℃)下突變體植株明顯白化, 葉綠素 a和類胡蘿卜素的含量顯著降低, 而高溫(28～32℃)下突變體外觀及光合色素含量趨于正常。成熟期, 突變體 tsa1的主要農(nóng)藝性狀與野生型沒有顯著差異。低溫下tsa1突變體白化組織中葉綠體發(fā)育停滯, 出現(xiàn)了大量小型異常葉綠體結(jié)構(gòu), 該結(jié)構(gòu)中含有光合色素及嗜鋨體,但無類囊體片層結(jié)構(gòu)。經(jīng)過精細(xì)定位, Tsa1基因被鎖定在第5染色體長臂物理距離為163 kb的區(qū)域內(nèi)。

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Phenotypic Characterization and Gene Mapping of a Thermo-sensitive Albino Leaf Mutant tsa1 in Rice

LIU Yu-Long1,**, LIU Feng1,**, ZHOU Kun-Neng3, SU Xiao-Mei1, FANG Xian-Wen2, ZHANG Yun-Hui2,*, and BAO Yi-Qun1,*

1College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Jiangsu Agricultural Germplasm Resources Conservation and Utilization Platform, Nanjing 210014, China;3Rice Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, China

A thermo-sensitive albino leaf mutant tsa1 was obtained from Ningjing 36 induced by ethyl methane sulfonate (EMS). The mutant developed albinotic leaves under low temperature (20-24°C), and the color of mutant leaves was comparable with the wild-type under high temperature (28-32°C). Compared with wild type, the chlorophyll a and carotene contents of mutant albinotic leaves obviously decreased under low temperature condition. With microscope observation, the quantity of normal chloroplast significantly decreased, besides, there were a large number of small abnormal chloroplasts in albinotic leaves. The abnormal chloroplast in albinotic tissue of mutant had no obvious thylakoid stack under transmission electron microscopy. These results indicate that tsa1 mutant has defect on chloroplast development under low temperature. Genetic analysis indicated that the mutant phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene. Genetic mapping of the mutant gene was conducted using 368 recessive individuals from F2population of tsa1/Nanjing 11, the target gene was finally located in a 163 kb region on the chromosome 5. This study provides a basis for map-based cloning and functional analysis of the target gene.

Rice (Oryza sativa L.); Thermo-sensitive; Albino; Mutant; Chloroplast development

10.3724/SP.J.1006.2016.01754

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31401036), 江蘇省自然科學(xué)基金項目(BK20130706), 江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[CX(14)5005],江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項[ZX(15)4015]和安徽省自然科學(xué)基金項目(1408085MKL62)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation (31401036), the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20130706), the Jiangsu Province Agricultural Science and Technology Independent Innovation Foundation [CX(14)5005], the Jiangsu Academy of Agricultural Sciences Fundamental Research Projects [ZX(15)4015], and the Natural Science Foundation of Anhui Province (1408085MKL62).

*通訊作者(Corresponding authors)： 鮑依群, E-mail： baoyiqun@njau.edu.cn, Tel： 025-84396795; 張云輝, E-mail： zyhrice@163.com, Tel：025-84390321

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

聯(lián)系方式： 劉鈺龍, E-mail： 2013116120@njau.edu.cn; 劉峰, E-mail： liufeng@njau.edu.cn

稿日期)： 2016-03-21; Accepted(接受日期)： 2016-07-11; Published online(

日期)： 2016-08-24.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160824.0914.002.html