孫守坤 叢立新 郭環(huán)宇

(吉林省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，吉林 長春 130012)

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白芷總揮發(fā)油對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響

孫守坤 叢立新1郭環(huán)宇

(吉林省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，吉林 長春 130012)

目的 探討白芷總揮發(fā)油(EOAD)對(duì)完全弗氏佐劑(CFA)誘導(dǎo)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用，并探討其作用機(jī)制。方法 Wistar 大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、地塞米松組(5 mg/kg)、EOAD低劑量組(70 mg/kg)和高劑量組(140 mg/kg)。除空白對(duì)照組外，各組大鼠足趾皮內(nèi)注射CFA誘導(dǎo)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，于造模第15天起連續(xù)給藥7 d，觀察EOAD對(duì)大鼠體重、足腫脹及臟器指數(shù)的影響；檢測(cè)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中腫瘤壞死因子(TNF)-α、前列腺素(PG)E2、一氧化氮(NO) 含量及一氧化氮合酶(NOS)活力。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠體重增長緩慢，足腫脹明顯，關(guān)節(jié)炎評(píng)分增加，胸腺和脾指數(shù)明顯增加，血清中NO、PGE2和TNF-α含量及NOS活力均明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，EOAD治療可顯著減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠右后足的足腫脹(P<0.05)，降低關(guān)節(jié)炎評(píng)分，并使大鼠體重及臟器指數(shù)增加，同時(shí)明顯降低血清中NOS活力和NO、TNF-α、PGE2 的含量(P<0.01)。結(jié)論 EOAD對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎有顯著抑制作用，其作用機(jī)制可能與降低血清炎癥細(xì)胞因子TNF-α，PGE2水平及NOS活力有關(guān)。

白芷；佐劑性關(guān)節(jié)炎

風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、頸椎病、肩周炎、滑膜炎等疾病均屬于無菌性炎癥，發(fā)病率很高，嚴(yán)重危害人類的健康〔1〕。中醫(yī)將無菌性炎癥歸屬于“痹癥”，在治療上有悠久的歷史，具有多層面、多靶點(diǎn)的獨(dú)特優(yōu)越性〔2〕。白芷為40種大宗常用藥材之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性溫、味辛，具有祛風(fēng)止痛、排膿消腫之功效，主治感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻淵頭痛、牙痛、風(fēng)濕痹痛、瘡瘍腫痛等，是《中國藥典》中出現(xiàn)頻率最高，效果最好的中藥抗炎鎮(zhèn)痛藥之一〔3〕。揮發(fā)油是白芷的主要有效成分。有研究證實(shí)，白芷總揮發(fā)油(EOAD)可通過降低疼痛模型大鼠腦干去甲腎上腺素(NE)含量，升高多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)含量，起到確切的鎮(zhèn)痛作用〔4〕。但EOAD是否具有抗炎作用尚未見報(bào)道。本研究擬觀察EOAD對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 EOAD(沈陽索福爾超臨界萃取設(shè)備有限公司制備，川白芷飲片4 kg，粉碎過40目篩，經(jīng)CO2超臨界萃取，萃取條件：壓力18 mPa，溫度40℃，時(shí)間2 h，得EOAD 20 g)。完全弗氏佐劑(CFA，北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所提供)，地塞米松(河南潤弘制藥股份有限公司)，一氧化氮合酶(NOS)和一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，前列腺素(PG)E2和腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA檢測(cè)試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 儀器 PV-200足趾容積測(cè)量儀(成都泰盟科技有限公司)；Infinite M200TECAN酶標(biāo)儀(瑞士TECAN集團(tuán)公司)；ESJ110-4B電子分析天平(沈陽龍騰電子有限公司)；MH-2微量振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；低溫離心機(jī)(美國Thermo公司)。

1.3 動(dòng)物 雄性Wistar大鼠，體重(170±10)g，長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(吉)：2012-0005。實(shí)驗(yàn)前，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，選擇活動(dòng)正常和狀態(tài)良好的鼠納入實(shí)驗(yàn)，分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度控制在18℃～22℃，濕度40%～60%，自由飲食飲水，3 d更換1次無菌墊料。

1.4 大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型制備及給藥 40只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、地塞米松組、EOAD低、高劑量組。除空白對(duì)照組大鼠外，其余四組大鼠右后足底部常規(guī)消毒，皮內(nèi)注射CFA 10 mg/ml，0.1 ml/只，誘導(dǎo)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型。于造模后第15天，地塞米松組大鼠給予5 mg/kg地塞米松皮下注射，EOAD治療組大鼠分別給予EOAD 70 mg/kg和140 mg/kg灌胃，而空白對(duì)照組及模型組大鼠分別給予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)用藥7 d。

1.5 關(guān)節(jié)炎的評(píng)價(jià) 造模前后、治療前后仔細(xì)觀察大鼠足部腫脹情況、活動(dòng)情況、體毛的色澤、神志及進(jìn)食情況的動(dòng)態(tài)變化。與此同時(shí)，每3 d測(cè)量1次大鼠體重及大鼠右足足爪容積(ml)。足腫脹度計(jì)算：足腫脹度(ml)=致炎后致炎側(cè)后足容積(ml)-致炎前同側(cè)后足容積(ml)。

1.6 血清中NO，PGE2，TNF-α含量及NOS活性的檢測(cè) 造模后第24天，末次測(cè)量足爪容積后，各組大鼠以烏拉坦(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血并處死。每只大鼠約取血4～5 ml，分離血清，用于檢測(cè)NO、PGE2、TNF-α含量及NOS活力。血清NO含量及NOS活力檢測(cè)采用酶法，PGE2和TNF-α含量采用ELISA方法，具體檢測(cè)方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件，多組間比較用單因素方差分析(One Way ANOVA)，兩組間比較采用最小顯著差(LSD)t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 EOAD對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠體重的影響 造模前各組大鼠體重?zé)o顯著性差異，空白對(duì)照組大鼠隨著時(shí)間的增長體重呈現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定增長的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，模型組大鼠在注射CFA后體重增長緩慢，并于第12天體重(234.86±11.36)g低于對(duì)照組〔(248.71±11.27)g，P<0.05〕。與模型組相比，EOAD 給藥組可不同程度地增加關(guān)節(jié)炎大鼠體重，于第18天(即給藥后第4天)體重高于模型組(P<0.05)。地塞米松組大鼠體重明顯下降，低于空白對(duì)照組和模型組(P<0.01)。見圖1。

2.2 EOAD對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足腫脹的影響 各組大鼠右后足容積在造模前(0 d)沒有明顯差別，從注射CFA后第3天起，各組大鼠右后足即有明顯腫脹，說明大鼠原發(fā)性足腫脹造模成功。與模型組比較，地塞米松組大鼠右后足腫脹從給藥后第2天起明顯減輕(P<0.01)，EOAD低、高劑量組大鼠右后足腫脹從給藥后第4天(即造模第18天)起也開始明顯減輕(P<0.05)。見圖2。

2.3 EOAD對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠胸腺和脾指數(shù)的影響 如表1所示，模型組大鼠的胸腺、脾指數(shù)明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)；而低、高劑量EOAD組大鼠的胸腺、脾指數(shù)低于模型組(P<0.05)。地塞米松組大鼠的胸腺、脾指數(shù)不僅明顯低于模型組而且低于空白對(duì)照組(P<0.01)。見表1。

2.4 EOAD對(duì)大鼠血清NO、NOS、PGE2和TNF-α的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清NO含量、NOS活力、PGE2和TNF-α水平均明顯升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，地塞米松組、EOAD低、高劑量組大鼠血清NO含量、NOS活力、PGE2和TNF-α水平均顯著降低(P<0.05 或P<0.01)。見表1。

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01，下圖表同圖1 EOAD對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠體重的影響

圖2 EOAD對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足腫脹的影響

組別胸腺指數(shù)(%)脾指數(shù)(%)NO(μmol/ml)NOS(U/ml)PGE2(ng/L)TNF?α(ng/L)空白對(duì)照組016±0024027±00262384±5921446±38233537±46491770±189模型組021±00411)035±00371)7041±12042)5296±10262)45833±38832)2170±1991)EOAD低劑量組018±0038031±00426691±7284316±2913)40511±55343)2026±1423)EOAD高劑量組017±00213)025±00293)5317±8823)3708±2843)36081±33734)1924±1473)地塞米松組003±00034)021±00364)3627±8334)2152±3144)34801±39874)1859±1673)

3 討 論

白芷為傘形科( Umbeliferae)當(dāng)歸屬 (Angelica )植物的根，是一種臨床常用的解表藥，經(jīng)適當(dāng)配伍廣泛用于全身各部位的疼痛病癥，如中藥復(fù)方制劑都梁丸、元胡止痛片等均含有白芷，療效顯著〔5〕。白芷具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎和解痙作用〔6〕，但關(guān)于白芷發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究較少。

佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠模型是以細(xì)胞免疫功能紊亂為主的經(jīng)典自身免疫性炎癥模型，其關(guān)節(jié)組織學(xué)特點(diǎn)包括滑膜增生、單核細(xì)胞浸潤、關(guān)節(jié)軟骨及骨組織破壞，與人類的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)相似〔7〕。本研究結(jié)果顯示EOAD對(duì)FCA誘導(dǎo)的大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎即自身免疫性炎癥具有一定抑制作用。雖然其對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹的改善程度弱于地塞米松，但是EOAD治療組大鼠的一般狀況明顯改善，如飲食量增加、體重增長和關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙減輕等，而地塞米松組在顯著抑制炎癥的同時(shí)大鼠出現(xiàn)皮毛無光澤、食欲減退、體重減輕甚至低于模型組等癥狀，提示EOAD對(duì)大鼠的副作用弱于地塞米松。

胸腺和脾臟是機(jī)體的主要免疫器官，在某些免疫抑制劑的作用下二者均可出現(xiàn)不同程度的萎縮；而免疫增強(qiáng)劑可使二者增重〔8〕。因此，胸腺和脾臟指數(shù)是觀察藥物對(duì)免疫功能影響的重要指標(biāo)。地塞米松可顯著抑制機(jī)體免疫功能，甚至造成胸腺萎縮，而本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與其一致〔9〕。EOAD可能具有免疫調(diào)節(jié)作用，并有可能是其治療關(guān)節(jié)炎的作用途徑，這方面還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

炎癥因子的釋放在炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生和加劇過程中起到了重要作用。其中NO對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有雙重作用，低水平的NO作為信號(hào)分子，可參與免疫應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而高水平NO作為細(xì)胞毒性因子卻發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，并介導(dǎo)免疫損傷〔10〕。RA時(shí)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌大量NO，引起RA軟骨破壞；同時(shí)，NO可促進(jìn)巨噬細(xì)胞合成釋放TNF-α和白細(xì)胞介素(IL)-1等炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致滑膜和炎性細(xì)胞產(chǎn)生〔11〕。NO也可通過激活環(huán)氧酶促進(jìn)PGE2產(chǎn)生，PGE2能選擇性抑制Ts細(xì)胞功能，導(dǎo)致B細(xì)胞功能亢進(jìn)，釋放出大量的抗體，損傷體內(nèi)組織器官，這是形成RA 的重要原因〔12〕。本文結(jié)果表明EOAD治療使佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中NO合成關(guān)鍵酶NOS活力及NO水平降低的同時(shí)，血清中TNF-α、PGE2水平也明顯下降，說明EOAD的抗感染作用與其抑制炎癥病變部位炎性因子活性和降低這些炎癥介質(zhì)含量有關(guān)。

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〔2015-11-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

郭環(huán)宇(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合研究。

孫守坤(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合研究。

R28

A

1005-9202(2016)22-5544-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.022

1 長春中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部二療區(qū)