譚詩夢，敖小平，符澤華，覃建庸，徐剛標，盧孟柱

（1.中南林業(yè)科技大學，湖南 長沙 410004；2. 中國林業(yè)科學研究院林研所，北京 100091）

胡楊大片段轉(zhuǎn)化擬南芥植株表型分析

譚詩夢1，敖小平1，符澤華1，覃建庸1，徐剛標1，盧孟柱2

（1.中南林業(yè)科技大學，湖南 長沙 410004；2. 中國林業(yè)科學研究院林研所，北京 100091）

胡楊是研究林木對極端逆境響應的首選材料。開展胡楊隨機插入大片段遺傳轉(zhuǎn)化，克服了單基因?qū)χ参锉硇偷奈⑿灰讬z測的難題，是植物基因功能研究思路的新嘗試。用花序浸染法將胡楊基因大片段轉(zhuǎn)化到擬南芥中，篩選出有特異性狀并穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)化型植株。表型分析結果表明，轉(zhuǎn)化型擬南芥植株與野生型的生長性狀存在明顯差異，與野生型相比，轉(zhuǎn)化型種子粒徑增長達14%、千粒重增加達27%，這為進一步開展該基因大片段功能研究，奠定了前期實驗基礎。

胡楊大片段；BIBAC；花序浸染法；遺傳轉(zhuǎn)化

胡楊Populus euphratica為耐鹽堿而非鹽生植物，是我國西北戈壁沙漠荒原上特有的高大喬木，已成為研究木本植物耐鹽堿、干旱、高溫等極端逆境的首選材料[1]。近年來，植物逆境應答基因的功能及其表達調(diào)控受到廣泛重視[2-3]，但大多數(shù)研究仍處于單基因克隆探索的階段，鮮有大片段基因的系統(tǒng)整合及對基因簇整體功能的報道[4]。植物抗逆性狀通常是由多基因及基因簇協(xié)同作用的結果，單基因研究已不能很好地闡明植物抗逆的分子機理，因此，開展多基因大片段的功能研究是植物分子遺傳研究的需求，具有廣闊的發(fā)展空間[5]。

文庫構建、芯片雜交和測序技術的快速發(fā)展為植物全基因組中特異性關鍵基因的挖掘、分離和功能鑒定提供了多種手段[6]。Miranda等[7]和Hamilton等[8]基于細菌人工染色體（bacterial arti ficial chromosome，BAC）構建了在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中穿梭復制的雙元載體雙元細菌人工染色體（binary BAC，BIBAC），通過農(nóng)桿菌真空侵染植株直接將外源基因整合到擬南芥基因組中[9]，在此基礎上，Clough & Bent探索出花序浸染法[10]。本研究以胡楊基因組大片段隨機插入pCLD04541質(zhì)粒（見圖1）構建的BIBAC文庫，采用花序浸染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，篩選生長特異型轉(zhuǎn)化型植株，旨在為進一步探索胡楊基因組大片段序列的功能奠定前期研究基礎。

圖1 pCLD04541質(zhì)粒圖譜Fig. 1 The plasmid pro file of pCLD04541

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

農(nóng)桿菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基，植物組織培養(yǎng)采用MS培養(yǎng)基。

1.2 供試文庫、農(nóng)桿菌及擬南芥

選用雙元載體pCLD04541構建胡楊全基因組BIBAC文庫[9]，載體文庫由美國德克薩斯農(nóng)工大學張洪斌實驗室構建。依據(jù)384孔板上的位置，確定農(nóng)桿菌菌株編號。

pCLD04541質(zhì)粒全長約27.3 kb，攜帶四環(huán)素（Tet）抗性基因及新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPT II）基因。檢測引物序列為[11]：

Tet R3：5′-TCAACGTTCCTGACAACGAG-3′；

Tet F3：5′-GTCTGACGACACGCAAACTG -3′；

NPT-R：5′-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG- 3′；

NPT-F：5′-ATCTCCTgTCATCTCACCTTgCTC CT-3′。

引物由華大基因公司合成。Tet擴增片段大小約為540 bp，NPT II擴增片段大小約為490 bp。

擬南芥室內(nèi)培養(yǎng)條件為：溫度22 ℃，16 h光照，8 h黑暗。

1.3 擬南芥轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌解凍后，依次進行搖菌培養(yǎng)、劃平板培養(yǎng)、挑單菌落擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為28 ℃。質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒DNA后，進行PCR檢測。

菌液經(jīng)離心機濃縮，棄上清液，用質(zhì)量體積比為50%的蔗糖溶液重懸，按0.5%體積加入silwet-77配制轉(zhuǎn)化液。選擇主莖長5～10 cm的擬南芥倒置，使主莖全部浸沒在轉(zhuǎn)化液中，輕輕轉(zhuǎn)動60 s，確保轉(zhuǎn)化液均勻包裹花穗[12]。浸花后，覆蓋保鮮膜，黑暗中放置12～16 h后，光照培養(yǎng)。5～7 d轉(zhuǎn)化1次，直到盛花期結束。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株篩選、移栽

收獲的種子滅菌后，用0.1%無菌瓊脂溶液重懸，均勻鋪板，晾干，在抗性板和無抗生素平板上鋪野生型種子作為對照。4 ℃春化2～3 d后，于溫度20～23 ℃、濕度60%～70%、16 h光照8 h黑暗的條件下培養(yǎng)[12]。

挑取葉片顏色正常的植株移植于土壤中，定期觀察、記錄生長情況。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株分子檢測

擬南芥葉片總DNA提取，采用CTAB法[13]。CTAB濃度為3.0%，巰基乙醇濃度為0.4%。

PCR擴增反應體系與程序參考文獻[11]。PCR擴增產(chǎn)物，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。

1.6 數(shù)據(jù)分析

隨機抽取轉(zhuǎn)化型T1代和野生型擬南芥種子各5 000粒，游標卡尺測量粒徑，電子分析天平稱量千粒重，重復3次。采用SPSS statistics 19軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株篩選、檢測

68A1B2號農(nóng)桿菌質(zhì)粒的分子檢測結果見圖2。由圖2可知，擴增片段大小約為540 bp，表明所用的68A1B2號農(nóng)桿菌質(zhì)粒保留外源片段，可用于侵染。

68A1B2轉(zhuǎn)化型T1代擬南芥的分子檢測結果見圖3，擴增片段大小約為490 bp，表明擬南芥轉(zhuǎn)化型攜帶有NPT II片段。

圖2 68A1B2號農(nóng)桿菌PCR檢測瓊脂糖凝膠電泳圖像Fig. 2 Gel electrophoresis image of 68A1B2 Agrobacterium

圖3 68A1B2轉(zhuǎn)化型擬南芥PCR檢測瓊脂糖凝膠電泳圖像Fig. 3 Gel electrophoresis image of transformed Arabidopsis

2.2 轉(zhuǎn)基因植株生長表現(xiàn)

68A1B2轉(zhuǎn)化型與野生型擬南芥植株在不同生長期的表型差異見圖4。由圖4可知，播種5周后，相對于野生型，68A1B2轉(zhuǎn)化型開花提早，生長快（圖4A）。播種8周后，68A1B2轉(zhuǎn)化型植株較野生型更高，主莖增多（圖4B）。68A1B2轉(zhuǎn)化型植株主莖頂端可見多果莢輪生，但野生型植株頂端停止發(fā)育（圖4C）。與野生型植株相比，68A1B2轉(zhuǎn)化型的主莖相對位置上著生的果莢長度差異不明顯，但果莢數(shù)增多，節(jié)間長度明顯不均勻（圖4D）。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株種子特征

68A1B2轉(zhuǎn)化型和野生型擬南芥的種子粒徑及千粒重數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結果見圖5。由圖5可知，68A1B2轉(zhuǎn)化型擬南芥T1代種子比野生型擬南芥種子粒徑增大14%、千粒重增加近27%，在統(tǒng)計學上有顯著意義（P＜0.05）。

圖4 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的生長特征Fig. 4 Growth characteristics of transgenic Arabidopsis

圖5 2種擬南芥植株種子性狀統(tǒng)計Fig. 5 Seed characteristics statistical figure of two types of Arabidopsis

3 結論與討論

2013年公布的胡楊全基因組序列，為進一步探索有價值的性狀和功能提供了藍本[14]。同年，中國林業(yè)科學研究院構建了胡楊轉(zhuǎn)化基因組學的BIBAC文庫，用于分析胡楊的耐鹽基因簇及其它潛在的有益片段[11]。在此基礎上，通過胡楊基因組大片段轉(zhuǎn)化擬南芥的研究，發(fā)現(xiàn)和驗證胡楊基因簇功能的報道日益增多[15]。如，朱曉靜獲得了全黃化擬南芥植株，并探知該插入片段位于擬南芥第5條染色體，推測插入片段與葉綠體發(fā)育有關[16]。王智獲得了赤霉素高合成擬南芥轉(zhuǎn)化植株，并檢測到植株內(nèi)赤霉素水平明顯高于野生型擬南芥，但沒有提供性狀與外源片段表達直接相關的證據(jù)[17]。

本研究表明，攜帶胡楊大片段基因的擬南芥轉(zhuǎn)化型植株在側(cè)枝發(fā)育、種子表型等方面與野生型存在明顯差異。種子生長與植物激素分泌[18]、泛素途徑[19]或相關調(diào)控[20-21]有關，調(diào)控花發(fā)育[22]、側(cè)枝發(fā)育[23]等相關基因也可能參與植物生長過程。胡楊大片段基因長度遠超過單個基因序列的長度，其功能是否與上述分子機理有關，目前還不清楚。為了進一步探討68A1B2大片段基因的功能，下一步計劃針對68A1B2片段及其插入位點進行測序，分析胡楊68A1B2大片段在轉(zhuǎn)化型植株性狀表達中起到的作用，為胡楊轉(zhuǎn)化基因組學研究提供有益的補充。

本研究發(fā)現(xiàn)，大片段基因在農(nóng)桿菌GV3101內(nèi)能穩(wěn)定遺傳。但是，轉(zhuǎn)化型擬南芥表型隨著世代數(shù)增加而減弱甚至消失。這說明胡楊大片段基因作為外源物質(zhì)，農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)入擬南芥后，存在遺傳不穩(wěn)定現(xiàn)象。有研究報道，隨著插入片段長度增加，發(fā)生插入、缺失、倒位等結構變異的可能性也增加[24]；也有研究認為，外源片段成功整合到植物基因組后，可能發(fā)生高效表達、破壞正常閱讀框或打斷調(diào)控3種情況[25]。Zhang等[26]認為大片段基因的BIBAC克隆在轉(zhuǎn)基因植物中，尤其在遠源物種中的穩(wěn)定性還需要深入探索。本研究中轉(zhuǎn)化型植株表型隨著世代的增加，表型減弱或消失的原因，還有待進一步研究。

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The phenotypic analysis of Arabidopsis thaliana transformed by Populus euphratica genome fragment

TAN Shi-meng1, AO Xiao-ping1, FU Ze-hua1, QIN Jian-yong1, XU Gang-biao1, LU Meng-zhu2
(1. Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China)

Populus euphratica is one of valuable material on abiotic stress research of trees. It is a new attempt to research plant gene function that using random genome fragments but not a single gene of P. euphratica to transform Arabidopsis. The study transform wildtype Arabidopsis (columbia) by the floral dip method, then specific traits of transformed plants were screened, recording the new phenotype and analyzing the new function, to explore the specific function of the Populus genome sequence. The experiments showed that the growth traits of transformed type Arabidopsis were significantly different from the wild-type. The grain size of the transformed seed increased nearly 14%, and the weight increased by nearly 27%, which laid a foundation for further study on the function of the inserted fragment.

Populus euphratica genome fragment; BIBAC; floral dip; transformation

S718.46；S792.119

A

1673-923X(2016)08-0053-04

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.08.011

2015-09-30

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金“胡楊功能基因組研究平臺構建和功能基因發(fā)掘”（CAFYBB2011001）

譚詩夢，碩士研究生

盧孟柱，教授；E-mail： lumz@caf.ac.cn；徐剛標，教授；E-mail：gangbiaoxu@163.com

譚詩夢，敖小平，符澤華，等. 胡楊大片段轉(zhuǎn)化擬南芥植株表型分析 [J].中南林業(yè)科技大學學報，2016, 36(8): 53-56.

[本文編校：文鳳鳴]