高燕芳，蔣麗霞，張 銘

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市婦幼保健院檢驗(yàn)科 213003)

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論著·臨床研究

iASPP基因在卵巢癌中的表達(dá)及其臨床意義

高燕芳，蔣麗霞△，張 銘

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市婦幼保健院檢驗(yàn)科 213003)

目的 檢測(cè)iASPP在卵巢癌中的表達(dá)，探索其在卵巢癌中的致病機(jī)制。方法 收集2013年5月至2014年12月于常州市婦幼保健院行卵巢腫瘤切除術(shù)的患者的癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本共32份，用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)iASPPmRNA相對(duì)表達(dá)水平并分析它與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 卵巢癌組織中iASPPmRNA水平明顯高于癌旁組織(P=0.001)，并且與卵巢癌病理分期相關(guān) (P<0.05)，iASPP表達(dá)水平與患者年齡、是否絕經(jīng)、組織學(xué)類型、術(shù)前有無化療、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、糖類蛋白125及糖類蛋白153表達(dá)情況無相關(guān)性，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論iASPPmRNA在卵巢癌組織中高表達(dá)顯示其在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。

卵巢腫瘤；iASPP;p53

卵巢癌是嚴(yán)重威脅婦女生命的女性生殖系統(tǒng)腫瘤之一，由于它極高的惡性程度及逐年上升的發(fā)病率，其致死率已居于婦科惡性腫瘤首位。眾所周知，腫瘤的發(fā)生涉及多種基因，這些基因在不同階段相繼發(fā)揮作用，而細(xì)胞凋亡是這個(gè)過程中至關(guān)重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，它對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程都具有十分重要的意義。現(xiàn)在許多腫瘤學(xué)研究都致力于細(xì)胞凋亡功能如何被調(diào)控及其發(fā)生異常的原因，目前已發(fā)現(xiàn)多種調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因，找出這些基因在卵巢癌發(fā)生過程中的作用機(jī)制，將對(duì)卵巢癌的診斷與治療有極其重要的意義。

p53凋亡刺激蛋白(apoptosis-stimulating protein of p53，ASPP)家族因?yàn)榫哂刑禺愓{(diào)控p53的的功能而被命名，是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)蛋白家族。ASPP1、ASPP2和iASPP(inhibitory member of the ASPP family)是這個(gè)家族的主要成員。該家族的特征性結(jié)構(gòu)是SH3結(jié)構(gòu)域，C-末端的錨蛋白重復(fù)序列以及富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域[1]。雖然3個(gè)家族成員的結(jié)構(gòu)相似，但它們的功能卻截然不同，其中ASPP1、ASPP2主要是與p53結(jié)合從而促進(jìn)p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；而iASPP則相反，它可以競爭性的與ASPP1、ASPP2結(jié)合p53蛋白來抑制p53的促細(xì)胞凋亡功能，因此具有癌基因的性質(zhì)[1]。p53基因是一種較為重要的抑癌基因，研究顯示它在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。由此可推測(cè)，iASPP有可能通過調(diào)節(jié)p53基因的表達(dá)，從而在卵巢癌中發(fā)揮重要作用。本研究用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測(cè)卵巢癌組織中iASPP的表達(dá)情況，分析它在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本試驗(yàn)標(biāo)本取自2013年5月至2014年12月于常州市婦幼保健院行卵巢腫瘤切除術(shù)的患者，術(shù)后標(biāo)本均通過病理檢查，最終證實(shí)為卵巢癌，共32例，組織學(xué)分類包括：22例漿液性腺癌，9例黏液性腺癌，1例透明細(xì)胞癌，患者平均年齡51歲(29～71歲)。癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織均于術(shù)中選取，肉眼下正常組織作為癌旁組織。術(shù)后新鮮組織用生理鹽水沖洗2～3遍，繼而被剪碎保存于組織凍存管中放在-80 ℃冰箱。

1.2 主要試劑 RNA分離及提取試劑購自美國 Invitrogen 公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司,反轉(zhuǎn)錄-PCR試劑盒購自美國 Fermentas 公司，iASPP和β-actin引物購自上海生工公司。

1.3 方法

1.3.1 組織標(biāo)本中總mRNA的提取 將50～100 mg組織用勻漿機(jī)打碎，加入Trizol裂解并提取mRNA。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度，分析所提取mRNA質(zhì)量，選取純度較高者繼續(xù)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

1.3.2 第1鏈cDNA的合成 參照反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說明書進(jìn)行第1鏈cDNA的合成。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，分別為DEPC 9 μL，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL，隨機(jī)引物Oligo 1 μL，dNTP 2 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，RNA模板3 μL。最后轉(zhuǎn)到PCR擴(kuò)增儀(Thermo)上25 ℃ 10 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。儲(chǔ)存第1鏈cDNA于4 ℃冰箱或立即行PCR。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)Genebank的基因序列，設(shè)計(jì)引物并對(duì)其特異性進(jìn)行比較。iASPP引物序列為：上游5′-GGC GGT GAA GGA GAT GAA C-3′ ；下游5′-TGA TGA GGA AAT CCA CGA TAG AG-3′。β-actin內(nèi)參基因引物序列為：上游5′-GGC GGC ACC ACC ATG TAC CCT-3′ ；下游5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3′ 實(shí)時(shí)熒光定量PCR在熒光定量PCR儀 Light Cycler1.5(Roche)上檢測(cè)，反應(yīng)體系為20 μL，分別為：第1鏈cDNA 2 μL，2×SYBR Green Mix 10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，去離子水7.0 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，收集熒光，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s，60 ℃1 min，95 ℃10 s。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳分離，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物特異性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。卵巢癌組織與癌旁組織間iASPP mRNA表達(dá)水平的差異用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析；Mann-Whitney U-test分析iASPP mRNA相對(duì)表達(dá)量與卵巢癌臨床特征是否相關(guān)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 擴(kuò)增特異性 iASPP和β-actin兩種擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線呈單一峰，溶解溫度與產(chǎn)物的預(yù)期溶解溫度相符(圖1)。

圖1 iASPP與β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線

2.2 iASPP在卵巢癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá) 與癌旁組織相比，iASPP mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)量明顯偏高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，見圖2。

2.3 iASPP mRNA表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系 統(tǒng)計(jì)分析顯示，iASPP mRNA卵巢癌不同臨床分期中的表達(dá)，Ⅰ期與Ⅱ、Ⅲ期相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。iASPP mRNA與卵巢癌患者的年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤組織學(xué)類型、術(shù)前有無化療、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CA125及CA153水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 iASPP mRNA在卵巢癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平

特征nP年齡<51歲170.710≥51歲15絕經(jīng)否190.426是13組織學(xué)類型漿液性腺癌220.375囊液性腺癌9透明細(xì)胞癌1臨床分期Ⅰ期120.002Ⅱ～Ⅲ期20淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無200.924有12術(shù)前化療否200.893是12CA125陰性50.285陽性27CA153陰性160.468陽性16

3 討 論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而自主進(jìn)行的有序死亡的過程，腫瘤形成和發(fā)展的一個(gè)重要原因就是細(xì)胞凋亡功能異常進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞過度增生。p53是一個(gè)重要抑癌基因，細(xì)胞受到DNA損傷、輻射等一系列物理或化學(xué)刺激后，p53基因就會(huì)被激活，繼而作用于其下游基因引起一系列反應(yīng)：首先，DNA損傷后p53表達(dá)迅速上升，誘導(dǎo)p21轉(zhuǎn)錄水平提高，將細(xì)胞周期抑制在G1期，這樣細(xì)胞在進(jìn)入S期之前通過DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)損傷的DNA就有了足夠的時(shí)間；其次，若損傷太大導(dǎo)致無法修復(fù)時(shí)，p53會(huì)通過誘導(dǎo)Bax等凋亡基因的表達(dá)使其加速細(xì)胞凋亡過程，從而抑制廣泛性DNA損傷的細(xì)胞通過克隆性生長引發(fā)腫瘤。

iASPP由人類PPP1Rl3L基因編碼[1]。全長的iASPP由828個(gè)氨基酸構(gòu)成，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)[2]。一系列研究均已證實(shí)iASPP對(duì)p53具有負(fù)性調(diào)節(jié)功能。近年來，隨著對(duì)iASPP研究的不斷深入，已發(fā)現(xiàn)iASPP在宮頸癌[3]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[4]、大腸癌[5]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[6]、前列腺癌[7]等多種腫瘤組織中表達(dá)偏高。本研究用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析卵巢癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中iASPP mRNA的相對(duì)水平，結(jié)果顯示：卵巢癌組織中的iASPP表達(dá)量相比癌旁組織明顯升高；iASPP在卵巢癌組織中的表達(dá)量與卵巢癌臨床分期有關(guān)。Cao等[8]研究還發(fā)現(xiàn)子宮頸癌中iASPP表達(dá)水平升高還與腫瘤放化療抵抗相關(guān)。Liu等[9]等指出iASPP表達(dá)升高與頭頸腫瘤預(yù)后差相關(guān)。這些都表明iASPP在腫瘤的發(fā)生過程發(fā)揮了重要作用。

p53是一個(gè)重要的抑癌基因，在人類腫瘤中，有一部分腫瘤的p53基因發(fā)生突變，導(dǎo)致它促細(xì)胞凋亡功能異常而引發(fā)腫瘤；然而還有一部分腫瘤的p53基因結(jié)構(gòu)是正常的，即野生型p53，那么這些腫瘤中的p53為什么沒有抑制癌癥發(fā)生，研究證明，這些腫瘤細(xì)胞中存在著抑制p53的物質(zhì)使p53的功能喪失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在卵巢癌中p53的突變率可達(dá)到50%[10]，然而仍有一部分腫瘤表達(dá)野生型p53，在這些腫瘤中，正常的p53抑癌功能被抑制從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。iASPP能特異性抑制p53，若解除這種抑制作用，就有可能使腫瘤得到有效治療。研究指出MiR-124能直接作用于iASPP從而抑制腫瘤的生長和侵襲，包括腸癌、惡性膠質(zhì)瘤和前列腺癌[11-13]，但是否在卵巢癌中也起作用有待進(jìn)一步研究。除此之外，A34可直接與iASPP結(jié)合并完全抑制iASPP對(duì)p53的作用[14]。隨著醫(yī)學(xué)水平的提高，基因診斷及基因治療已成為腫瘤診斷與治療過程中不可或缺的手段，本研究顯示iASPP在卵巢中致病過程中發(fā)揮重要作用，可能為卵巢癌的診斷與治療提供了一個(gè)新方向。

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Expression of iASPP gene in ovarian cancer and its clinical significance*

GaoYanfang,JiangLixia△,ZhangMing

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedChangzhouMunicipalMaternalandChildHealthCareHospital,NanjingMedicalUniversity,Changzhou,Jiangsu213003,China)

Objective To detect the expressions of iASPP in ovarian cancer and to investigate its pathogenic mechanism in ovarian cancer.Methods Totally 32 pair samples of ovarian cancer tissues and corresponding paracancerous tissues were collected in our hospital from May 2013 to December 2014.The iASPP mRNA relative expression level was detected using real-time PCR (RT-PCR).Its relation with the clinicopathological characteristics of ovarian cancer was analyzed.Results The iASPP mRNA level in ovarian cancer tissues was significantly higher than that in the paracancerous tissues (P=0.001) and which was associated with the pathological stage(P<0.05).The iASPP expression had no correlation with the age,menopause,histological subtype,preoperative chemotherapy,lymph node metastasis and expression level of CA125 and CA153,the differences were not statistically significant.Conclusion The high expression of iASPP in ovarian cancer tissues reveals its important role in the tumor occurrence process.

ovarian neoplasms；iASPP;p53

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.31.012

常州市衛(wèi)生計(jì)生委指導(dǎo)性科技項(xiàng)目(WZ201515)。

高燕芳(1985-)，碩士，住院醫(yī)師，從事腫瘤標(biāo)志物方面研究?！?/p>

，E-mail:jlx60003@163.com。

R

A

1671-8348(2016)31-4357-03

2016-02-26

2016-04-14)