張淑英，裴景亮，張玉芝，伊正君△

(1.山東省濰坊市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 261041；2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濰坊 261031)

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論著·臨床研究

洗滌方式對(duì)高通量酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)核抗體的影響

張淑英1，裴景亮2，張玉芝2，伊正君2△

(1.山東省濰坊市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 261041；2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濰坊 261031)

目的 評(píng)價(jià)不同的洗滌參數(shù)對(duì)高通量酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)酶免儀檢測(cè)結(jié)核抗體的影響，通過(guò)洗滌液的標(biāo)準(zhǔn)化研究解決ELISA實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性和重復(fù)性差的問(wèn)題。方法 儀器采用煙臺(tái)Addcare ELISA500全自動(dòng)酶免儀，試劑采用商品化的結(jié)核抗體檢測(cè)試劑，選擇不同體積洗液量，不同洗滌次數(shù)，不同振蕩時(shí)間及不同的浸泡時(shí)間，進(jìn)行結(jié)核抗體的ELISA檢測(cè)，觀察對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。采用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分別計(jì)算不同的洗滌方式的診斷效能。結(jié)果 采用300 μL洗液量，洗滌5次，振蕩30 s，浸泡40 s可以獲得最佳的診斷效能，此時(shí)靈敏度為86.67%，特異性為85.71%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為81.25%，陰性預(yù)測(cè)值為90.00%，陽(yáng)性似然比率4.33(95%CI:4.11～4.52)，陰性似然比率0.11(95%CI:0.08～0.14)，約登指數(shù)為0.72(95%CI:0.68～0.76)。結(jié)論 建立的洗滌液系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化程序可以提高檢測(cè)方法的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性。

高通量分析；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；結(jié)核抗體

結(jié)核病已成為全球備受關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，WHO的報(bào)告指出，在2012年全球大約有860萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病例，約130萬(wàn)人死于結(jié)核病[1]。WHO對(duì)全球2013年結(jié)核分枝桿菌(MTB)的感染發(fā)生率進(jìn)行了評(píng)估，我國(guó)仍然是高發(fā)病率國(guó)家。傳統(tǒng)的結(jié)核抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但它的結(jié)果受實(shí)驗(yàn)過(guò)程中多種因素的干擾，普遍存在準(zhǔn)確性和重復(fù)性差的問(wèn)題，其靈敏度、特異性也存在爭(zhēng)議[2-3]。本文研究高通量ELISA檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)核抗體試驗(yàn)過(guò)程中洗滌方式對(duì)結(jié)核抗體檢測(cè)結(jié)果的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集山東省濰坊市第二人民醫(yī)院和濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2013年5月至2014年2月結(jié)核科門診及住院的結(jié)核病例120例，均符合2001年中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)制定的肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)。168例健康成人(健康體檢人員)作為對(duì)照組，兩組之間性別、年齡、卡介苗接種史等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有病例乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)感染指標(biāo)均為陰性，亦無(wú)并發(fā)其他急性感染性疾病。

1.2 儀器與試劑 煙臺(tái)Addcare ELISA500全自動(dòng)酶免儀，試劑采用榮盛公司的結(jié)核抗體檢測(cè)試劑，批號(hào)為20130824，實(shí)驗(yàn)前對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的特異性、敏感性和cut off值的重復(fù)性進(jìn)行了驗(yàn)證。除研究因素外，其余步驟及操作要素嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書，每次檢測(cè)重復(fù)3次。

1.3 方法 清晨采集空腹肘靜脈血4 mL，3 000 r/min離心10 min分離血清，血清分裝后-80 ℃保存，備用。選擇100、200、300 μL等不同體積洗液量，4、5、6次不同洗滌次數(shù)，10、30、60 s不同清洗震蕩時(shí)間，20、30、40、50、60 s不同浸泡時(shí)間，進(jìn)行結(jié)核抗體的ELISA檢測(cè)，觀察對(duì)最終檢測(cè)結(jié)果(陰、陽(yáng)性結(jié)果)的影響，評(píng)價(jià)不同因素對(duì)靈敏度、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)、陰性預(yù)測(cè)值(NPV)、陽(yáng)性似然比率(PLR)、陰性似然比率(NLR)、約登指數(shù)(YI)等的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同體積洗液量對(duì)結(jié)核抗體檢測(cè)的影響 其余參數(shù)選擇：洗滌5次，振蕩30 s，浸泡30 s。結(jié)果顯示：洗滌液量為300 μL時(shí)方法的靈敏度、PPV、NPV、PLR、NLR、YI等檢驗(yàn)效能明顯高于其他兩組(P<0.05)，特異性在200 μL和300 μL方法中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 不同洗滌次數(shù)對(duì)結(jié)核抗體檢測(cè)的影響 其余參數(shù)選擇：洗滌液300 μL，振蕩30 s，浸泡30 s。結(jié)果顯示：洗滌次數(shù)不同時(shí)，不同方法間的靈敏度、特異性、PPV、NPV、NLR差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。洗滌5次時(shí)PLR和YI高于洗滌次數(shù)為4次的方法(P<0.05)；與洗滌次數(shù)為6次比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 不同振蕩時(shí)間對(duì)結(jié)核抗體檢測(cè)的影響 其余參數(shù)選擇：洗滌液300 μL，洗滌5次，浸泡30 s。結(jié)果顯示：振蕩30 s的方法在靈敏度、特異性、PPV、NPV、PLR、NLR、YI方面的診斷效能高于振蕩10 s的方法(P<0.05)；在靈敏度、特異性、NPV、NLR、YI方面的診斷效能與振蕩60 s的方法比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在PPV和PLR的診斷效能方面高于振蕩60 s的方法(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.4 不同浸泡時(shí)間對(duì)結(jié)核抗體檢測(cè)的影響 其余參數(shù)選擇：洗滌液300 μL，洗滌5次，振蕩時(shí)間30 s。結(jié)果顯示：浸泡40 s的方法在靈敏度、NPV、PLR、NLR、YI方面的診斷效能高于浸泡時(shí)間(P<0.05)；在特異性方面浸泡30 s和40 s差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均高于其他浸泡時(shí)間(P<0.05)；在PPV診斷效能方面浸泡60 s時(shí)診斷效能最高，浸泡40 s和50 s差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均高于其他浸泡20 s和30 s(P<0.05)，見(jiàn)表4、圖1。

圖1 不同浸泡時(shí)間對(duì)YI指數(shù)的影響

洗滌液(μL)靈敏度(%)特異性(%)PPV(%)NPV(%)PLR(95%CI)NLR(95%CI)YI(95%CI)10054.17*72.62*58.56*68.93*1.41(1.21～1.67)*0.45(0.32～0.55)*0.27(0.24～0.30)*20077.50*82.7476.23*83.73*3.21(2.99～3.47)*0.19(0.16～0.21)*0.61(0.57～0.64)*30081.6783.9378.4086.503.63(3.15～3.95)0.16(0.11～0.20)0.66(0.58～0.73)

*:P<0.05，與300 μL洗液的診斷效能比較。

表2 不同洗滌次數(shù)對(duì)檢驗(yàn)效能的影響

*：P<0.05，與洗滌效數(shù)5次的診斷效能比較。

表3 不同振蕩時(shí)間對(duì)結(jié)核抗體檢測(cè)的影響

*:P<0.05，與振蕩30 s的診斷效能比較。

表4 不同浸泡時(shí)間對(duì)結(jié)核抗體檢測(cè)的影響

*：P<0.05，與浸泡40 s的診斷效能比較。

3 討 論

目前，結(jié)核病控制面臨的挑戰(zhàn)是多方面的，包括：艾滋病與結(jié)核病的雙重感染，缺乏有效的疫苗，不斷出現(xiàn)的耐多藥結(jié)核分枝桿菌，結(jié)核病的藥物治療比目前已知的其他細(xì)菌的治療療程更長(zhǎng)、更復(fù)雜[4]，其在機(jī)體內(nèi)的代謝機(jī)制也尚未明確[5]；其中最重要的一點(diǎn)是沒(méi)有特異性的生物標(biāo)志物，無(wú)法早期特異性地診斷結(jié)核病?，F(xiàn)有的診斷方法普遍存在特異性和靈敏度不高的特點(diǎn)[6-7]，尋找一種快速、準(zhǔn)確、低廉的診斷方法對(duì)于結(jié)核病的早期診斷、早期干預(yù)及防止耐藥菌的產(chǎn)生和傳播具有重要的意義。有研究證實(shí)：結(jié)核分枝桿菌的特異性分泌蛋白的抗體檢測(cè)對(duì)結(jié)核病的診斷具有重要意義，利用基因工程技術(shù)將結(jié)核分枝桿菌的多種分泌蛋白制成融合蛋白，利用ELISA技術(shù)檢測(cè)血清中對(duì)應(yīng)的抗體可用于不同類型結(jié)核病的診斷[8]。

ELISA是臨床實(shí)驗(yàn)室最基本、最常用的實(shí)驗(yàn)方法之一，洗板是ELISA實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟，洗板的目的是清除非特異性的干擾物質(zhì)，洗板效果決定著整個(gè)實(shí)驗(yàn)的成敗，有研究表明人為改變洗板因素會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的特異性和靈敏度[9]。國(guó)內(nèi)研究顯示洗板不徹底會(huì)出現(xiàn)非特異性顯色，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性；過(guò)度洗板會(huì)使得低值陽(yáng)性標(biāo)本出現(xiàn)假陰性[10]。洗滌因素對(duì)結(jié)核抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果的影響在國(guó)內(nèi)尚無(wú)系統(tǒng)的研究和報(bào)道，為了明確這些因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，筆者對(duì)高通量ELISA檢測(cè)系統(tǒng)的洗滌液及洗滌方式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化研究以解決結(jié)核抗體ELISA試驗(yàn)中準(zhǔn)確性和重復(fù)性差的問(wèn)題。

本研究中筆者采用上海榮盛公司的結(jié)核抗體檢測(cè)試劑，試劑盒將7種特異抗原優(yōu)勢(shì)肽段分別制備成多表位融合抗原，用以檢測(cè)患者外周血的結(jié)核抗體。300 μL洗液，震蕩30 s，洗板4次，浸泡30 s為試劑盒說(shuō)明書中給出的洗板參數(shù)。筆者以此為對(duì)照，依次對(duì)洗滌液體積、洗板次數(shù)、振蕩時(shí)間、浸泡4個(gè)影響因素進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示按照說(shuō)明書規(guī)定浸泡30 s的300 μL洗液，震蕩30 s，洗板5次時(shí)診斷效能最高；在評(píng)價(jià)浸泡時(shí)間因素的影響時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)此因素較復(fù)雜，對(duì)結(jié)果的靈敏度、特異性影響較大。因此本研究中使用了更多的時(shí)間參數(shù)，并以YI作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；結(jié)果顯示浸泡40 s時(shí)，YI最高，與其他浸泡時(shí)間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。為篩選浸泡40 s時(shí)洗滌液體積、洗板次數(shù)、振蕩時(shí)間的最佳參數(shù)，筆者重新對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果分別為300 μL、5次、30 s，與浸泡30 s時(shí)參數(shù)相同(數(shù)據(jù)未展示)。

最終研究結(jié)果顯示：不同的洗滌液體積、洗板次數(shù)、振蕩時(shí)間、浸泡時(shí)間對(duì)檢驗(yàn)診斷效能都有影響，與李金龍等[11]的研究結(jié)果一致。本檢測(cè)系統(tǒng)洗板的最佳參數(shù)為洗液300 μL，震蕩時(shí)間30 s，浸泡時(shí)間40 s，洗板5次，此時(shí)靈敏度為86.67%，特異性為85.71%，PPV為81.25%，NPV為90.00%，PLR為4.33(95%CI:4.11～4.52)，NLR為0.11(95%CI:0.08～0.14)，YI為0.72(95%CI:0.68～0.76)。在所有的洗滌參數(shù)組合中，筆者建立的體系約登指數(shù)最高，與其他組合相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究結(jié)果同時(shí)顯示高通量的ELISA的自動(dòng)化檢測(cè)能夠提高檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性，特別是cut off值，與相關(guān)報(bào)道一致[12]。

標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的發(fā)展趨勢(shì)，高通量ELISA分析系統(tǒng)洗滌程序的標(biāo)準(zhǔn)化可以排除潛在的影響因素，提高實(shí)驗(yàn)的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性。基因工程技術(shù)制成的致病結(jié)核分枝桿菌的融合抗原試劑與自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化的酶免疫聯(lián)合應(yīng)用是一種簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確性高的實(shí)驗(yàn)方法[13]，可以為結(jié)核病的臨床診斷與防治提供科學(xué)的依據(jù)。

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Impact of washing mode on detecting tuberculosis antibody by high-throughput ELISA detection system*

ZhangShuying1，PeiJingliang2，ZhangYuzhi2，YiZhengjun2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratoryWeifangMunicipalSecondPeople′sHospital,Weifang,Shandong261041,China;2.DepartmentofClinicalLaboratoryAffiliatedHospitalofWeifangMedicalCollege,Weifang,Shandong261031,China)

Objective To evaluate the impact of different washing parameters on detecting tuberculosis(TB) antibody by high-throughput ELISA detection system,and to solve the poor accuracy and poor repeatability problem of ELISA through the standardization of cleaning solution.Methods The Addcare ELISA500 automatic enzyme immunoassay instrument was adopted.The reagent adopted the commercial TB antibody reagent kit.The ELISA detection was performed by selecting different volumes of washing solution,different washing time,different oscillation time and different soaking time.The impact on the detection results was observed.The software SPSS21.0 was used for conducting statistical analysis.The diagnostic efficiencies of different washing modes were respectively calculated.Results The best diagnostic efficiency was obtained by 300 μL of washing solution,washing for 5 times,oscillating for 30 s and soaking for 40 s,the sensitivity,specificity,positive predictive value,negative predictive value,positive likelihood ratio,negative likelihood ratio and Youden index were 86.67%,85.71%,81.25%,90.00%,4.33 (95%CI:4.11-4.52),0.11(95%CI:0.08-0.14) and 0.72 (95%CI:0.68-0.76) respectively.Conclusion The established standardization procedure of washing solution system can increase the sensitivity,specificity and accuracy of detection method.

high-throughput screening assays;enzyme-linked immunosorbent assay;antibodies,tuberculosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.31.015

衛(wèi)生部醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心專項(xiàng)課題(28-10-5)。

張淑英(1979-)，碩士，主管技師，主要從事結(jié)核病的臨床診斷。△

，E-mail:13505360413@163.com。

R446

A

1671-8348(2016)31-4366-03

2016-03-07

2016-06-21)