王 勇，李彥軍，，王 楠，胡云紅

（1.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西西安 710021；2.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021；3.陜西省科學(xué)院酶工程研究所，陜西臨潼 710600）

復(fù)合菌共生發(fā)酵法酶解甘薯蛋白制備生物活性肽的研究

王 勇1，李彥軍1，2，王 楠2，胡云紅3

（1.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西西安 710021；2.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021；3.陜西省科學(xué)院酶工程研究所，陜西臨潼 710600）

以甘薯蛋白為原料，采用復(fù)合菌共生發(fā)酵法制備生物活性肽。通過SephadexG-25型色譜柱對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離，并利用高效液相色譜法做進(jìn)一步的分析驗(yàn)證，測(cè)定了產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力及還原能力。結(jié)果表明，甘薯蛋白在枯草芽孢桿菌與黑曲霉比例1.5∶1.0，以10%的接種量在5%甘薯蛋白發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后，可水解為具有一定DPPH自由基清除能力以及還原能力的小分子肽類物質(zhì)。

復(fù)合菌；甘薯蛋白；生物活性肽

0 引言

甘薯（Ipomoea batatas）是旋花科甘薯屬的一個(gè)重要栽培品種，原產(chǎn)于南美洲，因具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、抗干旱、耐瘠薄、適應(yīng)性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，在我國(guó)廣泛種植[1]。甘薯塊根除含有大量的淀粉外，還有2.24%～12.21%（以干物質(zhì)計(jì)）的甘薯粗蛋白。目前，對(duì)甘薯蛋白的研究主要集中在貯藏蛋白和糖蛋白[2]。由于未變型的甘薯蛋白具有胰蛋白酶抑制活性，影響其消化吸收，如使之生成小分子量的肽，會(huì)使其生物效價(jià)更高[3]。同時(shí)，研究表明甘薯蛋白多肽具有降血壓、抗凝血、提高免疫力、抗腫瘤等功能，并對(duì)二苯基苦味肼基自由基（DPPH·）具有一定的清除能力[4]。

微生物發(fā)酵法是指利用微生物產(chǎn)生的蛋白酶來水解蛋白質(zhì)，從而制備生物活性肽的一種方法[5]，具有微生物來源廣泛、所產(chǎn)蛋白酶不用分離、生長(zhǎng)周期短、生產(chǎn)成本相對(duì)酶解法較低等優(yōu)點(diǎn)。枯草芽孢桿菌所產(chǎn)蛋白酶主要是內(nèi)切酶，能從蛋白質(zhì)內(nèi)部進(jìn)行水解切斷肽鏈，生成小分子的多肽和氨基酸；黑曲霉所產(chǎn)的酸性蛋白酶主要是端肽酶，具有很好的熱穩(wěn)定性和金屬離子穩(wěn)定性，耐酸性好[6]。從理論上講，將枯草芽孢桿菌和黑曲霉按比例混合，用混合菌種發(fā)酵甘薯蛋白粉，所產(chǎn)生的酶中既有內(nèi)肽酶又有端肽酶，可以同時(shí)在肽鏈的中間和兩端進(jìn)行切割，從而制備更多的甘薯多肽。目前，有關(guān)以黑曲霉和枯草芽孢桿菌為復(fù)合菌共生發(fā)酵酶解甘薯蛋白制備生物活性肽的研究還尚未見報(bào)道。試驗(yàn)以甘薯蛋白為底物，運(yùn)用微生物共生發(fā)酵技術(shù)制備甘薯蛋白活性肽，旨在為甘薯蛋白及活性肽開發(fā)利用提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯蛋白粉，實(shí)驗(yàn)室自制，甘薯蛋白含量85%；枯草芽孢桿菌、黑曲霉，由陜西省科學(xué)院酶工程技術(shù)研究所提供；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等試劑原料，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外分光光度計(jì)，北京瑞利有限公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀，美國(guó)Waters產(chǎn)品；LSC50L型立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；HS-100型恒溫恒濕試驗(yàn)箱，蘇州晨光儀器公司產(chǎn)品。

1.3 復(fù)合菌共生發(fā)酵酶解甘薯蛋白

將實(shí)驗(yàn)室保藏的枯草芽孢桿菌和黑曲霉分別接種到液體種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，于溫度30℃，轉(zhuǎn)速160 r/min條件下，振蕩培養(yǎng)36 h后用于發(fā)酵。菌種活化完成后，將菌種接種到甘薯蛋白發(fā)酵培養(yǎng)基中，根據(jù)枯草芽孢桿菌∶黑曲霉為2∶1 ～1∶2的比例，在接種量為8%～14%，培養(yǎng)箱溫度為30℃條件下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，并每隔一段時(shí)間觀察發(fā)酵液的形態(tài)，于發(fā)酵進(jìn)行6，12，24，48，60，72 h后，分別采用雙縮脲反應(yīng)法檢測(cè)發(fā)酵液中蛋白質(zhì)酶解的程度。

發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在100℃下滅酶10 min，然后以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min，去除沉淀菌體和未發(fā)酵的甘薯蛋白殘?jiān)∩锨逡?，并加入適量飽和硫酸銨溶液，靜置，濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾，得甘薯蛋白發(fā)酵液，待用。

1.4 葡聚糖凝膠色譜柱分離甘薯多肽

以葡聚糖凝膠G-25為分離介質(zhì)、蒸餾水為洗脫劑，于流速1.35 mL/min條件下，對(duì)甘薯蛋白發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，分段收集洗脫液，每管5 mL，依次編號(hào)為G1～Gx，并于波長(zhǎng)214，220，280 nm處進(jìn)行紫外檢測(cè)定性。

1.5 高效液相色譜法分離甘薯多肽

選擇甘薯多肽富集度較高的洗脫液，利用高效液相色譜法進(jìn)行進(jìn)一步分析鑒定。色譜條件為色譜柱C18，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，柱溫30℃，上樣量20 μL，流速1.0 mL/min，并按照表1中的條件梯度洗脫50 min（流動(dòng)相A：0.1%三氟乙酸+100%乙腈；流動(dòng)相B：0.1%三氟乙酸+100%去離子水）。

高效液相色譜法梯度洗脫條件見表1。

表1 高效液相色譜法梯度洗脫條件

1.6 甘薯多肽DPPH自由基清除能力及還原能力的測(cè)定

1.6.1 DPPH自由基的清除能力測(cè)定

參照Orhan I等人[7]的方法測(cè)定甘薯多肽清除DPPH自由基能力。

取試樣2 mL與0.2 mmol/L的DPPH自由基無水乙醇溶液2 mL混合均勻，置于黑暗處反應(yīng)30 min后取出，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定紫外吸光度；以2 mL蒸餾水與2 mL DPPH自由基無水乙醇溶液的混合物作為空白對(duì)照，用無水乙醇調(diào)零。甘薯多肽對(duì)DPPH自由基的清除率通過以下公式計(jì)算：

式中：X——甘薯多肽對(duì)DPPH自由基的清除率；

A0——2 mL蒸餾水與2 mL DPPH自由基無水乙醇溶液混合后的吸光度；

A1——2 mL甘薯多肽溶液與2 mL DPPH自由無水乙醇溶液反應(yīng)后的吸光度。

1.6.2 還原能力的測(cè)定

參照Kaur R等人[8]的方法測(cè)定甘薯多肽還原能力。

將2 mL試樣與5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH值6.6）混合均勻，然后加入5 mL的1%鐵氰化鉀溶液，混合物在50℃條件下保溫20 min；再加入5 mL的10%TCA溶液，混和均勻，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min；取2 mL上清液和1 mL蒸餾水混合，再加入0.5 mL的0.1%FeCl3溶液，最后于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)量吸光度。吸光度越高，說明試樣的還原能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1.1 不同枯草芽孢桿菌和黑曲霉接種比例對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

分別將枯草芽孢桿菌和黑曲霉按照2.0∶1.0，1.5∶1.0，1.0∶1.0，1.0∶1.5，1.0∶2.0的比例，以10%的接種量接種在5%甘薯蛋白發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃條件下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，48 h后采用雙縮脲反應(yīng)法對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，繪制發(fā)酵液吸光度與復(fù)合菌接種比例的關(guān)系曲線。

不同枯草芽孢桿菌和黑曲霉接種比例對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響見圖1。

圖1 不同枯草芽孢桿菌和黑曲霉接種比例對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

雙縮脲反應(yīng)是肽和蛋白質(zhì)所特有而氨基酸沒有的一個(gè)顏色反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有許多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，能與試劑中的銅離子在堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，且顏色深淺與蛋白質(zhì)含量的關(guān)系在一定范圍內(nèi)符合比爾定律，而與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及分子量無關(guān)，因此可用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。即甘薯蛋白被酶解的越充分，紫外吸光度就越低。由圖1可知，當(dāng)枯草芽孢桿菌和黑曲霉的混合比例為1.5∶1.0時(shí)，發(fā)酵效果最佳。

2.1.2 不同接種量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

在枯草芽孢桿菌和黑曲霉復(fù)合菌的混合比例為1.5∶1.0時(shí)，分別選用8%，9%，10%，11%，12%，13%，14%的接種量將復(fù)合菌接種在5%甘薯蛋白發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱溫度為30℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后采用雙縮脲反應(yīng)法對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

不同復(fù)合菌接種量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響見圖2。

初稿完成后，對(duì)照腳本用相關(guān)儀器再實(shí)際操作幾次，記下每一步之后會(huì)出現(xiàn)什么樣的界面和提示，再修改腳本，然后定稿。

圖2 不同復(fù)合菌接種量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

發(fā)酵開始前，甘薯蛋白培養(yǎng)基中溶解了大量的蛋白質(zhì)，表現(xiàn)出較高的紫外吸光度；隨著發(fā)酵進(jìn)行，大分子的蛋白質(zhì)被分解成了小分子的多肽及氨基酸，紫外吸光度下降。當(dāng)復(fù)合菌接種量較少時(shí)，由于菌種濃度過低，致使甘薯蛋白粉發(fā)酵不完全，上清液中存在比較多的大分子蛋白質(zhì)，從而在540 nm處表現(xiàn)出較高的紫外吸光度；隨著復(fù)合菌接種量的增加，甘薯蛋白被酶解的越多。由圖2可知，當(dāng)復(fù)合菌接種量增大到10%時(shí)，甘薯蛋白被酶解的最多；此后隨著接種量的增大，紫外吸光度的變化并不顯著。因此，復(fù)合菌的最佳接種量為10%。

2.1.3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

在枯草芽孢桿菌和黑曲霉的混合比例為1.5∶1.0，接種量為10%的條件下，于30℃進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響。

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響見圖3。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵上清液的紫外吸光度逐漸減小。其原因?yàn)楦适矶嚯牡臐舛扰c發(fā)酵液中蛋白酶的活性有直接關(guān)系，發(fā)酵液中蛋白酶的活性又隨著微生物代謝的加快而逐漸增加，48 h之后隨著微生物的逐漸衰亡產(chǎn)酶量又逐漸降低。當(dāng)復(fù)合菌發(fā)酵48 h左右時(shí)，甘薯蛋白的酶解程度最高，之后甘薯蛋白發(fā)酵產(chǎn)物的紫外吸光度基本不變，這說明隨著發(fā)酵的進(jìn)行，甘薯蛋白的酶解程度先高后低，至48 h左右基本不變。因此，選擇48 h作為發(fā)酵的最佳時(shí)間。

2.2 葡聚糖凝膠色譜柱分離甘薯多肽

在上述最優(yōu)條件下復(fù)合菌共生發(fā)酵法酶解甘薯蛋白，發(fā)酵結(jié)束后按1.3的方法滅酶，經(jīng)離心、除雜后取上清液，飽和硫酸銨溶液鹽析靜置，濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾，得甘薯蛋白發(fā)酵液。

取樣品2.5 mL在1.4中的試驗(yàn)條件下進(jìn)行分離，分段收集洗脫液，并分別于波長(zhǎng)214，220，280 nm處進(jìn)行紫外檢測(cè)，繪制洗脫曲線。

葡聚糖凝膠色譜柱分離濾過液洗脫曲線見圖4。

圖4 葡聚糖凝膠色譜柱分離濾過液洗脫曲線

據(jù)蛋白質(zhì)與肽類物質(zhì)的紫外吸收特性分析，蛋白質(zhì)的紫外特征吸收峰為280 nm，多肽的紫外特征吸收峰多為214，220 nm。試驗(yàn)選擇上述3個(gè)特征波段為檢測(cè)點(diǎn)，繪制甘薯蛋白水解液洗脫曲線，綜合分析蛋白的水解情況以及多肽溶液在葡聚糖凝膠色譜柱中的洗脫情況。由圖4可知，洗脫液在280 nm處吸光度隨著洗脫液的流出（管號(hào)的增加）變化不大且吸光度較小，這說明洗脫液中不含甘薯蛋白或甘薯蛋白較少，表明甘薯蛋白已基本被水解；隨著洗脫液的流出，從第5管開始，洗脫液在214 nm及220 nm處的紫外吸光度開始明顯增加，并于第8、第9管達(dá)到峰值，表明甘薯蛋白已在復(fù)合菌的作用下水解為肽類物質(zhì)，此后隨著管號(hào)的增加吸光度逐漸減少。結(jié)合葡聚糖凝膠色譜柱的分離原理可知，隨著洗脫液的流出，未水解的殘余蛋白及分子量大的多肽首先流出，緊接著是分子量相對(duì)較小的短肽、二肽以及氨基酸等小分子物質(zhì)。

2.3 高效液相色譜法分離甘薯多肽結(jié)果分析

將2.2中的5～15管洗脫液收集編號(hào)，標(biāo)記為G5～G10，并進(jìn)行紫外掃描及薄層色譜分析后，選擇甘薯多肽富集度較高的G8，G9以及制備的5.52 mg/mL絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，5.58 mg/mL甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品按照1.5中所述的方法進(jìn)行高效液相色譜分析。

絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品液相見圖5，甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品液相見圖6，G8洗脫液液相見圖7，G9洗脫液液相見圖8。

圖5 絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品液相

圖6 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品液相

圖7 G8洗脫液液相

由圖7和圖8可知，G8，G9的高效液相色譜圖相似度較高，但有一定的區(qū)別，峰形較雜亂，分離度不高，可能原因?yàn)樗苽涞臉悠方M分復(fù)雜，且分子量相近，這也從側(cè)面反映了微生物發(fā)酵的不確定性；另一方面也可能為在試驗(yàn)條件下采用Sephadex G-25型色譜柱以及高效液相色譜法對(duì)試驗(yàn)所制備的肽類物質(zhì)分離效果不佳，今后可從此處入手做進(jìn)一步優(yōu)化。據(jù)報(bào)道，生物活性肽的分子量范圍一般為50～1 000 Da，結(jié)合圖5和圖6絲氨酸以及甘氨酸的液相色譜圖，可以推斷G8，G9分子量較小及其分布較廣，分子量在100～1 000 Da范圍內(nèi)，這與活性肽的分子量范圍一致。經(jīng)綜合分析可知，在甘薯蛋白的微生物發(fā)酵液中存在小分子肽類物質(zhì)，且分子量較小、范圍廣。

圖8 G9洗脫液液相

2.4 甘薯多肽DPPH自由基清除能力、還原能力的測(cè)定結(jié)果

2.4.1 甘薯多肽對(duì)DPPH自由基的清除能力結(jié)果分析

根據(jù)2.2的試驗(yàn)結(jié)果，選取G5～G12號(hào)洗脫液，參照1.6中的方法測(cè)試洗脫液對(duì)DPPH自由基的清除能力。

甘薯多肽對(duì)DPPH自由基的清除能力見圖9。

圖9 甘薯多肽對(duì)DPPH自由基的清除能力

由圖9可知，從G5開始，隨著洗脫液的流出，甘薯蛋白水解物對(duì)DPPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，其中在G9時(shí)出現(xiàn)了極大值，DPPH自由基的清除能力達(dá)到了68.19%；此后隨著洗脫液的流出，DPPH自由基的清除能力逐漸減弱。這說明甘薯蛋白水解物具有一定的DPPH自由基清除能力，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了甘薯蛋白已在復(fù)合菌的作用下水解為活性較高的小分子肽結(jié)論，且高活性肽主要集中于G8和G9中。

2.4.2 甘薯多肽還原能力的測(cè)定結(jié)果

將2.2中的5～12號(hào)洗脫液參照1.6中的方法進(jìn)行還原能力的測(cè)定。

甘薯多肽的還原能力測(cè)定見圖10。

圖10 甘薯多肽的還原能力測(cè)定

由圖10可知，隨著洗脫液管號(hào)的增大，甘薯蛋白水解物的還原能力先增強(qiáng)后減弱。G9具有最強(qiáng)的還原能力，這與甘薯活性肽具有較強(qiáng)還原能力的特征一致。結(jié)合2.1，2.2，2.3試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步說明甘薯蛋白已在復(fù)合菌的作用下生成了肽類物質(zhì)，且產(chǎn)物的還原能力較好。

3 結(jié)論

以甘薯蛋白為原料，采用復(fù)合菌共生發(fā)酵法制備甘薯活性肽?？莶菅挎邨U菌和黑曲霉在甘薯蛋白發(fā)酵培養(yǎng)基中可以較好地生長(zhǎng)，產(chǎn)生的蛋白酶對(duì)甘薯蛋白進(jìn)行酶解，得到了小分子多肽和氨基酸。通過單因素試驗(yàn)，得出復(fù)合菌共生發(fā)酵的最佳條件為枯草芽孢桿菌和黑曲霉按照1.5∶1.0的比例以10%的接種量接種在5%甘薯蛋白發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵48 h可使甘薯蛋白得到充分酶解。利用葡聚糖凝膠色譜柱的同時(shí)依據(jù)分子篩原理分離甘薯蛋白發(fā)酵液，并通過高效液相色譜法進(jìn)行進(jìn)一步分析檢測(cè)，水解液基本得到了分離，收集了富集度較高的甘薯活性肽樣品，但分離效果不佳，有待進(jìn)一步研究改進(jìn)。經(jīng)檢測(cè)，樣品對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力以及還原能力。

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The Study for Complex Symbiotic Fermentation of Sweet Potato Protein to Prepare Bioactive Peptides

WANG Yong1，LI Yanjun1，2，WANG Nan2，HU Yunhong3
（1.Shaanxi Institute of Agricultural Products Processing Technology，Xi'an，Shaanxi 710021，China；2.College of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi'an，Shaanxi 710021，China；3.Institute of Enzyme Engineering，Shaannxi Academy of Sciences，Lintong，Shaanxi 710600，China）

Using sweet potato protein as raw material，the biological activity peptide is prepared by the method of compound bacteria symbiotic fermentation.The fermentation products are separated by SephadexG-25 column，and further analysis is made by using high performance liquid chromatography，the free radical scavenging ability and reducing ability of DPPH·are determined.The results show that Bacillus subtilis and Aspergillus niger，according to the proportion of 1.5∶1.0，with 10% of the inoculum amount，in the fermentation medium of 5%sweet potato protein，after 48 h fermentation，sweet potato protein can be hydrolyzed to small molecular peptides with DPPH·radical scavenging ability and reducing power.

complex bacteria；sweet potato proteins；bioactive peptides

TS239

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.11.031

1671-9646（2016）11b-0008-05

2016-09-21

西安市科技計(jì)劃項(xiàng)目（NC1207(2)）；西安市未央?yún)^(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（201307）。

王 勇（1977—），男，博士，工程師，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)。