彭 捷 ，崔翠菊 ，張立楠 ，曲艷艷 ，李曉捷，姜 煒，劉延嶺 ，李 言，田萍萍

( 1.山東東方海洋科技股份有限公司 國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心， 山東 煙臺 264003；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109； 3.煙臺市海洋環(huán)境監(jiān)測預(yù)報中心，山東 煙臺 264003 )

高溫脅迫對高溫篩選后海帶配子體存活率和生理的影響

彭 捷1，崔翠菊1，張立楠2，曲艷艷1，李曉捷1，姜 煒3，劉延嶺1，李 言1，田萍萍1

( 1.山東東方海洋科技股份有限公司 國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心， 山東 煙臺 264003；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109； 3.煙臺市海洋環(huán)境監(jiān)測預(yù)報中心，山東 煙臺 264003 )

試驗以經(jīng)過高溫篩選存活的海帶配子體奔牛(Bn-23-b-2 d，Bn-23-b-8 d)和對照組配子體奔牛(Bn)為試驗材料，在23 ℃分別處理4、8 d和12 d，進(jìn)行了耐高溫能力的驗證。試驗結(jié)果表明，3種材料的存活率隨處理時間的延長均呈下降趨勢，且3種材料的耐高溫能力與之前的試驗結(jié)果一致，依次為Bn-23-b-8 d> Bn-23-b-2 d>對照組Bn。同時，在高溫處理的不同時間點(4、8、12、16 d)，對3種配子體的葉綠素a、脯氨酸、丙二醛及可溶性糖含量進(jìn)行了檢測，其中，對照組配子體葉綠素a含量隨處理時間延長一直下降，而Bn-23-b-2 d與Bn-23-b-8 d有一定上升后下降；脯氨酸含量在高溫脅迫下迅速積累，其中Bn-23-b-8d前期抵抗高溫能力最強(qiáng)，抗高溫時間最長；對照組Bn丙二醛和可溶性糖含量變化最明顯，受到的高溫脅迫強(qiáng)度最大。這4種生理指標(biāo)的變化可以反映配子體的耐高溫能力，與存活率驗證得到的結(jié)果相符。該研究結(jié)果顯示，高溫篩選后其存活率和生理指標(biāo)的變化能夠反映其耐高溫能力，為后期耐高溫品種的選育奠定了基礎(chǔ)。

高溫脅迫；高溫篩選；海帶配子體；存活率；生理

自20世紀(jì)50年代夏季育苗法的創(chuàng)立以來，由于海帶(Saccharinajaponica)具有極高的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價值，海帶養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展并一躍成為中國最大的海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，栽培區(qū)域主要分布在北方的遼寧、山東以及南方的江蘇、浙江和福建。海帶人工育苗是發(fā)展我國海帶養(yǎng)殖事業(yè)的一個重要環(huán)節(jié)，目前隨著海洋污染和溫室效應(yīng)的影響，海帶育種中存在的突出問題是海帶耐高溫能力弱，在人工培育海帶幼苗過程中經(jīng)常出現(xiàn)爛苗、掉苗以及畸形等現(xiàn)象[1-4]。因此，通過研究海帶耐高溫的生理機(jī)制來提高海帶的耐高溫能力，培育和篩選耐高溫的海帶新品種，對于發(fā)展我國海帶養(yǎng)殖事業(yè)具有重要意義。海帶的生活史屬于典型的異型世代交替，由二倍體孢子體世代和單倍體配子體世代組成。海帶配子體具有遺傳性一致、發(fā)育全能性和可長期保存的特點，在一定條件下可形成無性繁殖系，在此基礎(chǔ)上研究者成功實現(xiàn)了利用海帶單克隆無性繁殖系育苗的新方法[5-8]。將進(jìn)行營養(yǎng)生長的雌、雄混合的克隆適度切碎后，將其按一定比例混合均勻后噴灑在附苗器上，經(jīng)過附著、培養(yǎng)后獲得海帶幼苗，期間定期鏡檢、換水。此育苗方法前期克隆在實驗室集約培養(yǎng)，附苗時間不受限制，避免了孢子體采苗的混合繁殖過程，能夠長期保持品種的優(yōu)良性狀。此外，它減少了傳統(tǒng)育苗生產(chǎn)需海上栽培和選擇種海帶環(huán)節(jié)，相應(yīng)地縮短了育苗時間，同時節(jié)省了育苗成本，其最大優(yōu)勢是為海帶雜種優(yōu)勢利用奠定了基礎(chǔ)[6,8-10]。近幾年通過配子體克隆雜交得到的常規(guī)品種(如901)和雜交品種(如東方2號和東方3號)均高產(chǎn)且耐高溫能力得到加強(qiáng)，但耐高溫品種的選育存在一定的盲目性。因此，耐高溫海帶配子體的篩選與應(yīng)用對于開發(fā)耐高溫的雜交海帶亟不可待[11-13]。Zhang等[14]比較了在不同溫度下處理不同天數(shù)的海帶游孢子與幼配子體生長狀況，指出初始培養(yǎng)階段的高溫處理及處理時間長短明顯影響了海帶游孢子與幼配子體的生長發(fā)育，游孢子比幼配子體對高溫更敏感。宣慧等[15]研究了不同溫度處理下海帶配子體的生長狀態(tài)及生理指標(biāo)的變化趨勢，指出海帶配子體最適宜的生長溫度是20 ℃以下，高于20 ℃海帶配子體已經(jīng)處于脅迫狀態(tài)，25 ℃時已經(jīng)不能耐受。王悠等[16]對海帶在高溫脅迫下響應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了初步研究，指出高溫使海帶的生長受到抑制,對褐藻酸降解菌的抗性降低，并推測高溫對細(xì)胞膜的傷害作用是引起海帶生長抑制、抗性降低并造成病爛的原因。除此以外，有關(guān)高溫對海帶配子體生長變化研究很少。本研究將實驗室Zhang等[14]篩選得到的海帶耐高溫配子體(Bn-23-b-2 d，Bn-23-b-8 d)進(jìn)行耐高溫能力驗證，對3種材料高溫脅迫不同時間點葉綠素a、脯氨酸、丙二醛及可溶性糖含量進(jìn)行了檢測，揭示耐高溫海帶配子體隨處理時間延長生理指標(biāo)的變化，為研究其高溫機(jī)制提供理論依據(jù)。同時，通過比較高溫處理后配子體存活率的變化來檢驗其耐高溫能力，為后期耐高溫品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為本實驗室經(jīng)過高溫篩選的海帶奔牛雄配子體Bn-23-b-2 d♂(游孢子階段高溫處理2 d的材料)、Bn-23-b-8 d♂(游孢子階段高溫處理8 d的材料)、正常條件生長的Bn配子體♂作為對照組。培養(yǎng)條件為：溫度10 ℃；光照度1500 lx；光時24 h/d。每星期更換一次培養(yǎng)液。

1.2 配子體存活率的測定

將3種材料進(jìn)行打碎處理，方法是使用超聲破碎儀將海帶配子體400 W處理30 s后再用200 W處理60 s，160倍顯微鏡下觀察視野中約15個細(xì)胞段(2～5個細(xì)胞)，量筒量取30 mL含有上述細(xì)胞段的培養(yǎng)液倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿。每種材料選取3個克隆系，打碎后放入10 ℃正常條件下過渡培養(yǎng) 3 d，再放入23 ℃中分別處理4、8、12 d，對照皿(0 d處理)一直放在10 ℃正常環(huán)境中培養(yǎng)。每個培養(yǎng)皿上分別選取3處做標(biāo)記。高溫處理之前對顯微鏡下這3個固定視野進(jìn)行計數(shù)，取其平均值記為An；高溫處理之后對該固定視野計數(shù)，取其平均值記為Cn，存活率(%)=Cn/An。最終分別統(tǒng)計3種材料成活率。

1.3 生理指標(biāo)的測定

對3種材料進(jìn)行23 ℃處理，分別在處理4、8、12、16 d時測定各項生理指標(biāo)，每個處理組合設(shè)置3個平行試驗。葉綠素a的含量采用乙醇法測定[17]；脯氨酸的含量采用酸性茚三酮比色法測定[17]；丙二醛的含量采用硫代巴比妥酸比色法測定[17]；可溶性糖的含量采用蒽酮—硫酸比色法測定[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 存活率的比較

通過在高溫處理下存活率的變化來反映3種配子體耐高溫的能力。隨著處理時間的延長，3種海帶配子體存活率均依次下降(圖1)。處理4 d時，下降極其明顯，存活率約40%，由于打碎處理對配子體傷害較大，需要自身調(diào)節(jié)適應(yīng)；4 d后雖然均繼續(xù)呈下降趨勢，但3種材料的下降幅度有所區(qū)別，其中Bn-23-b-8 d下降較慢，對照組Bn下降明顯；處理8 d時，三者存活率為Bn-23-b-8 d>Bn-23-b-2 d>對照組Bn，可見，耐高溫能力依次為Bn-23-b-8 d>Bn-23-b-2 d>對照組Bn。數(shù)據(jù)分析得到Bn-23-b-8 d與對照組差異顯著，說明游孢子階段高溫處理8 d的材料耐高溫能力最強(qiáng)；處理12 d時，Bn-23-b-2 d與對照組存活率相當(dāng)，均不足20%，而Bn-23-b-8 d與對照組依然差異顯著，可見Bn-23-b-8 d耐高溫能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Bn-23-b-2 d，原因是Bn-23-b-2 d早期處理時間較短，對高溫適應(yīng)能力不強(qiáng)，抵抗高溫能力較弱。

圖1 3種配子體在23 ℃條件下存活率的變化

2.2 高溫脅迫下葉綠素a含量的變化

3種配子體的葉綠素a初始值不同(圖2)，分析是克隆本身原因所致。處理4 d時，對照組Bn和Bn-23-b-2 d葉綠素a含量基本不變，Bn-23-b-8 d稍有提高，原因是3種配子體均處在對高溫處理的適應(yīng)期。4 d后，3種材料葉綠素a含量出現(xiàn)不同變化。對照組Bn含量明顯下降，且一直呈下降趨勢。表明其對高溫沒有抵抗能力，葉綠素a逐漸分解。Bn-23-b-8 d含量逐漸上升，12 d時測量達(dá)到峰值，之后有所下降。Bn-23-b-2 d含量也逐漸上升，但在高溫處理8 d時達(dá)到最高值，之后隨著處理天數(shù)的增加呈下降趨勢。與8 d 材料相比，2 d材料耐高溫能力較弱，因此葉綠素a含量達(dá)到的峰值時間早于8 d材料，之后便呈下降趨勢。結(jié)果表明,3種供試材料對高溫的抵抗能力為Bn-23-b-8 d>Bn-23-b-2 d>對照組Bn。

2.3 高溫脅迫下脯氨酸含量的變化

3種配子體的脯氨酸含量初始值不同(圖3)，分析原因是克隆本身所致。隨著處理時間的延長，3種材料的脯氨酸含量都有所上升，脯氨酸在高溫脅迫下迅速積累，以維持體內(nèi)滲透平衡，加強(qiáng)自我保護(hù)。在處理8 d時Bn-23-b-2 d與對照組Bn都達(dá)到峰值，且有所差異。12 d時，Bn-23-b-8 d達(dá)到最大值，明顯高于其他兩種材料，差異很顯著。結(jié)果與之前研究吻合，前人研究得到許多耐熱的植物品種比不耐熱品種在高溫脅迫時脯氨酸積累多[19-20]。12 d后，3種材料的脯氨酸含量都有所下降 ，表明隨著處理時間延長，高溫對配子體的傷害太大，超出脯氨酸的抵抗能力，蛋白質(zhì)合成受阻。由圖3脯氨酸的變化趨勢得到， Bn-23-b-8 d的耐高溫能力相對較高，雖然后期細(xì)胞受高溫脅迫有所影響，但前期抵抗高溫能力最強(qiáng)，抗高溫時間最長。Bn-23-b-2 d稍強(qiáng)于對照組Bn，差異并不明顯，分析是Bn-23-b-2 d在游孢子階段只高溫處理2 d，與對照組Bn耐高溫能力沒有明顯差異。

圖2 3種配子體在23 ℃條件下葉綠素a含量的變化

圖3 3種配子體在23 ℃條件下脯氨酸含量的變化

2.4 高溫脅迫下丙二醛含量的變化

植物可通過丙二醛含量的多少反映細(xì)胞膜被破壞的程度，丙二醛是細(xì)胞膜脂過氧化的重要產(chǎn)物。高溫脅迫會對細(xì)胞造成氧化傷害并產(chǎn)生大量的氧自由基，從而產(chǎn)生丙二醛[21]。3種配子體的丙二醛含量初始值不同(圖4)，分析是材料本身原因所致。處理初始階段，Bn-23-b-8 d與Bn-23-b-2 d變化不明顯，可能是植物保護(hù)酶產(chǎn)生一種防御反應(yīng)，它對體內(nèi)的活性氧和自由基有一定的清除能力，而對照組Bn的植物保護(hù)系統(tǒng)較弱，因此丙二醛含量快速上升。隨著時間延長，細(xì)胞膜受到一定程度破壞，丙二醛含量也越來越高，由圖4可以看出，丙二醛含量上升趨勢是對照組Bn>Bn-23-b-2 d>Bn-23-b-8 d。Bn-23-b-8 d到處理12 d時達(dá)到峰值后又下降，可能已經(jīng)對高溫脅迫產(chǎn)生了一定的適應(yīng)性，這與王仕林等對油菜幼苗的研究結(jié)論相似[22]。到16 d時，對照組Bn與Bn-23-b-2 d含量均達(dá)最大值，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于初始值，說明高溫對膜脂造成了不可逆的嚴(yán)重傷害。此結(jié)果表明Bn-23-b-8 d的抗高溫能力強(qiáng)于Bn-23-b-2 d與對照組Bn。

圖4 3種配子體在23 ℃條件下丙二醛含量的變化

2.5 高溫脅迫下可溶性糖含量的變化

植物為了響應(yīng)外界脅迫，會主動積累一些可溶性糖，以適應(yīng)周圍環(huán)境的變化。3種配子體的可溶性糖含量初始值不同(圖5)，分析是材料本身原因所致。高溫處理前期，Bn-23-b-8 d與Bn-23-b-2 d可溶性糖含量略微下降或保持不變，而對照組Bn在處理4 d時達(dá)到峰值，表明對照組Bn受溫度影響較大。隨著脅迫時間增加，Bn-23-b-8 d與Bn-23-b-2 d含量逐漸上升，12 d達(dá)到最大值后下降，而對照組Bn含量保持下降趨勢。從整體變化趨勢可看出，隨著高溫處理時間的延長，游孢子階段經(jīng)過高溫處理的海帶配子體材料較對照組材料變化更穩(wěn)定，表明其對高溫脅迫的響應(yīng)可能更小。

圖5 3種配子體在23 ℃條件下可溶性糖含量的變化

3 討 論

溫度是影響海帶生長及生理生化特性的重要因素之一。從以上對存活率的驗證試驗和四項與逆境相關(guān)指標(biāo)的檢測結(jié)果看出，游孢子階段高溫處理不同時間的海帶配子體對高溫的抵抗能力是有差異的，在一定范圍內(nèi)，游孢子階段處理時間較長的配子體耐高溫能力較強(qiáng)，因此，試驗中3種材料的耐高溫能力依次為Bn-23-b-8 d> Bn-23-b-2 d>對照組Bn。

3.1 高溫脅迫對耐高溫海帶配子體存活率的影響

對于存活率的檢測，并無相關(guān)報道，存活率的檢測對于耐高溫海帶配子體的耐高溫能力的評估最直觀了當(dāng)，簡單易行。經(jīng)多次試驗發(fā)現(xiàn)，在高溫處理后海帶配子體存活率的變化在不同品種的配子體材料中會有所區(qū)別，同時與脅迫時間也有一定關(guān)系；試驗中要特別注意外界雜菌的污染，操作中要盡量避免雜菌侵入，其對存活率有很大的影響，要定期換水、鏡檢，保證結(jié)果的可靠性。

3.2 高溫脅迫對耐高溫海帶配子體生理指標(biāo)的影響

高溫脅迫影響了海帶葉綠素的含量，脅迫初期，3種配子體的葉綠素含量都基本不變或有所上升，說明藻體受高溫脅迫時會產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，高溫誘導(dǎo)藻體維持正常的細(xì)胞滲透濃度和功能蛋白的數(shù)量，使細(xì)胞處于正常代謝狀態(tài)，從而起到自我保護(hù)的作用[23]。之后葉綠素含量逐漸下降，可能是藻體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，一方面降低了葉綠素的合成速率，另一方面引起了活性氧的積累從而加速了葉綠素的降解，因此導(dǎo)致葉綠素含量下降[24]。脯氨酸以游離狀態(tài)廣泛地存在于植物體中，它是植物蛋白質(zhì)的組分之一，多項研究表明在脅迫條件下植物通過積累脯氨酸可以提高抗脅迫能力[25]。本試驗檢測的脯氨酸含量在3種材料中前期均有所上升，Bn-23-b-8 d材料抗高溫能力較強(qiáng)，抗高溫時間最長，而12 d后三者都逐漸下降，沒有明顯區(qū)別，可能是脯氨酸與植物抗逆性的關(guān)系并不簡單, 因為在逆境脅迫下, 植物存在各種抗逆途徑, 不同植物不同條件下可能會通過不同途徑抵抗外界不良環(huán)境[25]。高溫條件會增加植物體內(nèi)的丙二醛含量，試驗中高溫脅迫時間的延長，使得供試材料的丙二醛含量有所上升，檢測時間結(jié)束時不同材料結(jié)果有所區(qū)別，可看出其對高溫適應(yīng)的能力差異。可溶性糖在一定程度上可以反映植物所受逆境脅迫的程度，同時作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它在高溫脅迫的初期會積累以保持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，隨著脅迫時間的延長，植物通過糖的分解為基本的代謝提供能量，使得生物體維持正常生存。可溶性糖含量逐漸減少，說明其不僅受外界環(huán)境的影響，同時也參與了植物本身的生長代謝[26]。

3.3 海帶配子體的材料選擇及研究方法改進(jìn)

在脅迫時間點方面, 本試驗還存在一定的局限性, 未來的研究可以將處理時間延長后繼續(xù)檢測各指標(biāo)含量的變化規(guī)律，也可以測定更短的時間間隔內(nèi)的變化特征。本試驗所采用的奔牛雄配子體，據(jù)文獻(xiàn)報道，海帶雄配子體在高溫環(huán)境下存活的能力明顯強(qiáng)于雌配子體[27]。Zhang[14]等研究中也有此發(fā)現(xiàn)[14]。本研究所采用的是奔牛的雄配子體，不同品種、不同性別的海帶配子體對溫度的響應(yīng)可能會有所區(qū)別，不同生理指標(biāo)的變化也會有所差異，因此在對海帶配子體的高溫脅迫研究上應(yīng)區(qū)別對待，要針對配子體材料的不同特點開展選育工作，以期得到更適宜的耐高溫品種。

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EffectsofHighTemperatureStressonSurvivalandPhysiologyofKelpLaminariajaponicaGametophytesScreenedbyHighTemperature

PENG Jie1, CUI Cuiju1, ZHANG Linan2,QU Yanyan1,LI Xiaojie1,JIANG Wei3,LIU Yanling1, LI Yan1, TIAN Pingping1

( 1. National Algae and Sea Cucumber Engineering and Technique Research Center, Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd, Yantai 264003, China; 2. Marine Science and Engineering College, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 3. Monitoring and Forecasting Center of Ocean Environment of Yantai, Yantai 264003, China )

In this experiment, the gametophytes (Bn-23-b-2 d, Bn-23-b-8 d) screened by high temperature stress and Bn in control groups were used to verify the resistant ability to high temperature under 23 ℃ for 4d, 8d and 12 d. The results showed that the gametophytes of Bn-23-b-2 d, Bn-23-b-8 d, and Bn had decrease in the survival rate with the elapse, with the order as Bn-23-b-8d> Bn-23-b-2 d>Bn. Meanwhile, the physiological indicators including the contents of chlorophyll-a, proline(Pro), malondialdehyde (MDA) and soluble sugar were determined in the gametophytes of Bn-23-b-2 d, Bn-23-b-8 d, and Bn exposed to 23 ℃ for 4 d, 8 d, 12 d and 16 d, respectively. It was found that the chlorophyll-acontent was declined in the Bn with the extension of time, but increased initially and then dropped down in Bn-23-b-2 d and Bn-23-b-8 d. The Bn-23-b-2 d and Bn-23-b-8 d had rapidly accumulated Pro content under high temperature, the maximal resistance capability to high temperature in the Bn-23-b-8 d. The most obvious changes in MDA and soluble sugar contents were observed in the control group Bn. The high temperature tolerance capability of gametophyte was reflected in variations in physiological indicators, which was consistent with the survival. The findings reflect the high temperature resistant ability of the kelp gametophytes screened by high temperature, and provide the foundation with breeding of high temperature resistant varieties.

high temperature stress; high temperature screening;Laminariajaponicagametophyte; survival rate; physiology

S968.421

A

1003-1111(2016)01-0032-05

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.01.006

2015-04-29；

2015-07-20.

國家科技支撐計劃項目(2012BAD55G01)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(“863”計劃)項目(2012AA10A406);煙臺市科技發(fā)展計劃項目(2013LGS002).

彭捷(1982-)，女，工程師，碩士;研究方向：海藻遺傳育種.E-mail：pengjie333@163.com.