劉永英， 權(quán)玉萍， 李 琳， 趙建成

(1. 焦作高等師范?？茖W(xué)校 生物系，河南 焦作 454001；2. 河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024)

?

蘚類植物掃描電鏡觀察材料的制備

劉永英1, 2， 權(quán)玉萍1， 李 琳2， 趙建成2

(1. 焦作高等師范?？茖W(xué)校 生物系，河南 焦作 454001；2. 河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024)

分揀、清洗并剝離厚肋流蘇蘚(Crossidiumcrassinerve)葉片數(shù)十片，放入2.5%戊二醛溶液中固定3 h，經(jīng)磷酸緩沖液漂洗后，使用梯度濃度酒精逐級脫水(50%、70%、80%、90%各5 min，100%共3次，分別為5、10和20 min)，隨后依次移入乙醇和乙酸異戊酯(1∶1)混合溶液以及乙酸異戊酯中分別置換15和20 min(或過夜)，經(jīng)臨界點(diǎn)干燥2 h后將葉片(腹面朝上)貼到金屬臺上噴金鍍膜，最后用掃描電子顯微鏡觀察、拍照。對照實(shí)驗(yàn)是葉片經(jīng)自然風(fēng)干后直接裝臺觀察。經(jīng)該實(shí)驗(yàn)臨界點(diǎn)干燥法處理的蘚類材料細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)飽滿、表面光滑，絲體末端細(xì)胞的疣形態(tài)和數(shù)目清晰可辨，觀察效果理想。未經(jīng)臨界點(diǎn)干燥處理的樣品絲體細(xì)胞和疣極度皺縮、塌陷，無法辨別細(xì)胞界限，疣的形態(tài)和數(shù)目更是無從知曉。該方法適用于蘚類各器官的掃描電鏡觀察材料制備。

臨界點(diǎn)干燥； 蘚類； 掃描電鏡

0 引 言

蘚類植物微形態(tài)學(xué)特征常常是分類的重要依據(jù)，如蒴齒表面疣的有無、疣的分布形式、疣的形態(tài)，孢子表面紋飾，葉細(xì)胞表面疣的有無、疣的數(shù)目、疣的形態(tài)，芽胞結(jié)構(gòu)，假根上疣的有無以及葉中肋上絲體或櫛片等特殊附屬結(jié)構(gòu)，這些特征在分類群(如科、屬和種等)間區(qū)分度明顯，且在分類群內(nèi)穩(wěn)定。由于其形態(tài)微小，掃描電鏡就成為重要的觀察工具。用掃描電鏡觀察的生物樣品必須經(jīng)過干燥和導(dǎo)電處理，但在這一過程中常因急劇縮水致使樣品變形。對于蘚類植物的蒴齒結(jié)構(gòu)及孢子等觀察樣品的處理相對簡單，因?yàn)檫@些結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁厚，表面較為堅(jiān)硬，自然風(fēng)干即可[1-7]。但蘚類植物的葉、假根和芽胞等含水量較高的幼嫩器官經(jīng)自然風(fēng)干后，細(xì)胞易出現(xiàn)收縮、塌陷等變形，致使這些重要結(jié)構(gòu)嚴(yán)重失真[8]。臨界點(diǎn)干燥法可避免表面張力的影響，較好地保存樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)[9]。因蘚類植物細(xì)胞有細(xì)胞壁不同于動物組織的處理方法[10-11]；又因植物體形態(tài)微小，葉片由單層細(xì)胞組成，假根、絲體等由單列細(xì)胞組成，所以也區(qū)別于其他高等植物組織的處理方法[12]，但目前國內(nèi)未見相關(guān)研究報(bào)道。本文以觀察叢蘚科厚肋流蘇蘚[Crossidiumcrassinerve(De Not.) Jur.]葉片中肋腹面絲體為例，探討掃描電鏡樣品的制備技術(shù)，從而找出一種較理想的掃描電鏡樣品制備方法，為蘚類植物其他樣品的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

將采自陜西省神木縣(中科院水利部水土保持研究所侵蝕與環(huán)境試驗(yàn)站)生物結(jié)皮中的厚肋流蘇蘚[Crossidiumcrassinerve(De Not.) Jur.]標(biāo)本裝入密封袋中低溫下帶回實(shí)驗(yàn)室，置于冰箱4 °C條件下保存。

1.2 方 法

(1) 分揀。在體視顯微鏡下從生物結(jié)皮中分揀出厚肋流蘇蘚，用清水沖洗沙粒等雜質(zhì)，吸水紙吸干植物表面水分。在體視顯微鏡下從植株上剝離30～40片帶絲體的完好葉片。

(2) 固定。將葉片放入盛有2.5%戊二醛溶液(0.2 mol/L磷酸緩沖液配制)[13]的青霉素小瓶中，密封小瓶，用注射器反復(fù)抽取氣體使葉片下沉，以便葉片完全浸于固定液中，4°C條件下固定3 h。隨后，用pH 7.2的0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次，每次5 min。

(3) 脫水。使用梯度濃度酒精逐級脫水：50%、70%、80%、90%各5 min，100%共3次，分別為5、10和20 min。

(4) 置換。移入乙醇和乙酸異戊酯(1∶1)的混合溶液中15 min以及乙酸異戊酯中20 min，置換2次或過夜。抽取氣體或適當(dāng)搖動使材料充分接觸液體。

(5) 臨界點(diǎn)干燥。將厚肋流蘇蘚葉片倒入內(nèi)面鋪有濾紙的鋼網(wǎng)籃中，用液化CO2在HITACHI HCP-2型臨界點(diǎn)干燥儀中干燥2 h。

(6) 裝臺。在體式顯微鏡下，用小號毛刷將葉片移到貼有雙面膠帶的金屬臺上(著生絲體的葉腹面朝上)，經(jīng)HITACHI E-1020型離子濺射儀噴金鍍膜。

(7) 觀察。用HITACHI S-4800型掃描電子顯微鏡觀察拍照。

(8) 對照實(shí)驗(yàn)。分揀出10～20片帶絲體的完好葉片自然風(fēng)干，未經(jīng)臨界點(diǎn)干燥法處理的材料直接裝臺后觀察。

2 結(jié)果與討論

(1) 圖1是經(jīng)臨界點(diǎn)干燥法制備的厚肋流蘇蘚葉片及葉腹面中肋上絲體掃描電鏡照片。結(jié)果顯示：葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，與自然生活狀態(tài)一致(見圖1(a))；葉中肋腹面中上部著生分枝或不分枝的絲體，每個絲體由2～7個細(xì)胞組成，絲體末端細(xì)胞呈圓柱形至圓錐形，末端細(xì)胞頂部有2～4個疣(見圖1(b))。絲體細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)飽滿、表面光滑，絲體末端細(xì)胞的疣形態(tài)和數(shù)目清晰可辨，觀察效果理想，以此可區(qū)分該種與屬內(nèi)其他種。圖2是未經(jīng)臨界點(diǎn)干燥處理的樣品掃描電鏡照片，可見絲體細(xì)胞和疣極度皺縮、塌陷，無法辨別細(xì)胞界限，疣的形態(tài)和數(shù)目更是無從知曉。該研究采用臨界點(diǎn)干燥法可有效避免細(xì)胞壁較薄的蘚類植物器官——絲體細(xì)胞表面張力的影響，從而較好地保存了樣品的微形態(tài)結(jié)構(gòu)。蘚類植物葉片和芽胞等器官的細(xì)胞與絲體細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)類似，即均是含水分較高的薄壁細(xì)胞，作者利用該方法處理其他蘚類植物也達(dá)到了理想的觀察效果[14]。因此，該臨界點(diǎn)干燥法適用于蘚類各器官的掃描電鏡觀察材料制備。

圖1 經(jīng)臨界點(diǎn)干燥的厚肋流蘇蘚葉片及腹面絲體掃描電鏡照片

圖2 未經(jīng)臨界點(diǎn)干燥的厚肋流蘇蘚葉片 腹面絲體掃描電鏡照片

(2) 根據(jù)蘚類植物細(xì)胞主要成分，在樣品制備中選用了濃度為2.5 %戊二醛作為固定液，該固定液對多糖、糖蛋白、微管等有較好的固定作用，且不會使組織細(xì)胞固定后變脆[14]。固定時要使材料充分接觸液體，否則，漂浮于固定液上面的材料，因細(xì)胞結(jié)構(gòu)沒有被“固定”，即使后續(xù)處理過程正常也無法避免細(xì)胞出現(xiàn)皺縮或塌陷現(xiàn)象。由于細(xì)胞壁對固定液的滲透有一定的阻礙作用，固定時間不可過短[15]，但蘚類植物器官多為單層細(xì)胞(如葉、苞葉等)或單列細(xì)胞(如假根和絲體等)組成，易與固定液接觸，固定時間也無需太長，經(jīng)試驗(yàn)認(rèn)為固定3 h為宜。

(3) 樣品從乙酸異戊酯中移入鋼網(wǎng)籃后，不可久置于空氣中，否則會因乙酸異戊酯揮發(fā)，空氣進(jìn)入細(xì)胞，使隨后進(jìn)行的液態(tài)CO2臨界點(diǎn)干燥失去意義，最終不可避免地造成樣品發(fā)生形變。但樣品中殘留過多的乙酸異戊酯會使樣品干燥后仍有殘余，從而影響干燥效果。所以，以樣品半干時放入臨界點(diǎn)干燥儀為宜。

(4) 干燥后的樣品較脆弱，轉(zhuǎn)移時要“輕取輕放”，避免用鑷子等硬物碰觸，以防細(xì)胞破碎，影響觀察效果，最好選用小號的軟毛刷貼臺。

3 結(jié) 語

本文實(shí)驗(yàn)中的臨界點(diǎn)干燥法有效避免了表面張力的影響，較好地保存了蘚類樣品的微形態(tài)結(jié)構(gòu)，該方法適用于蘚類各器官的掃描電鏡觀察材料制備。清晰的微形態(tài)結(jié)構(gòu)將為蘚類植物分類提供重要依據(jù)，化解一些特殊類群分類中難以解決的問題。

[1] 王曉蕊，王立寶，李 敏，等. 16種叢蘚科(Pottiaceae)植物蒴齒形態(tài)特征及其系統(tǒng)學(xué)意義[J]. 植物研究，2013，33(2): 129-133.

[2] 李利博，趙建成. 真蘚屬(BryumHedw. )蒴齒形態(tài)特征及其分類學(xué)意義[J]. 植物研究，2009，29 (6): 651-658.

[3] 杜桂森，汪楣芝，張玉龍. 23種頂蒴蘚類孢子形態(tài)的觀察[J]. 云南植物研究，2000，22(3): 277-281.

[4] 杜桂森，汪楣芝，張玉龍.中國真蘚屬孢子形態(tài)的研究[J]. 植物分類學(xué)報(bào)，1998，36(5): 436-440.

[5] 何紅燕，熊源新，鄧 坦. 七種蘚類孢子形態(tài)研究[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2009，28(2): 136-140.

[6] 買買提明·蘇來曼，艾尼瓦爾·阿不都熱衣木，艾克巴爾·阿布都拉. 叢蘚科和大帽蘚科植物孢子的形態(tài)研究[J]. 干旱區(qū)研究，2010，27(5): 745-749.

[7] 于 晶，王全喜，曹 同. 多態(tài)無軸蘚(Archidiumochioense)孢子形態(tài)及孢壁結(jié)構(gòu)[J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，34(3): 60-62.

[8] 曹 娜，趙建成. 真蘚科(Musci: Bryaceae)芽孢形態(tài)特征及其分類學(xué)意義[J]. 植物研究，2009，29 (3): 264-269.

[9] 閉志強(qiáng)，蔡炳華，梁世春. 幾種掃描電子顯微鏡植物樣品的制備技術(shù)[J]. 電子顯微學(xué)報(bào)，2002，21(2): 213-214.

[10] 劉天福，張琳輝. 柯偽絳蟲卵電鏡掃描附件樣品的制備方法[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，13(suppl.): 89-91.

[11] 徐柏森，馮 汀，劉 剛. 掃描電鏡生物樣品的快速制備方法研究[J]. 中國野生植物資源，2000，19(6): 47-49.

[12] 李潤唐，張映南，田大倫. 柑橘類植物葉片的氣孔研究[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2004，21(5): 419-424.

[13] Liu Yongying, Zhao Jiancheng, Li Lin. Gymnostomiella vernicosa var. acuminate J. C. Zhao & Y. Y. Liu (Pottiaceae), a new moss variety from the Taihang Mountain Range, China[J]. Journal of Bryology, 2012, 34(3): 246-249.

[14] 李和平. 植物顯微技術(shù)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2009：251.

[15] 徐柏森. 實(shí)用電鏡技術(shù)[M]. 南京：東南大學(xué)出版社，2008：173-176.

Sample Preparation for Scanning Electron Microscope in Moss

LIUYong-ying1, 2,QUANYu-ping1,LILin2,ZHAOJian-cheng2

(1.Department of Biology, Jiaozuo Teachers College, Jiaozuo 454001, China;2. College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, China)

The aim of the work is to find out an optimizing method of sample preparation for scanning electron microscope (SEM) in moss based on critical point drying. Dozens ofCrossidiumcrassinerveleaves were peeled away from the sorted and washed plants, firstly these leaves were fixed in 2.5% glutaraldehyde solution for 3 h, secondly they were dehydrated in increasing ethanol gradients, 50%, 70%, 80% and 90%, each step for 5 min, finally in 100% with three times, for 5 min, 10 min and 20 min, respectively. After being rinsed with phosphate buffer solution, thirdly they were displaced by ethanol and isoamyl acetate mixture solution (1∶1) and isoamyl acetate for 15 min and 20 min successively, or overnight, then by critical point drying for 2 h, they were stuck on the specimen stub and sputtered with a gold layer. Finally they were analyzed in an SEM. Untreated leaves were regarded as a control group. The filament cells of the moss have plump form, integrated structure and smooth surface, and the number and shape of papilla of filament end cells were very clear by the critical point drying. A control group of without the critical point drying showed that the filament cells shrank and collapsed seriously so that the boundary of the cells was invisible, and the shape and number of papillae were unclear. It can conclude that the critical point drying can avoid surface tension of moss cells, preserve the microstructure of the biological sample, and could be used to sample preparation for SEM for every organic of moss.

critical point drying; moss; scanning electron microscope(SEM)

2015-05-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31370237)；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(15B180007)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(2013130312005)

劉永英(1969-)，女，河南淮陽人，博士，副教授，主要從事苔蘚植物學(xué)研究。Tel.: 13639629754; E-mail: jzbotany@163.com

趙建成(1956-)，男，陜西周至人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事苔蘚植物學(xué)研究。

Tel.: 0311-80787560; E-mail: zhaojiancheng@mail.hebtu.edu.cn

Q 94-3396；N 33

A

1006-7167(2016)02-0052-03