陳曉宇 郭瑞娟 王菲 吳斌 洪廣亮 趙光舉 李萌芳 邱俏檬 盧中秋

對(duì)氧磷酶1過(guò)表達(dá)對(duì)敵敵畏急性中毒小鼠肝損傷保護(hù)作用的研究

陳曉宇 郭瑞娟 王菲 吳斌 洪廣亮 趙光舉 李萌芳 邱俏檬 盧中秋

目的 觀察對(duì)氧磷酶1（PON1）過(guò)表達(dá)對(duì)敵敵畏中毒小鼠肝損傷的保護(hù)作用。方法 將96只Balb/c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、敵敵畏染毒組、對(duì)照慢病毒（Lv-GFP）＋敵敵畏組和PON1過(guò)表達(dá)重組慢病毒（Lv-PON1）＋敵敵畏組，每組24只。Lv-GFP＋敵敵畏組、Lv-PON1＋敵敵畏組小鼠分別經(jīng)尾靜脈轉(zhuǎn)染Lv-GFP、Lv-PON1第3天，連同敵敵畏染毒組小鼠腹腔注射敵敵畏溶液9mg/kg染毒，同時(shí)正常對(duì)照組給予等量0.9%氯化鈉注射液。染毒后分別于6、12、24、48h各取6只小鼠麻醉處死，化學(xué)比色法檢測(cè)血清乙酰膽堿酯酶（AChE）、ALT和AST活力，ELISA測(cè)定肝組織TNF-α和IL-1β水平，Western blot檢測(cè)肝組織NF-κBp65表達(dá)，HE染色觀察肝組織病理學(xué)變化。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，6、12、24h敵敵畏染毒組AChE活力下降及6、12、24、48h ALT、AST活力升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)敵敵畏染毒組比較，Lv-PON1＋敵敵畏組AChE活力明顯升高，ALT、AST活力明顯降低（P＜0.05）。與正常對(duì)照組比較，6、12、24、48h敵敵畏染毒組TNF-α、IL-1β水平升高，NF-κBp65表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)敵敵畏染毒組比較，Lv-PON1＋敵敵畏組TNF-α、IL-1β水平明顯降低，NF-κBp65表達(dá)明顯降低，除48h IL-1β外，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。光鏡下可見，敵敵畏染毒組染毒后12h肝病理?yè)p傷明顯，Lv-PON1＋敵敵畏組小鼠肝損傷較之有所減輕。結(jié)論 調(diào)控PON1過(guò)表達(dá)能夠通過(guò)下調(diào)敵敵畏急性中毒小鼠肝組織NF-κBp65表達(dá)，減少TNF-α、IL-1β釋放，減輕炎癥損傷，對(duì)敵敵畏急性中毒小鼠肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

敵敵畏 對(duì)氧磷酶1 肝損傷 炎癥

急性有機(jī)磷農(nóng)藥中毒（acute organophosphorus poisoning，AOPP）可導(dǎo)致心、肺、腦、肝等重要器官功能損害，嚴(yán)重者可誘發(fā)機(jī)體發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic innammatory response syndrome，SIRS），并進(jìn)一步發(fā)展為多器官功能障礙綜合征而導(dǎo)致死亡。雖然炎癥反應(yīng)與AOPP中毒后病情嚴(yán)重程度的關(guān)系復(fù)雜，但是炎癥反應(yīng)參與AOPP中毒引起的多器官功能損傷已得到廣泛認(rèn)可。肝臟作為有機(jī)磷代謝的主要器官，中毒患者可出現(xiàn)肝功能損傷而引發(fā)的肝功能衰竭。對(duì)氧磷酶1（PON1）具有抗氧化、抗炎、清除自由基等作用，并參與多種疾病的發(fā)展過(guò)程[1-3]。筆者通過(guò)建立敵敵畏急性中毒小鼠肝損傷模型，提前給予PON1過(guò)表達(dá)重組慢病毒進(jìn)行干預(yù)，觀察PON1過(guò)表達(dá)對(duì)敵敵畏急性中毒小鼠肝組織參與炎癥反應(yīng)的NF-κBp65及TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響，探討其對(duì)敵敵畏急性中毒小鼠肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑 敵敵畏（美國(guó)Sigma公司），乙酰膽堿酯酶（AChE）、AST、ALT試劑盒（南京建成生物工程研究所），TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒（美國(guó)R&D systems公司），RIPA裂解液，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所），兔抗鼠NF-κBp65抗體（美國(guó)Abcam公司），化學(xué)發(fā)光劑（ECL）試劑盒（美國(guó)Thermo scientific公司）。PON1過(guò)表達(dá)重組慢病毒（Lv-PON1）和對(duì)照慢病毒（Lv-GFP）委托上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司合成。

1.2 動(dòng)物分組及處理 清潔級(jí)Balb/c雄性小鼠96只，體重18～22g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購(gòu)提供。許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。PON1過(guò)表達(dá)重組慢病毒在正常小鼠體內(nèi)的表達(dá)驗(yàn)證情況，均在本實(shí)驗(yàn)前期工作完成。現(xiàn)將96只清潔級(jí)Balb/c雄性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組（每組24只）：正常對(duì)照組、敵敵畏染毒組、Lv-GFP＋敵敵畏組、Lv-PON1＋敵敵畏組。Lv-PON1＋敵敵畏組經(jīng)尾靜脈注射給予Lv-PON1 2×107TU，轉(zhuǎn)染后第3天腹腔注射敵敵畏溶液9mg/kg；Lv-GFP＋敵敵畏組經(jīng)尾靜脈給予Lv-GFP 2×107TU，轉(zhuǎn)染后第3天腹腔注射敵敵畏溶液9mg/kg；敵敵畏染毒組經(jīng)尾靜脈注射同病毒液等量的0.9%氯化鈉注射液，第3天腹腔注射敵敵畏溶液9mg/kg；正常對(duì)照組經(jīng)尾靜脈注射同病毒液量的0.9%氯化鈉注射液，第3天腹腔注射同敵敵畏溶液等量的0.9%氯化鈉注射液。各組分別于6、12、24、48h取6只小鼠麻醉處死，留取血液、肝組織標(biāo)本。血液于室溫靜置1h，4℃、5 000r/min離心15min，取上清液；肝組織經(jīng)預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液沖洗后立即轉(zhuǎn)入液氮，-80℃保存。取肝臟同一部位，預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液沖洗后置于4%多聚甲醛溶液中固定，進(jìn)行肝組織病理學(xué)觀察。

1.3 血清AChE、AST和ALT活力測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明，化學(xué)比色法檢測(cè)各組小鼠血清AChE、AST和ALT活力。

1.4 肝組織TNF-α、IL-1β水平測(cè)定 制備10%小鼠肝組織勻漿液，BCA法測(cè)蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明，ELISA法檢測(cè)各組肝組織TNF-α、IL-1β水平。

1.5 肝臟組織NF-κBp65表達(dá)檢測(cè) 取肝組織100mg，RIPA裂解液勻漿，BCA法測(cè)蛋白濃度，制備3%濃縮膠，10%分離膠，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，兔抗鼠NF-κBp65抗體（1∶1 000）、兔抗鼠GAPDH抗體（1∶5 000），4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，10min/次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體山羊抗兔抗體（1∶5 000）室溫下?lián)u床孵育1h，TBST洗膜3次，10min/次，ECL顯影，曝光。結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)顯示，用Quantity one軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.6 肝組織病理觀察 4%多聚甲醛固定液中保存的肝組織，脫水和包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠臨床表現(xiàn)比較 正常對(duì)照組小鼠反應(yīng)靈敏，呼吸平穩(wěn)，皮毛光滑，活動(dòng)自如，未見異常。敵敵畏染毒組小鼠在染毒后5min內(nèi)即出現(xiàn)流淚、流涎，腹瀉，呼吸急促，步態(tài)不穩(wěn)，肌肉震顫，蜷縮成團(tuán)，精神萎靡，隨時(shí)間的延長(zhǎng)癥狀逐漸緩解。Lv-PON1＋敵敵畏組小鼠染毒后中毒癥狀較敵敵畏染毒組有所減輕。Lv-GFP＋敵敵畏組與敵敵畏染毒組相比小鼠的中毒癥狀無(wú)明顯區(qū)別。

2.2 各組小鼠肝組織病理學(xué)變化比較 正常對(duì)照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞排列整齊呈索狀并以中央靜脈為中心向外輻射；敵敵畏染毒組染毒后6、12、24、48h肝組織結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞腫脹變形、排列紊亂，可見紅細(xì)胞明顯滲出，其中12h肝組織損害變化最為顯著；Lv-PON1＋敵敵畏組的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)損害、充血滲出較敵敵畏染毒組有所減輕，詳見圖1（見插頁(yè)）。

2.3 各組小鼠血清AChE、AST和ALT活力的比較與正常對(duì)照組比較，敵敵畏染毒組6、12、24h AChE活力均受到抑制，均明顯低于正常水平（均P＜0.05），但48hAChE活力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），6、12、24、48h AST、ALT活力均明顯升高（均P＜0.05）；與敵敵畏染毒組比較，Lv-PON1＋敵敵畏組6、12、24h AChE活力抑制程度均明顯減輕（均P＜0.05），但48h AChE活力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），6、12、24、48h AST、ALT活力均明顯降低（均P＜0.05），Lv-GFP＋敵敵畏組AChE、AST、ALT在各時(shí)點(diǎn)與敵敵畏染毒組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），詳見表1。

表1 各組小鼠血清AChE、AST和ALT活力的比較

2.4 各組小鼠肝組織TNF-α、IL-1β水平的比較 正常對(duì)照組TNF-α和IL-1β處于正常低水平。與正常對(duì)照組比較，敵敵畏染毒組小鼠肝組織TNF-α、IL-1β均明顯升高，隨時(shí)間逐漸下降，但依然高于正常對(duì)照組水平。與敵敵畏染毒組比較，Lv-PON1＋敵敵畏組在6、12、24、48h肝組織TNF-α水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），IL-1β水平在6、12、24h均明顯下降（均P＜0.05），但48h IL-1β變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），Lv-GFP+敵敵畏組各時(shí)點(diǎn)TNF-α、IL-1β水平比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），詳見表2。

表2 各組小鼠肝組織TNF-α、IL-1β水平的比較

2.5 各組小鼠肝組織NF-κBp65表達(dá)的比較 與正常對(duì)照組相比，敵敵畏染毒組6、12、24、48h肝臟組織中NF-κBp65水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與敵敵畏染毒組相比，除48h外，Lv-PON1+敵敵畏組其余時(shí)點(diǎn)NF-κBp65表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），Lv-GFP+敵敵畏組各時(shí)點(diǎn)NF-κBp65表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），詳見表3，圖2。

3 討論

有機(jī)磷農(nóng)藥迄今還是應(yīng)用廣泛的殺蟲藥，由于自服、誤服或防護(hù)不當(dāng)?shù)仍虬l(fā)生急性中毒事件屢見不鮮[4]。血清AChE活力水平作為評(píng)價(jià)有機(jī)磷中毒嚴(yán)重程度及預(yù)后的常用可靠標(biāo)志，在臨床診治中有重要的意義。本研究結(jié)果表明，敵敵畏染毒組染毒后各組AChE活力明顯低于正常水平，而PON1過(guò)表達(dá)重組慢病毒干預(yù)后小鼠血清AChE活力受抑程度逐漸減輕，說(shuō)明上調(diào)PON1活性可以減輕AChE活力抑制程度，這與Wang等[5]的研究結(jié)果相一致。肝臟作為有機(jī)磷代謝的主要器官，有機(jī)磷化合物進(jìn)入機(jī)體后主要分布在肝組織，可對(duì)肝臟進(jìn)行直接毒害。血清AST和ALT活力升高是反應(yīng)急性肝損傷的重要指標(biāo)[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，敵敵畏染毒后各組小鼠血清AST和ALT活力均明顯升高，PON1過(guò)表達(dá)重組慢病毒干預(yù)后血清AST和ALT水平明顯降低，結(jié)合肝組織病理學(xué)變化，說(shuō)明調(diào)控PON1基因可減輕敵敵畏急性中毒導(dǎo)致的肝損傷。

表3 各組小鼠肝組織NF-κBp65/GAPDH灰度值比較

圖2 各組小鼠肝組織NF-κBp65電泳圖（1：正常對(duì)照組；2：敵敵畏染毒組；3：Lv-GFP＋敵敵畏組；4：Lv-PON1＋敵敵畏組）

有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)入機(jī)體后刺激體內(nèi)免疫炎癥系統(tǒng)，釋放大量的炎癥因子[7]，導(dǎo)致組織損傷進(jìn)一步加重。AOPP患者血清TNF-α、IL-6等炎癥水平明顯升高，且中毒越嚴(yán)重其升高程度越明顯[8-9]。TNF-α是炎癥反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)最早，也是非常重要的介質(zhì)之一，不僅可以活化中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，還可以誘導(dǎo)IL-1β的表達(dá)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌TNF-α；同時(shí)，TNF-α可以觸發(fā)NF-κB信號(hào)通路的激活，由于TNF-α啟動(dòng)子上含有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，所以NF-κB可以反過(guò)來(lái)調(diào)節(jié)TNF-α的表達(dá)。NF-κB是參與炎癥反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子，正常生理狀態(tài)下NF-κB主要與IκB（抑制蛋白）存在于真核細(xì)胞的胞質(zhì)中，當(dāng)受到應(yīng)激原的刺激，NF-κB與IκB分離移位進(jìn)入胞核，與靶基因NF-κB結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，迅速誘導(dǎo)靶基因mRNA的合成，開啟炎癥因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而參與免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[10]。有研究證實(shí)，在TPA誘導(dǎo)的大鼠皮膚炎癥模型中，結(jié)合PEP-1-PON1可以抑制NF-κBp65通路的活化，使TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA水平降低，改善炎癥損傷[11]。本研究中，正常對(duì)照組中肝組織TNF-α、IL-1β水平處于低水平，敵敵畏染毒組肝組織TNF-α、IL-1β水平明顯高于正常對(duì)照組，說(shuō)明急性敵敵畏中毒肝損傷過(guò)程存在炎癥反應(yīng)，PON1過(guò)表達(dá)重組慢病毒干預(yù)后TNF-α、IL-1β隨時(shí)間逐漸下降。提示PON1過(guò)表達(dá)可以降低炎癥因子水平，抑制炎癥反應(yīng)。除此，PON1過(guò)表達(dá)重組慢病毒干預(yù)后NF-κBp65表達(dá)較敵敵畏染毒組降低。

PON1發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制目前尚不清楚，本研究探索PON1與NF-κB及其下游因子之間的關(guān)系可能僅僅是其抗炎機(jī)制中的一小部分，PON1在NF-κB通路中主要和具體的作用靶點(diǎn)有待于進(jìn)一步的研究；另外，還需要進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的觀察和研究，這將對(duì)本實(shí)驗(yàn)具有一定的指導(dǎo)意義。

綜上所述，調(diào)控PON1過(guò)表達(dá)能夠緩解AChE抑制，降低肝功能指標(biāo)AST、ALT水平，并可能通過(guò)NF-κBp65通路減少炎癥因子TNF-α、IL-1β的釋放，降低炎癥水平，減輕肝損傷。本文從直接和間接兩個(gè)方面闡述了PON1基因過(guò)表達(dá)對(duì)敵敵畏中毒導(dǎo)致的肝損傷具有一定的保護(hù)作用，為AOPP的預(yù)防提供了新思路和新方向。

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Over-expression of PON1 protects mice from dichlorvos poisoning-induced liver injury

CHEN Xiaoyu,GUO Ruijuan,WANG Fei，et al.Department of ICU,Huangyan Hospital of Wenzhou Medical University,Taizhou 318020,China

Objective To investigate the effect of over expression of paraoxonase 1 gene(PON1)on inflammation and liver injury induced by dichlorvos(DDVP)poisoning in mice. Methods Ninety six Balb/c mice were randomly divided into 4 groups: normal control group,the dichlorvos poisoning group(9 mg/kg dichlorvos),blank lentivirus group(Lv-GFP+dichlorvos)and PON1 recombinant lentivirus group(Lv-PON1+dichlorvos)with 24 mice in each group.The Lv-GFP,Lv-PON1 were transfected to mice via tail vein in Lv-GFP and Lv-PON1 groups and 9 mg/kg dichlorvos solution were intraperitoneal injected to mice 3 days after transfection,while same amount of saline solution was given to normal control group.At 6 h,12 h,24 h,48 h after dichlorvos injection,6 mice were sacrificed in batch.Serum acetylcholinesterase(AChE),alanine aminotransferase (ALT)and aspartate transaminase(AST)were measured with chemical colorimetry.The levels of tumor necrosis-α(TNF-α)and interleukin 1β(IL-1β)in liver tissue were determined by enzyme-linked immunosorbent(ELISA).The expression of NF-κBp65 in liver tissue was detected by Western blot.The pathological changes of liver tissue were observed with HE staining. Results Compared with normal control group,the AChE activity decreased and ALT,AST activity increased at 6 h,12 h,24 h after dichlorvos injection (P＜0.05).Compared to dichlorvos group at corresponding time points,the AChE activity of Lv-PON1+dichlorvos group was significantly increased,and ALT,AST activity significantly decreased(P＜0.05).Compared with normal control group,the TNF-α, IL-1β,and NF-κBp656 levels in dichlorvos group at 6 h,12 h,24 h,48 h were elevated(P＜0.05).Compared with dichlorvos group at corresponding time points,the TNF-α,IL-1β levels and NF-κBp65 expression in Lv-PON1+dichlorvos group were significantly decreased(P＜0.05),expect the IL-1β expression in 48h.Compared with the Lv-PON1+dichlorvos group,liverinjury in dichlorvos group at 12h were significantly severe. Conclusion Over expression of PON1 can reduce inflammation and protect the liver injury induced by acute dichlorvos poisoning in mice,which is associated with down-regulation of NF-κBp65 expression and reduced TNF-α,IL-1β levels.

Dichlorvos PON1 Liver injury Inflammation

2015-07-06）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省“十二五”重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)計(jì)劃資助；浙江省中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)計(jì)劃（2012-XK-A28）；浙江省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新學(xué)科建設(shè)計(jì)劃（11-CX26）

318020 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬黃巖醫(yī)院ICU（陳曉宇）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)中心（郭瑞娟、王菲、吳斌、洪廣亮、趙光舉、李萌芳、邱俏檬、盧中秋）

盧中秋，E-mail：lzq640815@163.com