周艷飛 ， 李 浛 ， 王亞芳，李應(yīng)超 ， 魏 鐳 ， 王海軍

(1.北京市獸藥監(jiān)察所 ， 北京大興102629；2.北京生泰爾生物科技有限公司 ，北京大興102206 ； 3.北京市中獸藥工程技術(shù)研究中心 ， 北京大興102206)

?

銀黃口服液含量測(cè)定方法的改進(jìn)試驗(yàn)

周艷飛1， 李 浛1， 王亞芳1，李應(yīng)超1， 魏 鐳1， 王海軍2，3

(1.北京市獸藥監(jiān)察所 ， 北京大興102629；2.北京生泰爾生物科技有限公司 ，北京大興102206 ； 3.北京市中獸藥工程技術(shù)研究中心 ， 北京大興102206)

為了建立同時(shí)測(cè)定銀黃口服液中綠原酸和黃芩苷的高效液相色譜方法，采用Discovery C18柱(4.6×150 mm，5 μm)，以乙腈-0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm。結(jié)果目標(biāo)峰分離度良好，綠原酸和黃芩苷的質(zhì)量濃度與峰面積分別在1.00～20.05 μg/mL(R2=0.999 9)、10.07～201.55 μg/mL(R2=0.999 9)呈良好線性，平均加樣回收率分別為99.90%和100.73%，標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于1.0%。表明此方法重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，可準(zhǔn)確、快速測(cè)定銀黃口服液中的綠原酸和黃芩苷含量。

銀黃口服液 ； 高效液相色譜法 ； 黃芩苷 ； 綠原酸

銀黃口服液是由黃芩與金銀花提取加工而成，具有抗菌、清熱解毒、消炎、退熱等作用，臨床上廣泛應(yīng)用于上呼吸道感染、急慢性扁桃體炎等癥的治療，療效確切[1]。銀黃口服液最早被列入新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第2冊(cè)(1993年)中，自2000年以來被歷版中國藥典收載。中國藥典(2010年版)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，分別進(jìn)行金銀花和黃芩苷的含量測(cè)定，檢測(cè)時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)[2]。

目前，已有相關(guān)研究對(duì)銀黃口服液中綠原酸和黃芩苷進(jìn)行了同時(shí)含量測(cè)定，方法報(bào)道不一[3-6]。本試驗(yàn)根據(jù)國家獸藥典委員會(huì)2015版獸藥典標(biāo)準(zhǔn)的要求，對(duì)銀黃口服液中綠原酸和黃芩苷同時(shí)測(cè)量方法進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，為新版獸藥典中銀黃口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)變更提供試驗(yàn)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料

2695高效液相色譜儀，2487紫外檢測(cè)器(Waters 公司)；1100高效液相色譜儀，VWD紫外檢測(cè)器(Agilent公司)；e2695高效液相色譜儀，2489紫外檢測(cè)器(Waters公司)；XP205電子天平(上海梅特勒有限公司)；DT255 超聲清洗機(jī)(BANDELIN公司)。銀黃口服液，愛迪森(北京)生物科技有限公司提供，100 mL/瓶，批號(hào)1207271、1212031、1212211)；綠原酸對(duì)照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)Z0260611，含量96.6%)；黃芩苷對(duì)照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號(hào)Z0271109，含量98.8%)。HPLC 級(jí)乙腈，磷酸等其他試劑為分析級(jí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Discovery C18柱(4.6×150 mm，5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm，進(jìn)樣體積10 μL，以乙腈為流動(dòng)相A，以0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速1 mL/min。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000，按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500。見表1。

表1

2.2 溶液制備

2.2.1 綠原酸對(duì)照品貯備液 精密稱取綠原酸對(duì)照品10.38 mg，置100 mL量瓶中，加50%甲醇溶解后稀釋至刻度，搖勻，作為綠原酸貯備液。

2.2.2 黃芩苷對(duì)照品貯備液精密稱取黃芩苷對(duì)照品10.20 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為黃芩苷貯備液。

2.2.3 混合對(duì)照品溶液 分別精密量取綠原酸貯備液2 mL和黃芩苷貯備液25 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 樣品溶液 精密量取樣品1 mL，置50 mL棕色量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取3 mL，置25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 測(cè)定法 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液與樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。數(shù)見圖1、圖2。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取綠原酸貯備液和黃芩苷貯備液適量，加50%甲醇稀釋制成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，含綠原酸濃度分別為1.00、3.00、5.01、7.02、10.02、20.05 μg/mL，含黃芩苷濃度分別為10.07、30.03、50.39、70.54、100.78、201.55 μg/mL。按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。綠原酸線性方程：Y=3.123 0×10-5X+0.034 0，R2=0.999 9，綠原酸濃度范圍在1.00～20.05 μg/mL，見圖1。黃芩苷線性方程：Y=5.047 9×10-5X-0.039 6，R2=0.999 9，黃芩苷濃度范圍在10.07～201.55 μg/mL，見圖3、圖4。

圖1 混合對(duì)照品

注：綠原酸峰的保留時(shí)間為9.084 min，黃芩苷峰的保留時(shí)間為19.951 min

圖2 供試品

注：綠原酸峰的保留時(shí)間為9.158 min，黃芩苷峰的保留時(shí)間為19.949 min

2.5 精密度考察 分別精密量取綠原酸和黃芩苷對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，綠原酸和黃芩苷峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.76%，0.65%。

圖3 綠原酸線性圖

圖4 黃芩苷線性圖

2.6 重復(fù)性考察 取同一批號(hào)樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定應(yīng)不大于2.0%)分別為0.13%和0.32%。

2.7 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一批銀黃口服液供試品溶液，按照上述色譜條件，30 h內(nèi)分別每隔2 h進(jìn)樣一次，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。數(shù)據(jù)見表2。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 本加樣回收試驗(yàn)按照80%、100%、120%的量進(jìn)行添加回收，即每個(gè)濃度制備3份平行樣，分別平行進(jìn)樣3針。精密量取已知含量的銀黃口服液9份，每份1 mL，置100 mL棕色量瓶中，分別按照綠原酸和黃芩苷實(shí)際含量的80%、100%、120%精密加入綠原酸和黃芩苷，用水稀釋至刻度，搖勻；精密量取3 mL，置25 mL棕色量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。所得數(shù)據(jù)見表3、表4。

表2 新方法溶液穩(wěn)定性考察

表3 綠原酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

表4 黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.9 色譜柱耐用性考察 分別采用不同的高效液相色譜儀和色譜柱，按照新方法色譜條件，分別精密吸取綠原酸和黃芩苷的混合對(duì)照品溶液、樣品溶液注入色譜儀測(cè)試。結(jié)果見表5。

表5 色譜柱耐用性考察

3 討論

3.1 樣品的制備 樣品溶液按照原方法進(jìn)行制備，由于黃芩苷和綠原酸濃度相差10倍左右，本研究將綠原酸對(duì)照品溶液濃度降低10倍，以保持綠原酸良好的線性關(guān)系。選擇溶解供試品溶劑時(shí)，本研究考察了采用50%甲醇或水作為第一步的溶劑，結(jié)果顯示含量無差異，說明50%甲醇或水對(duì)銀黃注射液均具有良好的溶解性，考慮對(duì)照品溶液的溶劑為50%甲醇，所以最終選擇50%甲醇作為第一步溶解的溶劑。

3.2 流動(dòng)相的選擇 原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案中，綠原酸和黃芩苷的等度洗脫流動(dòng)相不同，比例相差亦較大，為了采用同一種流動(dòng)相同時(shí)對(duì)兩者進(jìn)行含量測(cè)定，本研究參考文獻(xiàn)研究及兩者流動(dòng)相溶劑和比例的基礎(chǔ)上[7-9]，有機(jī)相選用洗脫能力較強(qiáng)的乙腈進(jìn)行梯度洗脫。洗脫時(shí)，先大比例水相分離出綠原酸，然后再提高有機(jī)相比例洗脫出黃芩苷，直至黃芩苷完全流出以及再無其他組分干擾后，逐漸過渡到最初比例平衡色譜柱，循環(huán)運(yùn)行下一針。

3.3 波長(zhǎng)選擇 文獻(xiàn)報(bào)道中[10-11]，黃芩苷檢測(cè)波長(zhǎng)一般為274 nm，綠原酸檢測(cè)波長(zhǎng)以327 nm居多。銀黃口服液中綠原酸含量遠(yuǎn)低于黃芩苷，為了得到目標(biāo)峰美觀的色譜圖，本方法選擇測(cè)定綠原酸的波長(zhǎng)為綠原酸和黃芩苷同時(shí)測(cè)量的波長(zhǎng)對(duì)兩者成分進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。

4 結(jié)論

通過本方法所得目標(biāo)成分分離度好、理論塔板數(shù)高，方法穩(wěn)定可靠，可作為銀黃口服液的含量測(cè)定方法。實(shí)際檢測(cè)中，此方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單、快捷，檢測(cè)時(shí)間為較原方法縮短1 倍以上，大大提高了檢測(cè)效率，對(duì)促進(jìn)實(shí)際檢測(cè)和生產(chǎn)具有積極的意義。

[1] 陳美娟，葛李，顧立，等.銀黃口服液抗菌作用研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18(1):107-108.

[2] 中國獸藥典委員會(huì).《中華人民共和國獸藥典》2012 年版2部[S]．

[3] 張靜，劉文翔，韓艷婷.HPLC 法測(cè)定銀黃口服液中綠原酸、黃芩苷和木犀草苷的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2011，26(4)：237-239.

[4] 桑旭峰，吳海霞，徐奇超.HPLC 同時(shí)測(cè)定銀黃口服液中綠原酸和黃芩苷含量[J].中成藥，2005，27(1)：96-98.

[5] 孫博，李繼昌，王小飛，等.雞血漿中黃芩苷及綠原酸的HPLC 法建立[J].中國獸藥雜志，2013，47(3)：31-33.

[6] 翟淑平，黃斌，王秀敏，等.HPLC 法同時(shí)測(cè)定銀黃可溶性粉中綠原酸和黃芩苷的含量[J].中國獸醫(yī)雜志，2006，26(12)：1880-1882.

[7] 趙秀香，李啟艷，王磊.H PLC 法測(cè)定銀黃注射液中綠原酸的含量[J].藥物分析雜志，2006，26(12)：1880-1882.

[8] 于加平.HPLC 法測(cè)定徐長(zhǎng)卿中綠原酸的含量[J].中國獸藥雜志，2012，46(1)：34-36．

[9] 王麗聰，曹玉華，徐江蘭，等.銀黃口服液含量的質(zhì)量控制及其高效液相色譜指紋圖譜的研究[J].色譜，2006，24(4)：367-372.

[10] 韋國兵，胡奇軍，廖夫生.HPLC 法測(cè)定銀黃口服液中黃芩苷的含量[J].江西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2013，37(5)：529-531.

[11] 朱嘯風(fēng)，孫欽美，劉景俊.銀黃口服液中黃芩苷和綠原酸含量的測(cè)定[J].齊魯藥事，2004，23(6)：25-26．

Study on the Improvement of determination of chlorogenic acid and baicalin in Yinhuang Oral Liquid by HPLC

ZHOU Yan-fei1， LI Han1， WANG Ya-fang1， LI Ying-chao1， WEI Lei1， WANG Hai-jun2，3

(1.Beijing Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 102629，China；2.Beijing Centre Biology Co.，Ltd，Beijing 102206，China；3.Beijing Veterinary Drugs Engineering Research Center，Beijing 102206，China)

To establish a HPLC method for simultaneous determination of chlorogenic acid and baicalin in Yinhuang oral liquid,the Discovery C18(4.6×150 mm，5 μm)column was adopted with acetonitrile and 0.4% phosphoricacid solution was as the mobile phase and gradient elution.The flow rate was 1.0 mL/min-1，the volume of injection was 10 μL，and the detective wavelength was set at 327 nm.There were better linear relationships between the peak area and concentration at the range of 0.5～20 μg/mL(R2=0.999 8),5～199 μg/mL(R2=0.999 8)for chlorogenic acid and baicalin，respectively.The average recovery rates of chlorogenic acid and baicalin were 99.90% and 100.73%，respectively，and the RSD was less than 1.0%.The HPLC method is reproducible，specific，accurate，and can be used as a quantitative analysis of chlorogenic acid and baicalin in Yinhuang oral liquid.

Yinhuang Oral Liquid ； HPLC ； baicalin ； chlorogenic acid

WANG Hai-jun

2015-08-31

周艷飛(1972-)，女，高級(jí)獸醫(yī)師，大專，研究方向?yàn)楂F藥質(zhì)量控制，E-mail：1956437829@qq.com

王海軍，E-mail：wtianlong86@126.com

R927.2

A

0529-6005(2016)10-0089-04