王 好 ， 劉麗凡 ， 于 丹 ， 王友超 ， 周井祥

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林長(zhǎng)春130118 ；2.長(zhǎng)春市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 吉林長(zhǎng)春130061)

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桉液對(duì)錦鯉皰疹病毒細(xì)胞內(nèi)復(fù)制影響的試驗(yàn)

王 好1， 劉麗凡1， 于 丹2， 王友超1， 周井祥1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林長(zhǎng)春130118 ；2.長(zhǎng)春市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 吉林長(zhǎng)春130061)

本試驗(yàn)使用細(xì)葉桉樹(shù)的樹(shù)葉制備成的桉液作為病毒致弱的試劑，將不同稀釋度的桉液分別作用于錦鯉鰭條細(xì)胞系和在錦鯉鰭條細(xì)胞系復(fù)制的錦鯉皰疹病毒。結(jié)果表明，桉液濃度越高KF-1細(xì)胞增殖越困難。桉液濃度低于1∶400時(shí)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。當(dāng)桉液濃度在1∶400時(shí)，其病毒抑制率達(dá)到77.2%。用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5的Linear-regression分析直線(xiàn)回歸方程為，y=0.375x+6.264，R=0.971，P<0.05。說(shuō)明桉液的濃度與病毒抑制率間有相關(guān)直線(xiàn)關(guān)系。即藥物濃度越高，抑制病毒增殖的能力越強(qiáng)，其量效關(guān)系表現(xiàn)顯著。

錦鯉皰疹病毒 ； 錦鯉尾鰭細(xì)胞系 ； 桉液

錦鯉皰疹病毒病(Koiherpesvirusdisease，KHVD)，是嚴(yán)重威脅鯉和錦鯉養(yǎng)殖業(yè)安全的一種世界性疾病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須申報(bào)的疾病，我國(guó)將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病。病原隸屬于皰疹病毒目(Herpesvirales)異樣皰疹病毒科(Alloherpesviridae)鯉皰疹病毒屬(Cyprinivirus)成員[1]。KHV 傳染性強(qiáng)，該病目前尚無(wú)有效的治療方法。

接種疫苗可能是一種控制錦鯉皰疹病毒病發(fā)生的容易想到的辦法，臨床上用KHV 制備的滅活苗或者核酸疫苗以及亞單位疫苗效果都不能讓人滿(mǎn)意。還不能推向市場(chǎng)。而減毒苗已經(jīng)應(yīng)用于臨床，用來(lái)預(yù)防和控制本病，收到了比較好的免疫效果[2-3]。

細(xì)葉桉(EucalyptustereticornisSmith)為桃金娘科植物，栽培區(qū)主要分布在我國(guó)南方幾省。桉葉中含有大量的有效成分，這些物質(zhì)具有重要的生理活性[4]。桉葉油的主要化學(xué)成分為1，8-桉葉油素、α-崖柏烯、α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、對(duì)傘花烴、羅勒烯、異松油烯、α-水芹烯、α-松油烯、檸檬烯、β-石竹烯、香茅醛、橙花叔醇、芳樟醇、反式松香芹醇、松桉葉醇、α-桉葉醇等。研究表明，從桉葉中提取的桉葉油含有大量的抗氧化活性成分，這一功效可以對(duì)抗炎抗菌抗病毒起到很大作用[5]。1998 年許淑英等人[6]利用桉葉制備成桉液作用于草魚(yú)出血病病毒(GCHV)，其強(qiáng)毒株毒力逐漸減弱，但免疫原性沒(méi)有改變，變?yōu)槿醵局?，成功將GCRV 致弱。本試驗(yàn)采用細(xì)葉桉葉的提取液作為致弱病毒的試劑，以期獲得KHV致弱毒株。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞 錦鯉皰疹病毒吉林株(KHV-CJ)系由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存[7]；錦鯉鰭條細(xì)胞系(KF-1)由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存。

1.2 桉液 細(xì)葉桉樹(shù)葉：采自廣西省某山區(qū)樹(shù)林中。

制備桉液：將9月份采摘的細(xì)葉桉樹(shù)葉進(jìn)行清洗后，晾曬在室內(nèi)陰涼通風(fēng)處，晾干一段時(shí)間后制備桉液。稱(chēng)取100 g桉葉加入1 L超純水，煮沸10 min。用濾膜孔徑為0.45 μm的抽濾器將藥液進(jìn)行抽濾后補(bǔ)足蒸發(fā)的水分至1 L，得10%桉葉藥液即設(shè)定為桉液原液。121 ℃，30 min高壓滅菌，保存 4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑 新生牛血清、胰酶、EDTA、青霉素和鏈霉素、兩性霉素B、HEPES、二甲基亞砜(DMSO)、MTT、L-15細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.4 病毒培養(yǎng) 當(dāng)KF-1細(xì)胞長(zhǎng)到細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部80%～90%時(shí)，接種KHV，放置在26℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組細(xì)胞。

1.5 TCID50測(cè)定及MTT法測(cè)定不同桉液濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 病毒原液10倍比稀釋?zhuān)?xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)孔底大約75%～85%時(shí)接種病毒。設(shè)置設(shè)陰性對(duì)照組和空白細(xì)胞對(duì)照。按照Reed-Muench兩氏法計(jì)算TCID50的效價(jià)。

MTT測(cè)定法已廣泛應(yīng)用于在檢測(cè)細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性試驗(yàn)當(dāng)中。本試驗(yàn)將不同濃度桉液接種細(xì)胞觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)來(lái)確定桉液最佳稀釋濃度。

細(xì)胞長(zhǎng)成單層后加入含不同稀釋濃度的桉液的培養(yǎng)液(含桉液濃度分別為1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800)。96 h后，每孔加入含10 μL的MTT(5 mg/mL)的培養(yǎng)液，再持續(xù)培養(yǎng)4 h。由于桉液具有氧化還原性可與MTT溶液反應(yīng)，需先棄去培養(yǎng)液，然后用PBS緩沖液沖洗后加入含MTT的培養(yǎng)液。取出96孔板，每孔加入100 μL的DMSO，置于低速搖床上振蕩10 min，使紫色結(jié)晶體可完全溶解。在酶標(biāo)儀上測(cè)量OD490nm吸光值。根據(jù)下面公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率計(jì)算：細(xì)胞存活率%=(實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零組OD值)(對(duì)照組/OD值-調(diào)零組OD值)×100%。

1.6 不同桉液濃度對(duì)病毒復(fù)制的影響 KF-1長(zhǎng)滿(mǎn)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔底，接種100個(gè)TCID50的KHV病毒液，放置在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，棄去病毒液。按對(duì)細(xì)胞無(wú)毒桉液濃度(1∶400)，倍比稀釋5個(gè)稀釋濃度，每孔加不同稀釋濃度藥物的維持液100 μL，每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)重復(fù)孔，設(shè)置病毒對(duì)照孔、細(xì)胞對(duì)照孔。繼續(xù)培養(yǎng)并每天觀察細(xì)胞CPE，5 d后，待病毒孔CPE達(dá)到75%～85%時(shí)，分別向各孔中加入含10 μL的MTT(5 mg/mL)的培養(yǎng)液，孵育4 h，棄掉，每孔加入100 μL的DMSO，溶解振蕩，測(cè)OD值，即利用MTT法檢測(cè)KHV的抑制率。

病毒抑制率%=(實(shí)驗(yàn)組OD值-病毒對(duì)照組OD值)(細(xì)胞對(duì)照組/OD值-病毒對(duì)照組OD值)×100%。

2 結(jié)果

2.1 病毒培養(yǎng) KF-1細(xì)胞是成纖維樣細(xì)胞，貼壁呈梭形或橢圓形，形態(tài)飽滿(mǎn)，均勻單層的鋪在細(xì)胞瓶底部。接種KHV 6～7 d時(shí)發(fā)生典型病變。接種病毒后的細(xì)胞明顯收縮變圓，細(xì)胞間輪廓不清，崩解的細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞脫落，最典型的病變特點(diǎn)是細(xì)胞空泡化(見(jiàn)圖1)。

2.2 病毒效價(jià)及不同桉液濃度對(duì)KF-1細(xì)胞的增殖影響 按照Reed-Muench兩氏法[6]計(jì)算KHV的TCID50=10-6.59。

圖1 KHV接種在KF-1細(xì)胞上的CPE

A： 正常KF-1細(xì)胞 (×100)； B： 接種KHV病變的KF-1細(xì)胞 (×100)

桉液稀釋濃度分別為1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400作用于KF-1細(xì)胞，每24 h通過(guò)鏡下觀察，可以清楚的看出桉液濃度越高對(duì)細(xì)胞有明顯的毒性作用，細(xì)胞形態(tài)改變、脫落，折光性差，不能正常生長(zhǎng)。而桉液濃度低于1∶400時(shí)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響(見(jiàn)圖2)。由表1可看出，桉液濃度越高KF-1細(xì)胞增殖越困難。因此桉液濃度在1∶400為最高細(xì)胞安全生長(zhǎng)濃度。

ABC

DEF

不同桉液濃度下的細(xì)胞存活率/%1∶101∶501∶1001∶2001∶4001∶800存活率/%29.7137.8858.1683.98100.20103.93

表2 不同桉液濃度對(duì)KHV的抑制

2.3 不同桉液濃度對(duì)病毒復(fù)制的影響結(jié)果 將上述KHV 的病毒液(TCID50/0.1 mL=10-6.59)接種于96 孔板上，MTT 法檢測(cè)KHV 的抑制率。結(jié)果顯示，KHV 對(duì)照組細(xì)胞CPE 出現(xiàn)明顯。正常對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。加桉液的試驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)比病毒對(duì)照組細(xì)胞病變程度要小，仍是成纖維樣細(xì)胞，僅有少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)空洞。所以適當(dāng)濃度的桉液能抑制KHV 在KF-1 細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制增殖。當(dāng)桉液濃度達(dá)到1∶400 時(shí)，其病毒抑制率達(dá)到77.2%。用統(tǒng)計(jì)軟件SPSSll.5 的Linear-regression 分析直線(xiàn)回歸方程為，y=0.375x+6.264，R=0.971，P<0.05。說(shuō)明桉液的濃度與病毒抑制率間有相關(guān)直線(xiàn)關(guān)系。即藥物濃度越高，抑制病毒增殖的能力越強(qiáng)，其量效關(guān)系表現(xiàn)顯著。

3 討論

魚(yú)類(lèi)病毒性疾病一直是全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)未解決的難題之一。在濫用抗病毒藥物的今天，江河湖泊大多以被這些化學(xué)藥物污染，魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生抗藥性且毒副作用大，以至于疾病大規(guī)模暴發(fā)之后出現(xiàn)無(wú)藥可救的局面。這個(gè)對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)棘手的安全問(wèn)題日益成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。然而利用中草藥來(lái)治療病毒性疾病卻具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。中草藥屬于純植物藥物，本身毒性低，不能產(chǎn)生耐藥性還可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫抵抗力。近些年的一些實(shí)驗(yàn)研究表明，中草藥已經(jīng)被許多抗病毒藥物的研發(fā)應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。在我國(guó)中草藥種植或采集都很方便，產(chǎn)量豐富，價(jià)格低廉也是研究其抗病毒作用的優(yōu)勢(shì)之一。

由于中草藥組成成分復(fù)雜，因此多靶點(diǎn)作用機(jī)制才在抗病毒環(huán)節(jié)中起到有效作用。中草藥抗病毒機(jī)制大致有兩種途徑[8]：一是可直接殺滅病毒或是阻斷病毒復(fù)制過(guò)程中的環(huán)節(jié)，阻止病毒吸附的過(guò)程，抑制病毒增殖，并且保護(hù)侵入的宿主細(xì)胞免受損傷，從而達(dá)到殺滅病毒的目的。二是首先通過(guò)間接方法利用中草藥來(lái)增強(qiáng)機(jī)體免疫力，如細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能。這種方法更具有研究意義和更有效的殺滅病毒。細(xì)葉桉其葉供藥用，可抑制魚(yú)類(lèi)病毒的功效也隨即被發(fā)現(xiàn)。但藥物成分和藥用機(jī)理尚未明確，待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)同利用MTT 法對(duì)KF-1 細(xì)胞進(jìn)行存活率的檢測(cè)，采用鏡下觀察CPE 法對(duì)各種桉液稀釋濃度抗KHV 的效果進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，桉液濃度分別為1∶400 和1∶800 時(shí)作用于KF-1 細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)正常，細(xì)胞分裂明顯，而其他稀釋濃度細(xì)胞不能正常生長(zhǎng)，說(shuō)明該兩種稀釋濃度為作用于細(xì)胞的安全濃度。通過(guò)先感染病毒后孵育藥物的方法，利用MTT 試驗(yàn)計(jì)算其病毒抑制率，結(jié)果表明，將桉液各稀釋濃度對(duì)KHV 均有抑制作用，但桉液濃度為 1∶400 時(shí)的病毒抑制率更高。這與許淑英等人[6]利用細(xì)葉桉液將其GCRV 弱化得出的桉液減毒稀釋濃度上下有所波動(dòng)，一是可能作用的兩種病毒不同，導(dǎo)致作用機(jī)制不大相同。二是可能由于細(xì)葉桉的產(chǎn)地不同或是采摘桉葉的季節(jié)和月份不一致，導(dǎo)致其藥效也會(huì)略有不同。由本試驗(yàn)可推斷出，桉液濃度為1∶400 時(shí)對(duì)KF-1細(xì)胞毒性更小，抑制KHV增殖更明顯。

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Study on intracellular replication Eucalyptus Liquid Koi herpes virus cells

WANG Hao1， LIU Li-fan1， YU Dan2， WANG You-chao1， ZHOU Jing-xiang1

(1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Changchun Centers for Disease Control and Prevention，Changchun 130061，China)

The extract of Eucalyptus tereticornis Smith leaves was used as a reagent to attenuate virus in this experiment，The different dilutions of Eucalyptus were added to the tail KF-1 cell lines to see their effects on Koi herpesvirus replication.The results showed that the higher the concentration of Eucalyptus was used,the less virus prolifevation in KF-1 cells.Eucalyptus concentration less than 1∶400，had no significant effect on cell growth.When eucalyptus dilutiopn was 1∶400，viral suppression rate was 77.2%.Statistical software SPSSll.5 Linear-regression analysis of the linear regression equation showed that，y=0.375x+6.264，r=0.971，(p<0.05).indicating that the concenntration of Eucalyptus and viral suppression had a linear relationship.

Koi herpes virus ； KF-1 ； Eucalyptus liquid

ZHOU Jing-xiang

2015-07-24

長(zhǎng)春市科學(xué)技術(shù)局先進(jìn)實(shí)用技術(shù)的示范推廣項(xiàng)目(12XN35)

王好(1980-)，男，講師，博士，主要從事動(dòng)物病毒分子生物學(xué)方面研究，E-mail：wanghao199@126.com

周井祥，E-mail：zhjxnd@126.com

S941.41

A

0529-6005(2016)10-0017-03