吳玉輝 劉艷娟 渠巍 李宇紅 徐海霞 應蓓 邱杰 林俊 邵曉珊*

(1.貴州醫(yī)科大學研究生院，貴州 貴陽 550004；2.貴州省婦幼保健院檢驗科，貴州 貴陽550003； 3.貴州省婦幼保健院兒童腎臟免疫風濕科，貴州 貴陽 550003)

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·論 著·

Th17/Treg及其相關細胞因子在阿霉素腎病大鼠血清及腎組織中的表達水平及意義

吳玉輝1劉艷娟1渠巍2△李宇紅3徐海霞3應蓓3邱杰3林俊3邵曉珊3*

(1.貴州醫(yī)科大學研究生院，貴州 貴陽 550004；2.貴州省婦幼保健院檢驗科，貴州 貴陽550003； 3.貴州省婦幼保健院兒童腎臟免疫風濕科，貴州 貴陽 550003)

目的 探討阿霉素(ADM)腎病大鼠 Th17 相關的IL-17 和Treg相關的IL-10 表達水平及意義。方法 采用一次性尾靜脈注射阿霉素的方法制備大鼠ADM模型，對照組注射等量的生理鹽水，ADM組20只大鼠在造模后尿蛋白均達到50 mg/24 h 以上，表明造模成功，采用流式細胞術檢測外周血中 Th17細胞和Treg 細胞數(shù)量及比例；ELISA法檢測各組血清和腎組織中Th17 相關的IL-17 和 Treg相關IL-10 水平。結果 ADM模型組大鼠在第14天出現(xiàn)蛋白尿，隨著時間的推移，蛋白尿的量持續(xù)升高，在第56天達到峰值，各時間點(14，28，42，56 d)ADM組大鼠的蛋白尿水平明顯高于同時間的對照組(P<0.001);ADM組和對照組 Th17 細胞百分率分別為(3.13±0.09)%、(0.88±0.05)%，ADM組較對照組明顯升高(P<0.001) ；ADM組和對照組 Treg細胞百分率分別為(1.94±0.15)%、(5.02±0.15)% ，ADM組明顯低于對照組(P<0.001)；ADM組Th17/Treg細胞比例較對照組高(P<0.001),ADM組大鼠(14，28，42，56 d)的血清及腎組織 IL-17表達水平明顯高于對照組(P<0.001)；IL-10表達水平明顯低于對照組(P<0.001)。結論 Th17/Treg為主的免疫失衡在ADM發(fā)病中起重要作用，可通過抑制或中和內源性 IL-17 的表達和提升Treg的表達糾正失衡的 Th17/Treg，此方法可能成為兒童原發(fā)性腎病(PNS) 治療的新途徑之一。

Th17/Treg； IL-17； IL-10; 兒童原發(fā)性腎病

腎病綜合征的發(fā)病機制與全身免疫功能包括細胞免疫及體液免疫功能紊亂有關[1]。按病因可分為原發(fā)性、繼發(fā)性及先天性三種，原發(fā)性腎病綜合征(Primary nephrotic syndrome,PNS)占90%以上，是兒童時期常見的慢性腎小球疾病，在兒科腎臟病中占首位，是引起我國兒童腎功能衰竭的原發(fā)疾病，部分患兒在應用糖皮質激素和免疫抑制劑后可獲得緩解，但副作用大且復發(fā)率高。本研究采用一次性尾靜脈注射鹽酸阿霉素(ADM)的方法制備SD大鼠的腎病模型，流式細胞檢測外周血Th17及Treg細胞數(shù)量，并測定血清和腎組織中Th17 細胞相關的白細胞介素( IL-17) 和 Treg細胞相關的白介素(IL-10)水平，旨在初步探討ADM腎病大鼠相關的 Th17/Treg比例及其相關細胞因子IL-17 和IL-10 表達及意義，為臨床預防PNS提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 SD大鼠，雄性，體質量180～200 g，購于貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，隨機分為對照組( 20只) 和模型組( 20只) 。主要試劑及儀器：Anti-Rat CD3 FITC,Anti-Rat CD8a PE ,Anti-Rat IL-17A APC,Anti-Rat CD4 ECD,Anti-Rat CD25PE,Anti-Rat Foxp3 Percp cy5，APC同型對照單抗IgG1,Percp cy5同型對照IgG2 (美國EBI公司)，PMA、Monensin、ionomycin、固定液、破膜劑(聯(lián)科生物公司)，RPMI1640培養(yǎng)基( 美國 Gibco 公司),小牛血清(北京艾然生物科技有限公司公司),胰蛋白酶(美國 Gibco公司),大鼠IL-17和 IL-10 ELISA試劑盒(美國R&D生物公司),尿蛋白定量試劑盒(泰思騰生物)，PT3502PC酶標儀(北京普天)，F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 阿霉素腎病模型的建立 阿霉素用無菌生理鹽水稀釋成50%(W/V)的溶液，模型組大鼠一次性尾靜脈注射阿霉素溶液6.5 mg/kg,對照組注射等量生理鹽水，SPF級條件飼養(yǎng)，自由飲食和進水。

1.2.2 檢測指標及方法 (1)24 h尿蛋白檢測: 分別在注射阿霉素后第13，27，41，55天將兩組大鼠單獨喂養(yǎng)在代謝籠中，收集24 h尿液，尿標本離心后取上清，記錄24 h尿量; 采用鄰苯三酚紅鉬絡合法檢測尿蛋白定量。(2)流式細胞術檢測Th17細胞的百分率：實驗第56天將各組大鼠在乙醚麻醉下用肝素鈉抗凝管自股靜脈采血3 mL，取250 μL全血標本，用RPMI-1640培養(yǎng)基(不含胎牛血清-FBS)1∶1等體積稀釋至500 μL，標記測樣管和對照管，每管取250 μL稀釋液分別加入1 μL PMA(0.1 mg/mL)、5 μL Ionomycin (1 mg/mL)、1 μL Monensin(50 mg/mL)混勻后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，離心棄上清，加入1 mL紅細胞裂解液，室溫裂解5 min，離心棄上清，PBS重懸將細胞懸液轉移至1.5 mL EP管中，2 500 r/min離心5 min,棄上清，PBS洗兩次后加入1 μL Anti-Rat CD3 FITC(0.5 mg/mL), 1 μL Anti-Rat CD8a PE(0.2 mg/mL)室溫避光孵育30 min,PBS洗1次后棄上清，加入0.5 mL 固定液,室溫避光孵育 20 min，加入1 mL PBS清洗1次，1 000 r/min離心5 min棄上清，加入1 mL破膜劑室溫避光孵育20 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗1次后分別在測樣管中加入1 μL Anti-Rat IL-17A APC(0.2 mg/mL)及同型對照管中加入1 μL單抗APC-IgG1,4 ℃避光孵育30 min，PBS各洗1次，1 000 r/min離心5min棄上清，0.5 mL PBS重懸細胞,上流式細胞儀檢測CD3+CD8-IL-17+細胞數(shù)量。(3)流式細胞術檢測Treg細胞的百分率：取200 μL全血 ，標記測樣管和對照管，每管取100 μL全血，分別在每管中加入1 μL Anti-rat CD4 ECD、1 μL Anti-rat CD25 PE，室溫避光孵育30 min，1 000 r/min離心5 min棄上清，1 mL PBS 懸浮細胞，1 000 r/min離心5 min棄上清，加入1 mL紅細胞裂解液，室溫裂解5 min,1 000 r/min離心5 min棄上清，每管分別加入0.5 mL的Foxp3固定液混勻，室溫避光反應20 min，用1 mL PBS洗1次，1 000r/min 離心后棄上清，每管加入1 mL 破膜液重懸細胞，室溫避光孵育20 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗1次后分別加入1 μL Anti-rat Foxp3 Percp cy5(測樣管)，1 μL 同型對照單抗Percp cy-IgG2(對照管)，室溫避光孵育30 min，PBS各洗1次，1 000 r/min離心5 min棄上清，0.5 mL PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+細胞數(shù)量。(4)細胞因子測定: 實驗第14,28,42，56天將各組大鼠在乙醚麻醉下自股靜脈采血5 mL，室溫靜置20 min，4 ℃ 2 000 r/min離心15 min，分離血清。剖腹取腎，將腎組織勻漿后離心，取上清液3 mL，均置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，采?ELISA法測定血清和腎組織中 IL-17和 IL-10 的水平，具體方法參見 R&D公司產(chǎn)品說明書。

2 結 果

2.1 兩組大鼠24h尿蛋白變化 ADM組20只大鼠在造模后尿蛋白均達到50 mg/24 h 以上，表明造模成功。模型組大鼠在第14天出現(xiàn)蛋白尿，隨著時間的推移，蛋白尿的量持續(xù)升高，在第56天達到峰值，各時間點模型組大鼠的蛋白尿水平均明顯高于同時間的對照組大鼠，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表 1。

表1 兩組大鼠24h尿蛋白變化

2.2 Th17/Treg細胞數(shù)量及比例 對照組Th17(0.88±0.05)%,Treg(5.02±0.15) %, Th17/Treg(0.18±0.01);實驗組Th17(3.13±0.09) %,Treg(1.94±0.13) %, Th17/Treg(1.61±0.09)。和對照組相比，ADM組大鼠外周血Th17/Treg細胞數(shù)量均升高(P<0.001)， Treg細胞數(shù)量明顯降低(P<0.001)，Th17/Treg細胞比例增高(P<0.001)， 見圖1～2。

2.3 兩組大鼠血清 IL-17和IL-10 水平比較 ADM組大鼠第14，28，42，56天血清 IL-17水平明顯高于對照組 (P<0.001) ; 而IL-10水平明顯低于對照組 (P<0.001)，見表2。

表2 兩組大鼠血清IL-17和IL-10 水平

2.4 兩組大鼠腎組織IL-17和IL-10 水平比較 ADM大鼠第14,28,42，56天腎組織 IL-17水平明顯高于對照組(P<0.001);而IL-10明顯低于對照組 (P<0.001)，見表3。

表3 兩組大鼠腎組織IL-17和IL-10 水平比較

3 討 論

阿霉素是一種治療急性白血病和多種實體瘤的有效常用化療藥物, 目前已對其進行了較為廣泛的基礎和臨床實驗，突出性質是能夠誘發(fā)大鼠典型腎病綜合征表現(xiàn), 而且該腎病模型具有慢性進展性腎損害的特點, 早期腎組織大致正常, 中期腎小球上皮空泡變性，晚期節(jié)段性或全小球硬化,這與人類進行性腎臟疾病的表現(xiàn)過程非常類似,ADM 腎病模型為研究腎病蛋白尿、濾過屏障損害腎小球硬化機理等提供了比較理想的實驗條件, 現(xiàn)已成為研究腎臟病的重要工具。

研究[2]發(fā)現(xiàn)Th17細胞在自身免疫性疾病發(fā)病過程中起著重要作用,Th17細胞是新發(fā)現(xiàn)的一個不同于Th1和Th2細胞的T細胞亞群,Th17細胞參與調節(jié)和控制免疫應答,在自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用,IL-17是Th17細胞分泌的主要效應細胞因子,其受體分布于體內多種組織,是一種強大的前炎癥細胞因子,也是炎癥反應的微調因子,通過促進中性粒細胞和單核細胞聚集誘導細胞釋放前炎癥因子引起炎癥細胞浸潤和組織損傷,參與腎臟炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展,在宿主抗細菌感染免疫中發(fā)揮重要作用[3-4]。它在慢性炎癥疾病及自身免疫性疾病的發(fā)病機制中的作用也成為了研究熱點[5]。

Treg是具有顯著免疫抑制作用的CD4+T細胞亞群,由 CD4+T 細胞分化而來，Treg 表達Foxp3，通過接觸抑制及釋放抗炎因子 IL-10及 TGF-β，并通過多種途徑抑制細胞增殖、炎性因子和抗體的產(chǎn)生、抑制記憶T細胞的功能,還能誘導效應細胞的凋亡[6]，Th17細胞與Treg細胞在機體上處于動態(tài)平衡，相互拮抗和排斥，Th17促進炎癥反應和免疫反應，Treg抑制免疫應答，維持免疫耐受[7]。Th17和Treg的相互調控，使機體效應和抑制處于一種精細而復雜的平衡狀態(tài)，當機體發(fā)生異常時，Th17/Treg功能失衡引起一系列炎癥免疫反應損傷機體，研究[8]發(fā)現(xiàn) Th17/Treg的失衡預示炎癥性疾病惡化,本研究表明阿霉素腎病模型大鼠中Th17細胞的表達水平較對照組明顯升高(P<0.001)，Treg細胞的表達水平降低(P<0.001)， Th17/Treg比例增高(P<0.001)，阿霉素腎病模型大鼠血清和腎組織的IL-17表達水平較對照組明顯升高(P<0.001),IL-10表達水平較對照組降低(P<0.001)。綜上所述，我們通過對Th17和Treg細胞及其相關細胞因子的檢測,明確了Th17和Treg細胞表達情況，Th17/Treg 為主的免疫失衡在ADM 發(fā)病中起重要作用，但兩種相關免疫細胞在阿霉素腎病大鼠的失衡變化的具體機制還有待進一步研究，或可通過抑制或中和內源性 Th17 和提升 Treg 的表達糾正失衡的 Th17/Treg,有望為深入研究PNS的病因和發(fā)病機制提供理論依據(jù)，進而找到有效的治療方法，具有重要的基礎和臨床研究價值。

(本文圖1～2見封三)

[1] Fiser RT,Arnold WC,Charlton RK,et al. T-lymphocyte subsets in nephrotic syndrome[J]. Kidney Int,1991,40:913-916.

[2] Shao XS,Yang XQ,Zhao XD,et al.The prevalence of Th17 cells and POXP3 reguLate T cells(Treg) in children with primary nephrotic syndrome[J].Pediatr Nephrol,2009,24(9):1683-1690.

[3] 林佳如，楊滿，張曉燕，等.Th17 細胞與腎臟疾病關系的研究進展[J].國際泌尿系統(tǒng)雜志，2012,32(3)：415-418.

[4] Steinmetz OM,Summers SA,Gan PY,et al. The Th17-defining transcription factor RORγt promotes glomeruLonephritis[J].J Am Soc Nephrol,2011,22(3):472-483.

[5] Gaffen SL.Recent advances in the IL-17 cytokine family [J] .Curr Opin Immunol,2011,23(5):613-619.

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[7] Estelle B,Yijun C,Wenda G，et al.Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector Th17 and reguLatory T cells[J]. Nature,2006,44:1

[8] Favre D,Lederer S,kanwa B,et al.Critical loss of the balance between Th17 and T reguLatory cell popuLations in pathogenic SIV infection[J].ploS Pathog,2009,5(2):e1000295.

Significance and expression of variation of Peripheral Blood Th17/Treg cells and cytokines in Sprague Dawley rat induced by adriomycine

WuYuhui1,LiuYanjuan1,QuWei2,LiYuhong3,XuHaixia3,YingPei3,QiuJie3,LinJun3,ShaoXiaoshan3.

1.TheGraduatedSchoolofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China. 2.DepartmentofClinicalLaboratory,GuiyangMaternal&ChildHealthCareHospital,Guiyang550003,China. 3.DepartmentofNephrologyofImmunization,GuiyangMaternal&ChildHealthCareHospital,Guiyang550003,China.

Objective To investigate the variation of Th17/Treg cells in Peripheral Blood and related cytokines (IL-17/IL-10) in Sprague Dawley (SD) rat induced by adriomycine (ADM). Methods SD rats were randomly grouped in vehicle control (n=20) and ADM model (n=20), Model group were injected with ADM via tail vein (6.5 mg/kg/body weight) , while control group were injected same amount of normal saline(NS). Peripheral blood (PBL) and Renal tissue were collected after injection at different time points (14, 28, 42, 56 d). Th17 and Treg cell numbers in PBL were analyzed by flow cytometry . Enzyme linked immunosorbant assay (ELISA) were performed for detection of IL-17 and IL-10 in both PBL and renal tissue. Results ADM model were successfully established for further investigation. Biochemical results indicate the level of proteinuria were increased in ADM model in comparison with vehicle control after 14 days of injection(P<0.001), which reached peak levels after 56 days . Flow cytometric staining reveals CD4+CD8-IL-17+were higher in ADM (3.13±0.09)% compared to control (0.88±0.05)%, whereas CD4+CD25+Foxp3+cells were lower in ADM (1.94±0.13)% compared to control (5.02±0.15)% (P<0.001). Further, ELISA show IL-17 in serum and renal tissues were significantly higher in ADM compared to control (P<0.001), while IL-10 were observed lower compared to control (P<0.001). Conclusion Th17/Treg immune cells play a significant role in the pathogenesis of ADM ,which suggests it may be rectified vianeither inhibit or neutralize the expression of IL-17 and enhance Treg cells of expression. Possibly, the research above all may provide one of novel methods for treatment of primary nephrotic syndrome (PNS).

Th17/Treg； IL-17； IL-10； PNS

國家自然科學基金項目(項目編號： NS2014-11)

R726.9

A

1000-744X(2016)09-0899-03

2016-06-10)

△*通信作者，△E-mail：doctor_quweichina@126.com;*E-mail:sxs22@sina.com