劉丹薇 潘衛(wèi) 徐國(guó)賓 楊國(guó)珍△

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院生化學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100142)

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S1P致環(huán)磷酰胺染毒后雄性小鼠凋亡蛋白表達(dá)的影響

劉丹薇1潘衛(wèi)1徐國(guó)賓2楊國(guó)珍1△

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院生化學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100142)

目的 探討1-磷酸鞘氨醇(S1P)對(duì)雄性小鼠生殖細(xì)胞毒性損害的拮抗機(jī)制。方法 健康雄性昆明小鼠40只，隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組；S1P低劑量(0.5 μg/10 g小鼠體質(zhì)量)、中劑量(1.0 μg/10 g小鼠體質(zhì)量)、高劑量(2.0 μg/10 g小鼠體質(zhì)量)組；環(huán)磷酰胺染毒組。腹腔注射給藥5 d，于首次給藥后30 d處死。分別采集睪丸樣本，小鼠睪丸病理切片觀察睪丸組織的病理學(xué)改變，免疫組化檢測(cè)小鼠睪丸凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)。 結(jié)果 與環(huán)磷酰胺染毒組相比：各S1P劑量組病理學(xué)結(jié)構(gòu)均有不同程度的改善， Bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)減弱。經(jīng)圖像分析軟件分析后得出平均光密度值，各實(shí)驗(yàn)組與染毒組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。結(jié)論 S1P對(duì)雄性小鼠生殖細(xì)胞毒性損害具有一定的拮抗作用，可能通過(guò)活化Bcl-2和抑制Bax，抑制下游Caspase-3的表達(dá)來(lái)拮抗環(huán)磷酰胺所致的生殖毒性。

1-磷酸鞘氨醇； 雄性小鼠； 生殖毒性； 凋亡

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查，當(dāng)今社會(huì)大約有10%～15%的育齡夫婦不能夠自然生育，且該比例仍在不斷上升，其中1/2以上的不育癥發(fā)生原因與男性密切相關(guān)。在過(guò)去近50年里，全球男性精液質(zhì)量下降十分顯著[1]。而在國(guó)內(nèi)，形勢(shì)同樣不容樂(lè)觀，據(jù)調(diào)查，過(guò)去25年間國(guó)內(nèi)育齡男性精液質(zhì)量分析報(bào)告顯示，精子數(shù)量和精子活力均呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)[2]。根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)，1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-Phosphate，S1P)可以抑制環(huán)磷酰胺致雄性小鼠生殖毒性的損害。故本研究利用S1P對(duì)環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的生殖毒性進(jìn)行拮抗，希望能闡明在環(huán)磷酰胺作用后S1P作為拮抗劑對(duì)于雄性小鼠生殖細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響，初步揭示S1P拮抗雄性生殖細(xì)胞毒性損害作用的機(jī)制。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 主要試劑與儀器 環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，S1P(美國(guó)Sigma公司)，Caspase-3，Bax，Bcl-2一抗(美國(guó)Cell Signaling公司)，一抗稀釋液(北京索萊寶科技有限公司)，免疫組化二抗(武漢博士德生物工程有限公司)，DAB顯色系統(tǒng)(北京中杉有限公司)，蘇木素(北京中杉金橋生物有限公司)，電子精密天平(JJ500，常熟雙杰測(cè)試儀器)，光學(xué)顯微鏡(NIKON YS100，日本尼康公司)，電熱恒溫水浴箱(北京市光明醫(yī)療儀器廠)。

1．1．2 動(dòng)物 本次實(shí)驗(yàn)選擇SPF級(jí)成熟昆明種雄性小鼠40只，體質(zhì)量25～35 g，動(dòng)物由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(黔)2012-0001。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 動(dòng)物分組與染毒 將雄性小鼠隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為正常對(duì)照組；S1P低、中、高劑量拮抗組(0.5，1.0，2.0 μg/10 g小鼠體質(zhì)量)；環(huán)磷酰胺染毒組。正常對(duì)照組按0.1 mL/10 g體質(zhì)量給予生理鹽水；S1P低、中、高劑量拮抗組在給予環(huán)磷酰胺后間隔2 h再給予各劑量S1P；染毒組給予環(huán)磷酰胺40 mg/kg，連續(xù)腹腔注射給藥5 d，染毒期間小鼠自由飲食飲水。

1．2．2 取材及標(biāo)本制作 各組于給藥結(jié)束后第30天，頸椎脫臼處死小鼠后立即打開(kāi)腹腔，取出雙側(cè)睪丸；睪丸置于10% 甲醛固定，用于檢測(cè)病理學(xué)變化及相關(guān)凋亡蛋白。

1．2．3 睪丸組織HE染色切片觀察和生殖細(xì)胞凋亡蛋白檢測(cè) 取各組每只小鼠睪丸組織切片做HE染色，觀察睪丸組織學(xué)變化；取另一張組織切片檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白，具體操作按免疫組化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。光鏡下，細(xì)胞漿或細(xì)胞膜呈棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，每張切片選取隨機(jī)5個(gè)高倍視野拍攝，圖像輸入IPP圖像分析系統(tǒng)，得出平均光密度值。

2 結(jié) 果

2.1 S1P對(duì)小鼠睪丸組織病理學(xué)的影響 如圖1所示，正常對(duì)照組小鼠睪丸曲精小管完整，排列密集整齊，生精上皮厚，生殖細(xì)胞層次和數(shù)量多，可見(jiàn)精原細(xì)胞和不同發(fā)育階段的精子，各級(jí)細(xì)胞排列精密，層次分明(圖1A)。染毒組睪丸生精小管直徑縮小，間距增寬，生精上皮變薄，管腔中生殖細(xì)胞數(shù)量減少，生精細(xì)胞排列紊亂、疏松，層數(shù)減少(圖1B)。S1P各劑量拮抗組形態(tài)結(jié)構(gòu)隨拮抗劑量的增加，損傷程度逐漸減輕：低劑量組損傷明顯，與染毒組相比差異不大(圖1C)；中劑量組損傷明顯輕于染毒組(圖1D)；高劑量拮抗組損傷已經(jīng)不明顯，與正常對(duì)照組相比差異不大(圖1E)。

注：A.正常對(duì)照組；B.環(huán)磷酰胺染毒組；C.S1P低劑量組；D.S1P中劑量組；E.S1P高劑量組。圖1 睪丸組織HE染色(×400)

2.2 S1P對(duì)小鼠生殖細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響 應(yīng)用Image ProPlus圖像分析系統(tǒng)測(cè)得Bcl-2、Bax、Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值，Bcl-2：陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物呈棕黃色，主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。隨拮抗劑量增加，陽(yáng)性表達(dá)逐漸增強(qiáng)(光密度值增加)(圖2 A1-E1)，S1P中、高劑量組與染毒組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，S1P高劑量組與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Bax：陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物呈棕黃色，主要位于細(xì)胞質(zhì)。隨拮抗劑量增加，陽(yáng)性表達(dá)逐漸減弱(光密度值減小)(圖2 A2-E2)，S1P低、中、高劑量組與染毒組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，S1P高劑量組與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Caspase-3：陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物呈棕黃色，主要位于細(xì)胞質(zhì)。S1P拮抗組陽(yáng)性表達(dá)隨拮抗劑量增加改變不明顯(圖2 A3-E3)，S1P低、中、高劑量組與染毒組相比陽(yáng)性表達(dá)減弱(光密度值減小)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1，圖2。

表1 S1P對(duì)各組實(shí)驗(yàn)小鼠凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)的影響

3 討 論

細(xì)胞的死亡是多細(xì)胞生物整個(gè)生命過(guò)程中十分重要的環(huán)節(jié)，可及時(shí)清除機(jī)體內(nèi)的衰老細(xì)胞和受損傷細(xì)胞，對(duì)各組織器官的發(fā)育及免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定發(fā)揮重要作用[3]。細(xì)胞凋亡是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞死亡的重要途徑。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)線(xiàn)粒體通路在細(xì)胞凋亡機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)部凋亡刺激因子作用，如DNA損傷、細(xì)胞缺氧、癌基因活化、生長(zhǎng)因子缺失等，可激活細(xì)胞內(nèi)部線(xiàn)粒體凋亡途徑，引起細(xì)胞凋亡。在眾多的凋亡調(diào)控基因中，Bcl-2和Bax同屬于Bcl-2家族蛋白，Bcl-2是目前已知的在凋亡調(diào)控過(guò)程中最重要的抗凋亡蛋白，同時(shí)含有BH1～BH4 四個(gè)同源結(jié)構(gòu)域，其中BH4 是抗凋亡蛋白所特有的結(jié)構(gòu)域，決定著抑制細(xì)胞凋亡功能的存在[4]。Bcl-2能定位在線(xiàn)粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核外膜上, 對(duì)保持膜的完整性至關(guān)重要。Bax蛋白則一般會(huì)以非活性單體形式分布于胞質(zhì)中，當(dāng)其在接收到凋亡信號(hào)刺激后，該蛋白被激活，從而發(fā)生一系列分子構(gòu)象改變，插入線(xiàn)粒體外膜后形成Bax大孔道，從而導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜的完整性被破壞，致使線(xiàn)粒體內(nèi)部一些蛋白以及細(xì)胞色素C等得以通過(guò)線(xiàn)粒體膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[5]，在dATP 存在下細(xì)胞色素C能通過(guò)半胱氨酸蛋白酶作用域與Apaf-1 結(jié)合形成凋亡體，并吸引Procaspase-9 在凋亡體上進(jìn)行寡聚，進(jìn)一步激活蛋白Caspase-3，啟動(dòng)Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)[6]。Caspase-3屬于Caspase 蛋白家族中的凋亡效應(yīng)亞類(lèi)蛋白，位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，被稱(chēng)為“死亡執(zhí)行蛋白酶”[7]。通常情況下，細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3是以無(wú)活性的單鏈酶原形式存在，只有在相關(guān)因子作用下，該類(lèi)蛋白酶在受到相關(guān)起始凋亡蛋白酶的切割后被激活，活化后相應(yīng)的凋亡蛋白酶可以對(duì)維持細(xì)胞骨架以及生命活動(dòng)所必須的蛋白逐一進(jìn)行裂解[8]，導(dǎo)致DNA損傷斷裂，細(xì)胞骨架的破壞，最終引起細(xì)胞死亡。目前已經(jīng)證明，Caspase-3的激活在很大程度上依賴(lài)于上游細(xì)胞色素C的釋放。

通常情況下Bax和Bcl-2兩種蛋白的表達(dá)量是穩(wěn)定而平衡的，而當(dāng)Bcl-2高表達(dá)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Bax/Bax二聚體會(huì)大量解離，生成更為穩(wěn)定的Bcl-2/Bax二聚體，該二聚體可以對(duì)抗其誘導(dǎo)凋亡的作用，使細(xì)胞存活期延長(zhǎng)[9]。反之，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax過(guò)量表達(dá)時(shí)，Bax/Bax同源二聚體的數(shù)量則會(huì)明顯增多，該類(lèi)二聚體會(huì)使細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)的反應(yīng)性增強(qiáng)，啟動(dòng)凋亡。因此，目前認(rèn)為Bax能與抑制凋亡的Bcl-2蛋白對(duì)抗，阻止其抗凋亡作用的發(fā)揮，細(xì)胞內(nèi)這兩種對(duì)立蛋白間的比率關(guān)系是決定細(xì)胞存亡的關(guān)鍵[10]。本次研究結(jié)果顯示，Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)隨S1P劑量增加逐漸增強(qiáng)，Bax陽(yáng)性表達(dá)隨S1P劑量增加逐漸減弱，表明S1P可能通過(guò)誘導(dǎo)活化Bcl-2以及抑制Bax激活來(lái)抵抗環(huán)磷酰胺造成的凋亡作用，使細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，從而減少生殖細(xì)胞的死亡，對(duì)機(jī)體組織起到一定的修復(fù)作用。

細(xì)胞色素C是線(xiàn)粒體電子傳遞鏈上的一個(gè)重要組成部分，凋亡啟動(dòng)的關(guān)鍵步驟是細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體釋放[11]。Caspase-3的激活在很大程度上就依賴(lài)于細(xì)胞色素C的釋放。Bcl-2、Bax是線(xiàn)粒體膜的通透性改變的重要調(diào)控因素，它們位于線(xiàn)粒體上游，Bcl-2過(guò)度表達(dá)以及Bax的表達(dá)被抑制，這兩種情況皆能抑制Bax的轉(zhuǎn)位及二聚體化，使得 Bax大孔道關(guān)閉，控制細(xì)胞色素C的釋放。另一方面，研究[12]發(fā)現(xiàn)Bcl-2的過(guò)度表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核谷胱甘肽積聚，從而令核內(nèi)氧化還原平衡發(fā)生改變，阻止胞內(nèi)Ca2+流動(dòng)，抑制線(xiàn)粒體膜釋放細(xì)胞色素C，最終抑制Caspase-3 的活化。Bcl-2也可作用在細(xì)胞色素C下游, 通過(guò)與細(xì)胞色素C結(jié)合, 將其從細(xì)胞漿池內(nèi)轉(zhuǎn)移出去而抑制Caspases-3的活化。Bcl-2還可直接作用于類(lèi)CED-4 分子，抑制下游Caspase-3 蛋白酶的活化。Caspase-3蛋白在本次研究中發(fā)現(xiàn)S1P劑量組的陽(yáng)性表達(dá)均與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異，但與環(huán)磷酰胺染毒組相比均有差異。這一結(jié)果與上述Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)并不矛盾，根據(jù)上述Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)結(jié)果可知，S1P誘導(dǎo)了Bcl-2蛋白的表達(dá)增加，抑制了Bax蛋白的表達(dá)，故可推測(cè)細(xì)胞色素C的釋放或與Caspase-3蛋白的結(jié)合受到抑制，致使Caspase-3蛋白的活化被抑制，蛋白表達(dá)不產(chǎn)生明顯變化。而為何各S1P實(shí)驗(yàn)組所加S1P劑量不同， Caspase-3的蛋白表達(dá)卻與正常對(duì)照組相比均未有明顯差異，推測(cè)可能原因是各S1P實(shí)驗(yàn)組S1P都使Bcl-2蛋白的表達(dá)上調(diào)，下游Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)被阻斷，各組Caspase-3皆呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，受本次研究方法的靈敏度所限，已經(jīng)檢測(cè)不出各實(shí)驗(yàn)組組間的明顯差異；各S1P實(shí)驗(yàn)組Caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)與環(huán)磷酰胺染毒組相比均有差異，則與上述相關(guān)Bcl-2蛋白作用的推論吻合。

綜上，S1P對(duì)雄性小鼠的生殖毒性損傷有一定的拮抗作用，S1P能改善因環(huán)磷酰胺所致的睪丸組織結(jié)構(gòu)的病理改變，進(jìn)一步增加精子數(shù)量，提高精子的質(zhì)量；并且，S1P可能通過(guò)下調(diào)Bax蛋白和上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Caspases-3的活化，從而使生殖細(xì)胞增殖。而S1P作用的具體通路位點(diǎn)以及與其他系統(tǒng)的關(guān)聯(lián)性，仍有待進(jìn)一步研究。

(本文圖2見(jiàn)封三)

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Effects of S1P on the apoptins of male mice against the toxicity of cyclophosphamide

LiuDanwei1,PanWei1,XuGuobing2,YangGuozhen1.

1.DepartmentofMedicalLaboratory，GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China. 2.DepartmentofMedicalLaboratory,BeijingUniversityCancerHospital，Beijing100142,China.

Objective To study the protective effects of S1P on male mouse reproductive cells by toxicity damage. Methods Forty healthy male Kunming mice were randomly divided into 5 groups (the physiological saline negative control group，the low，middle and high dose group of S1P(0.5, 1.0, 2.0 μg/10 g)，the cyclophosphamide positive control group). Mice in each group were given intraperitoneal injection for 5 days. The mice were killed at the thirtieth day after the first treatment. Testis of the mice was collected and observed pathologic changes of testis by pathological section. And was detected Bcl-2, Bax, Caspase-3 expression by immunehistochemical staining. Results Compared with the positive control group，there were statistical significantly differences in the pathologic changes. The expression of Bcl-2 was improved and the expression of Bax，Caspase-3 were opposite (P<0.05). Conclusion There were some protective effects of S1P on male mouse reproductive cells by toxicity damage. Maybe the mechanism is S1P can inhibit apoptosis protein Bax and excited Bcl-2 to reduce the damage by toxicity.

S1P ； Male mice； Reproductive toxicity； Apoptosis

R114

A

1000-744X(2016)09-0916-03

2016-05-07)

△通信作者，E-mail：yangguozhen-kong@hotmail.com