張 曉, 單鑫迪, 趙小亮, 李國(guó)云, 王小江, 蔡 超, 郝杰杰, 于廣利

(山東省糖科學(xué)與糖工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院, 青島 266003)

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低抗凝肝素寡糖的制備、結(jié)構(gòu)表征及免疫活性評(píng)價(jià)

張 曉, 單鑫迪, 趙小亮, 李國(guó)云, 王小江, 蔡 超, 郝杰杰, 于廣利

(山東省糖科學(xué)與糖工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院, 青島 266003)

以豬腸黏膜來(lái)源低抗凝肝素為原料, 采用芐酯堿水解法制備了寡糖. 通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、 高效凝膠滲透色譜(HPGPC)-多角激光光散射法(MALLs)聯(lián)用、 核磁共振波譜(NMR)和液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)所制備寡糖的分子量分布及化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征. 以該寡糖對(duì)活化X因子(FXa)及人凝血酶(FⅡa)活性的抑制作用評(píng)價(jià)了其抗凝血活性, 并通過(guò)測(cè)定其對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞吞噬能力及NO釋放量的影響評(píng)價(jià)其免疫活性. 結(jié)果表明, 所制備寡糖的聚合度分布于2～22之間, 平均分子質(zhì)量為5300, 無(wú)明顯的抗凝血活性, 但具有顯著的免疫增強(qiáng)活性.

低抗凝肝素寡糖; 芐酯堿水解; 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用; 免疫增強(qiáng)活性

藥用級(jí)肝素除了具有抗凝血作用外, 還具有調(diào)整血脂濃度、 抗炎及抗過(guò)敏等多種功能[1,2]. 由于肝素臨床應(yīng)用時(shí)存在導(dǎo)致出血、 血小板減少、 高鉀血癥及骨質(zhì)疏松等副作用, 使其在抗炎、 降血脂等方面的臨床應(yīng)用受到限制. 依諾肝素鈉是采用芐酯堿水解法制備的一種低分子肝素的鈉鹽, 與普通肝素鈉相比, 依諾肝素鈉具有臨床適應(yīng)癥廣、 生物利用度高、 半衰期長(zhǎng)和副作用較小等優(yōu)點(diǎn)[3], 但仍存在出血等風(fēng)險(xiǎn)[4,5]. 低抗凝肝素因具有不與血小板因子-4(PF-4)結(jié)合, 甚至可在肝素活化PF-4的濃度下抑制血小板的活化[6]等優(yōu)點(diǎn), 從而成為研究熱點(diǎn).

目前, 研究最多的低抗凝肝素有2類: 一類是部分脫去硫酸基, 尤其是脫去2-O-和3-O-硫酸基團(tuán)的肝素(PDH)[7]; 另一類是經(jīng)高碘酸鹽氧化獲得的肝素(POH)[8]. 對(duì)這2類低抗凝肝素的研究主要集中于增強(qiáng)免疫及抗炎活性方面. PDH能顯著減弱蛋白酶活化受體1(PQT-1)被凝血酶活化, 故可預(yù)防如急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征等疾病中由凝血酶引起的人肺內(nèi)皮細(xì)胞滲透率增加、 RhoA活化及細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加等不良反應(yīng)[7,9]. POH能干擾細(xì)胞聚集與黏附, 已作為抗惡性瘧疾的輔助治療藥物通過(guò)了Ⅰ期臨床評(píng)估[10,11].

本文從豬腸黏膜粗品肝素中分離得到一種低抗凝肝素, 采用芐酯堿水解法(β-消除法)制備了低抗凝肝素寡糖, 運(yùn)用色譜、 波譜和質(zhì)譜等技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征; 并進(jìn)一步對(duì)其抗凝血和免疫活性進(jìn)行了評(píng)價(jià), 以期為天然低抗凝肝素及其寡糖的開(kāi)發(fā)利用提供參考.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

低抗凝肝素(LAH), 來(lái)源于豬小腸黏膜肝素加工廢棄物, 經(jīng)鹽酸酸沉、 強(qiáng)陰離子交換色譜分離及軟骨素酶ABC處理純化制得, 抗凝效價(jià)為25 U/mg, 重均分子量為10200, 平均每個(gè)二糖單元包含2.11個(gè)硫酸基; USP依諾肝素鈉(ES)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品(抗Xa效價(jià)為160 U/mg, 抗Ⅱa效價(jià)為49 U/mg)、 豬小腸黏膜來(lái)源硫酸乙酰肝素(HS, 11 U/mg)、 肝素(HP, 180 U/mg)、 脂多糖(LPS)和阿利新藍(lán)8GX(美國(guó)Sigma公司); 乙腈(德國(guó)Merck公司); 醋酸銨(色譜級(jí), 美國(guó)Sigma公司); 肝素酶Ⅱ(5 U/μL, 北京思清源生物科技有限公司); 抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)、 活化X因子(FXa)、 人凝血酶(FⅡa)、 發(fā)色底物S-2765和S-2238(法國(guó)Hyphen biomed公司); DMEM高糖培養(yǎng)基、 胎牛血清(FBS)和胰酶-EDTA(2.5 g/L, 美國(guó)Gibco公司); 其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

Sephadex G10型凝膠色譜填料(美國(guó)GE Health公司); Shodex Ohpak SB HQ 802.5/804型色譜柱(8.0 mm×300 mm, 6 μm, 日本昭和電工株式會(huì)社); Luna HILIC 色譜柱(2.0 mm×150 mm和2.0 mm×50 mm, 20 nm, 美國(guó)Phenomenex公司).

3000Xi型電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司); Elx808型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司); BIO-CAPT200M凝膠分析系統(tǒng)(美國(guó)SIM公司); Agilent1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司); DAWN HELEOSⅡ型多角激光光散射儀、 WTREX Optilab T-rEX型DNDC示差折射儀(美國(guó)Wyatt公司); Bruker AVANCE Ⅲ 600型核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司); LTQ Obitrap XL質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 低抗凝肝素寡糖的芐酯堿降解法制備 取低抗凝肝素30 mg溶于2 mL H2O中, 緩慢加入150 μL芐索氯銨溶液(150 mg/mL), 攪拌1 h后靜置, 離心, 沉淀真空干燥得低抗凝肝素-芐索氯銨鹽. 將低抗凝肝素-芐索氯銨鹽溶于1 mL二氯甲烷中, 緩慢加入20 μL氯化芐, 于37 ℃攪拌24 h后, 加入4倍體積的100 g/L乙酸鈉的甲醇溶液, 靜置30 min后離心, 將沉淀溶于100 g/L NaCl水溶液中, 加入4倍體積甲醇, 離心收集沉淀, 經(jīng)真空干燥得低抗凝肝素芐酯. 將低抗凝肝素芐酯配制成50 mg/mL的水溶液, 加入100 μL NaOH溶液(0.6 mol/L), 于60 ℃攪拌反應(yīng)1.5 h后, 用鹽酸(1 mol/L)調(diào)節(jié)pH至6.5, 加入4倍體積的乙醇, 沉淀溶解后經(jīng)Sephadex G10柱脫鹽, 冷凍干燥得到低抗凝肝素寡糖BE-LAH.

1.2.2 分子量測(cè)定及分子量分布分析 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析寡糖聚合度[12]: 分離膠濃度為50 g/L , 濃縮膠濃度為220 g/L ; 100 V預(yù)電泳10 min, 200 V電泳1.5 h; 2 g/L阿利新藍(lán)染色液染色15 min, 20 g/L醋酸溶液洗滌至底色無(wú)色.

采用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)-多角激光光散射儀(MALLs)聯(lián)用法測(cè)定BE-LAH的分子量及其分子量分布[13]: 將HQ SB804色譜柱與HQ SB802.5色譜柱串聯(lián), 示差檢測(cè)器與多角激光光散射儀串聯(lián)進(jìn)行在線檢測(cè); 用Astra 5.3.4.20工作軟件計(jì)算分子量及其分布.

1.3 BE-LAH的寡糖組成分析

采用親水作用色譜-傅里葉變換質(zhì)譜聯(lián)用儀(HILIC-FTMS)分析經(jīng)肝素酶Ⅱ徹底降解得到的寡糖混合物[14]. Luna HILIC色譜柱(2.0 mm×150 mm, 20 nm); 流動(dòng)相A為醋酸銨(5 mmol/L)水溶液, 流動(dòng)相B為醋酸銨(5 mmol/L)乙腈(體積分?jǐn)?shù)98%)水溶液; 洗脫程序: 8%～40%A(體積分?jǐn)?shù)), 0～58 min; 流速150 μL/min. 所得數(shù)據(jù)經(jīng)去卷積化軟件Decon2LS自動(dòng)分析后, 通過(guò)GlycResoft分析進(jìn)行匹配歸屬及定量[15], 對(duì)歸屬后寡糖的豐度進(jìn)行歸一化處理.

1.4 3-O-硫酸基四糖的HILIC-FTMS分析

將400 μg樣品溶于90 μL酶解緩沖液(0.05 mol/L乙酸銨+2 mmol/L氯化鈣)中, 加入80 mU的肝素酶Ⅱ, 混勻后于35 ℃反應(yīng)10 h, 徹底酶解釋放3-O-硫酸基四糖. 于100 ℃加熱將酶滅活, 離心取上層清液. 采用HILIC-FTMS分析經(jīng)肝素酶Ⅱ徹底降解得到的寡糖組分[16]. Luna HILIC色譜柱(2.0 mm×50 mm, 20 nm); 流動(dòng)相、 檢測(cè)器和質(zhì)譜條件同1.3節(jié); 洗脫程序: 8%～22%A(體積分?jǐn)?shù)), 0～17 min; 22%～40%A, 17～25 min; 70%A, 25.01～30 min; 流速: 150 μL/min.

1.5 核磁共振波譜(NMR)分析

取50 mg BE-LAH溶于500 μL重水(D2O)中, 減壓真空濃縮重水交換3次, 用500 μL 重水溶解后轉(zhuǎn)移至核磁管中, 以氘代丙酮為內(nèi)標(biāo), 在25 ℃下進(jìn)行1H NMR,13C NMR和1H-13C HSQC分析.

1.6 活性評(píng)價(jià)

1.6.1 抗凝活性評(píng)價(jià) 按照AG00-01試劑盒(法國(guó)Hyphen biomed公司)所示步驟測(cè)定各樣品對(duì)FXa和FⅡa活性的抑制作用[17]. 將20 μL抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)[18]和20 μL樣品溶液于37 ℃孵育1 min; 加入40 μL FXa或FⅡa, 于37 ℃孵育1 min; 再加入100 μL FXa或FⅡa的底物, 于37 ℃孵育4 min; 最后加入100 μL終止液, 于405 nm測(cè)定吸光值. Anti-Xa與Anti-Ⅱa活性根據(jù)不同濃度的美國(guó)藥典肝素標(biāo)準(zhǔn)品(0～1 U/mL)平行實(shí)驗(yàn)曲線計(jì)算得到.

1.6.2 免疫活性評(píng)價(jià) 將RAW264.7細(xì)胞于37 ℃解凍后, 加入適量的培養(yǎng)液并搖勻, 置于37 ℃, 5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 用2.5 g/L胰酶消化傳代.

采用中性紅法測(cè)定樣品作用于RAW264.7細(xì)胞后對(duì)其吞噬能力的影響[19]. 用不同濃度的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品培養(yǎng)細(xì)胞24 h后, 將培養(yǎng)液吸出, 向各孔中加入中性紅染色液進(jìn)行染色, 搖勻后繼續(xù)培養(yǎng)30 min, 將中性紅染色液吸出, 加入PBS緩沖溶液清洗至無(wú)中性紅染色液殘留. 加入細(xì)胞裂解液[V(乙醇)∶V(冰醋酸)=1∶1], 搖勻后于540 nm測(cè)定吸光值, 計(jì)算公式如下:

采用S0021試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)樣品作用于RAW264.7細(xì)胞后NO釋放量的改變. 用不同濃度的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品培養(yǎng)細(xì)胞24 h, 取出50 μL上層清液置于另一96孔板, 每孔依次加入50 μL Griess Reagent Ⅰ及等量Griess Reagent Ⅱ, 于540 nm測(cè)定吸光值. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計(jì)算NO釋放量.

2 結(jié)果與討論

2.1 分子量及分子量分布分析

通過(guò)芐酯堿降解LAH制得25 mg低抗凝肝素寡糖BE-LAH, 收率為83.3%. 以ES及肝素四糖標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照, 用PAGE分析寡糖混合物的聚合度范圍. 結(jié)果表明, BE-LAH與ES的電泳行為相似, 含有系列分布均勻的寡糖, 聚合度(dp)為2～22, 且以dp 3～18為主, 表明LAH經(jīng)芐酯堿降解程度適中, 降解條件適合寡糖的制備.

Fig.1 Determination of molecular weight and its distribution of BE-LAH by HPGPC-MALLs

經(jīng)DNDC示差折射儀測(cè)得BE-LAH的dn/dc值為0.125. 采用HPGPC-MALLs法測(cè)得的BE-LAH分子量結(jié)果如圖1所示. 激光與示差檢測(cè)信號(hào)一致性好且峰形對(duì)稱, 分布范圍窄, 表明不含雜質(zhì)且分子量分布集中. 平均分子量為5300, 其中Mw<2000, 20008000的組分所占比例依次為16.8%, 81.6%和1.6%, 表明分子量分布主要集中在2000～8000, 并且符合美國(guó)藥典(USP)第35版中對(duì)依諾肝素鈉分子量分布的規(guī)定(Mw<2000的組分比例為12%～20%,Mw>8000的組分所占比例應(yīng)小于18%, 分子量介于二者之間的組分所占比例為68%～82%).

2.2 BE-LAH的寡糖組成

由HILIC-FTMS分析(圖2)可知, BE-LAH中聚合度為3～12的寡糖豐度較高(二糖含量很低), 而聚合度為13～22的寡糖豐度較低, 這是由于寡糖分子量越大在質(zhì)譜中的離子化效率越低所致. 芐酯堿水解制備低分子肝素會(huì)生成1,6-脫水衍生物, 其含量的高低在一定程度上影響低分子肝素的抗凝血活性[20], 測(cè)定其含量通常需將ES樣品用肝素酶Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ徹底酶解再通過(guò)二糖組成分析測(cè)定[21], 分析方法繁瑣. 本文直接對(duì)寡糖進(jìn)行LC-MS分析, 計(jì)算可知BE-LAH中1,6-脫水衍生物所占的比例為16.52%, 符合美國(guó)USP第35版對(duì)ES中1,6-脫水衍生物的含量為15%～25%的規(guī)定. 此外, 質(zhì)譜分析結(jié)果還表明, BE-LAH中含有奇數(shù)和偶數(shù)寡糖, 而利用相同芐酯堿水解制備的高抗凝肝素寡糖則主要為偶數(shù)寡糖, 該現(xiàn)象與低抗凝肝素中的糖醛酸主要是艾杜糖醛酸(IdoA)而高抗凝肝素中主要是2-硫酸-艾杜糖醛酸(IdoA2S)且與硫酸化程度較高有關(guān)[22,23].

2.3 3-O-硫酸基四糖的含量分析

HP在肝素酶Ⅱ作用時(shí)會(huì)產(chǎn)生罕見(jiàn)的3-O-硫酸基四糖, 該四糖來(lái)自于肝素核心五糖. 研究表明, 3-O-硫酸基四糖的含量與其抗凝活性呈正相關(guān)[24]. 據(jù)文獻(xiàn)[22]報(bào)道, HP經(jīng)肝素酶Ⅱ徹底降解后產(chǎn)生4種主要的3-O-硫酸基四糖: △UA-GlcNAc-GlcA-GlcNS3S, △UA-GlcNAc6S-GlcA-GlcNS3S, △UA-GlcNAc6S-GlcA-GlcNS3S6S和△UA-GlcNS6S-GlcA-GlcNS3S6S. 依據(jù)該方法測(cè)定樣品中3-O-硫酸基四糖的含量, 數(shù)據(jù)列于表1. 可見(jiàn), 在BE-LAH和HS標(biāo)準(zhǔn)品中未檢測(cè)到3-O-硫酸基四糖, 而LAH含有0.57%的3-O-硫酸基四糖, 遠(yuǎn)低于ES(5.82%)與HP(6.20%), 說(shuō)明LAH抗凝活性低而B(niǎo)E-LAH無(wú)抗凝血活性.

Table 1 Compositional analysis of BE-LAH, LAH and standard HP, HS, ES*

2.4 BE-LAH的NMR解析

一維核磁共振波譜(圖3)顯示, BE-LAH和ES標(biāo)準(zhǔn)品有相似的波譜特征[25～28].δ5.55, 4.65, 4.35, 6.03, 5.17和5.81處分別為BE-LAH非還原端不飽和糖醛酸△UA2S的H1, H2, H3和H4信號(hào)及△UA的H1和H4信號(hào);δ5.28, 4.40, 4.27, 4.14, 4.83和5.07處分別為IdoA2S的H1, H2, H3, H4和H5及IdoA的H1信號(hào). 由1H NMR譜圖[圖3(A)]可見(jiàn), BE-LAH中△UA2S的信號(hào)明顯低于ES, 而△UA和IdoA的信號(hào)則高于ES, 表明BE-LAH中IdoA/IdoA2S比例高于ES. 約δ5.53處未檢測(cè)到ANS3S的H1信號(hào), 預(yù)示其無(wú)抗凝血活性[25].δ3.15和3.46處分別為還原端1,6-脫水衍生物1,6-an.A和1,6-an.M的H2信號(hào).13C NMR[圖3(B)]和1H-13C HSQC數(shù)據(jù)(圖4)進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論.

Fig.3 1H NMR(A), 13C NMR(B) of BE-LAH(a) and USP ES(b)

Fig.4 1H-13C HSQC spectrum of BE-LAH

2.5 活性評(píng)價(jià)

2.5.1 抗凝血活性評(píng)價(jià) 通過(guò)測(cè)定抗FXa或FⅡa的活力單位評(píng)價(jià)了LAH和BE-LAH的抗凝血活性, 結(jié)果列于表2. 可見(jiàn), BE-LAH的抗凝血活性與HS標(biāo)準(zhǔn)品相近, 無(wú)明顯的抗凝活性; 雖然LAH抗凝活性高于HS標(biāo)準(zhǔn)品, 但遠(yuǎn)低于ES和HP標(biāo)準(zhǔn)品. 抗凝活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與HILIC-FTMS測(cè)定的3-O-硫酸基四糖含量的結(jié)果一致, 表明LAH為一種新型的低抗凝肝素, 尤其經(jīng)過(guò)芐酯堿降解得到的BE-LAH幾乎無(wú)抗凝血活性, 這為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)低抗凝肝素的其它生物活性提供了結(jié)構(gòu)依據(jù).

2.5.2 免疫活性評(píng)價(jià) 采用中性紅法評(píng)價(jià)了樣品對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響, 結(jié)果如圖5(A)所示, 可見(jiàn)不同濃度的樣品對(duì)RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力均有一定的促進(jìn)作用, 且呈濃度依賴性. HP和LAH對(duì)RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力的促進(jìn)作用相對(duì)較強(qiáng), 在100 μg/mL時(shí)其促進(jìn)作用比空白分別提高了49%(P<0.01,n=3)和37%(P<0.01,n=3), 且呈現(xiàn)出促進(jìn)效果優(yōu)于LPS的趨勢(shì); BE-LAH在100 μg/mL時(shí)促進(jìn)作用比空白提高了33%(P<0.01,n=3), 且呈現(xiàn)出促進(jìn)效果優(yōu)于ES的趨勢(shì); HS的促進(jìn)作用相對(duì)較弱.

Table 2 Anti-Xa and anti-Ⅱa activities of samples

采用S0021試劑盒檢測(cè)樣品作用于RAW264.7細(xì)胞后NO釋放量的改變, 結(jié)果如圖5(B)所示, 可見(jiàn)陽(yáng)性對(duì)照LPS作用于細(xì)胞后NO釋放量為11.31 μmol/L, 空白對(duì)照為4.36 μmol/L. 不同濃度的樣品均能提高RAW264.7細(xì)胞的NO釋放量, 在中高劑量時(shí)(HS除外, 僅在較高濃度200 μg/mL時(shí))的促進(jìn)作用更加顯著(P<0.01,n=3); BE-LAH在50 μg/mL時(shí)NO的釋放量達(dá)6.86 μmol/L, 可顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞NO的釋放(P<0.05,n=3).

Fig.5 Effects of different doses of GAGs on the phagocytosis index(A) and NO release(B) of the mouse macrophage cell line RAW 264.7

3 結(jié) 論

以豬腸黏膜來(lái)源的低抗凝肝素為原料, 采用芐酯堿水解法制得聚合度分布于2～22之間, 平均分子量為5300的低抗凝肝素寡糖; 活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明, 其具有顯著的免疫增強(qiáng)活性, 但無(wú)明顯的抗凝血活性, 不會(huì)產(chǎn)生出血、 血小板減少等副作用, 具有良好的臨床應(yīng)用前景. 本文為天然來(lái)源的低抗凝肝素及其寡糖在免疫調(diào)節(jié)等方面的開(kāi)發(fā)利用提供了參考.

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(Ed.: P, H, V, K)

Preparation, Characterization and Immunological Activity Evaluation of Low Anticoagulant Heparin Oligosaccharides?

? Supported by the National Science and Technology Support Program of China(No.2013BAB01B02) and the National Natural Science Foundation of China-Shandong Joint Fund(No.U1406402).

ZHANG Xiao, SHAN Xindi, ZHAO Xiaoliang, LI Guoyun,WANG Xiaojiang, CAI Chao, HAO Jiejie, YU Guangli*

(ShandongProvincialKeyLaboratoryofGlycoscienceandGlycotechnology,KeyLaboratoryofMarineDrugs,MinistryofEducation,SchoolofMedicineandPharmacy,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China)

Anticoagulant activities limit applications of heparin and enoxaparin sodium in immune-promoting activity. A novel and natural low anticoagulant heparin(LAH) was purified from crude porcine intestinal. In this work, oligosaccharide of LAH(BE-LAH) was prepared by benzyl ester alkaline hydrolysis. The molecular distribution and chemical structure of BE-LAH were determined based on combination technologies including polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE), high performance gel permeation chromatography(HPGPC)-multi angel laser light scattering(MALLs), nuclear magnetic resonance(NMR) and liquid chromatography-mass spectrum(LC-MS). Meanwhile, the anticoagulant activities were evaluated by measuring the inhibitory activities on coagulation factor Xa(FXa) and thrombin(FⅡa), while the immunological activities were evaluated by its modulation effects on phagocytic ability and NO release of RAW 264.7 cells. The results demonstrated that BE-LAH was composed of fragments from dp2 to dp22 with an average molecular weight of 5300. Expectedly, BE-LAH showed no anticoagulant activity, but remarkable immune-promoting activity. A low anticoagulant heparin oligosaccharide was prepared and promised as an excellent immunoenhancer.

Low anticoagulant heparin oligosaccharide; Benzyl ester alkaline hydrolysis; Liquid chromatography-mass spectrum; Immune-promoting activity

2015-11-11.

日期: 2016-06-06.

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): 2013BAB01B02)和國(guó)家自然科學(xué)基金-山東省政府聯(lián)合基金(批準(zhǔn)號(hào): U1406402)資助.

10.7503/cjcu20150863

O629.1

A

聯(lián)系人簡(jiǎn)介: 于廣利, 男, 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要從事糖化學(xué)和糖藥物學(xué)研究. E-mail: glyu@ouc.edu.cn